《实验2凝集反应ELISA备课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验2凝集反应ELISA备课件（22页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1免 疫 学 实 验 课贵阳医学院免疫学教研室贵阳医学院免疫学教研室实验2凝集反应-ELISA备21、试管凝集反应（示教）2、ABO血型鉴定-玻片凝集反应（1份/1人）3、乙型肝炎病毒表面抗体检测-ELISA法(1份/1人）实 验 内 容实验2凝集反应-ELISA备3 实验二实验二 凝凝 集集 反反 应应（Agglutination）实验2凝集反应-ELISA备4 实验原理 颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应的抗体，颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应的抗体，或可溶性抗原或可溶性抗原/ /抗体吸附于与免疫无关的载体，形成抗体吸附于与免疫无关的载体，形成致敏颗粒，与相应抗体致敏颗粒，与相应抗体/ /抗
2、原在一定的条件下，形成抗原在一定的条件下，形成肉眼可见的凝集小块的反应，称为凝集反应。参与肉眼可见的凝集小块的反应，称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原（反应的抗原称凝集原（agglutinogenagglutinogen），），抗体称为抗体称为凝集素（凝集素（agglutininagglutinin）。）。实验2凝集反应-ELISA备5凝集反应类型n n直接凝集反应（直接凝集反应（direct agglutinationdirect agglutination） 颗粒性抗原与相应抗体直接结合，所出现的凝颗粒性抗原与相应抗体直接结合，所出现的凝集现象，包括试管凝集反应、玻片凝集反应。集现象，包
3、括试管凝集反应、玻片凝集反应。n n间接凝集反应间接凝集反应 （indirect agglutinationindirect agglutination） 将可溶性抗原（或抗体）吸附在与免疫无关的将可溶性抗原（或抗体）吸附在与免疫无关的载体颗粒表面，使此形成致敏颗粒，然后再与相应载体颗粒表面，使此形成致敏颗粒，然后再与相应抗体（或抗原）混合，在适当条件下，发生凝集现抗体（或抗原）混合，在适当条件下，发生凝集现象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。实验2凝集反应-ELISA备6实验2凝集反应-ELISA备7 操作步骤于试管架上列7支试管。 1.每管内分别加入生理
4、盐水0.5ml。 2.血清稀释：第一管加入1:10待检血清0.5ml，混匀 后取0.5ml，加入第二管内，依此类推，直到第6管， 混匀后从第6管中吸出0.5ml弃去；第7管为对照管。 0.0.5ml0.0.5ml0.0.5ml0.0.5ml0.0.5ml0.0.5ml（一）试 管 凝 集 反 应1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640实验2凝集反应-ELISA备8n3.每管加伤寒杆菌“H” 抗原0.5ml。n4.混匀，置 52水浴4h，取出后，置 室温过夜，次日读取凝集效价。实验2凝集反应-ELISA备9结 果 观 察 不同程度的凝集现象： ：液体澄清，细菌全部凝集（1
5、00%），沉于 管底形成大片凝集物。 ： 液体基本澄清，细菌大部分凝集（75%左右），管底的凝集物稍小。 ： 液体半澄清，稍显浑浊（凝集物50%左右），但仍可见明显凝集块。 ： 液体浑浊，无凝集块，轻摇试管，有细菌呈 线状浮起。 实验2凝集反应-ELISA备10效价：抗原抗体反应时，发生明显反应的最高血清稀释度，又称滴度。凝集效价：凝集反应时，能使50%或以上的抗原发生凝集的最高血清稀释度。 实验2凝集反应-ELISA备11（二）玻片凝集反应 已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻片上，在一定的条件下，若两者相对应，则会发生凝集。本方法主要用于抗原的定性分析，如菌种鉴定、ABO血型鉴定等。实验2
6、凝集反应-ELISA备ABO血型系统血型系统12实验2凝集反应-ELISA备13ABOABO血型鉴定步骤血型鉴定步骤n红细胞悬液的制备（用于血型鉴定及ELISA实验） 1. 取EP管1支，加入5滴生理盐水 2. 消毒耳垂或手指皮肤 3. 用采血针采1-2滴血，加入盛有生理盐水的EP管中混匀 4. 2000rpm，离心3min 5. 取红细胞悬液用于ABO血型鉴定6. 取已加有抗A血清与抗B血清载玻片1张，分别加入待测抗原各1滴，并用牙签混匀。7. 置室温5 分钟左右观察结果。 取上清用于ELISA实验实验2凝集反应-ELISA备ABO血型鉴定的判断血型鉴定的判断B型型抗抗A型标准血清型标准血清
7、抗抗B型标准血清型标准血清抗抗A型标准血清型标准血清抗抗B型标准血清型标准血清A型型抗抗A型标准血清型标准血清抗抗B型标准血清型标准血清O型型抗抗A型标准血清型标准血清抗抗B型标准血清型标准血清AB型型示示 意意 图图实验2凝集反应-ELISA备15注意事项注意事项n n用牙签研磨时，注意防止将抗A血清带到抗 B血清中，反之亦然。n n如果凝集现象不太明显时，可用显微镜观察。实验2凝集反应-ELISA备16免疫标记技术免疫标记技术 将已知抗体或抗原标记上易示踪物将已知抗体或抗原标记上易示踪物质（如酶、荧光素、放射性同位素、胶质（如酶、荧光素、放射性同位素、胶体金等），通过检测标记物来反映有无体
8、金等），通过检测标记物来反映有无抗原抗体反应，从而测出微量的抗原或抗原抗体反应，从而测出微量的抗原或抗体。抗体。实验2凝集反应-ELISA备17实验五实验五 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbsent Enzyme Linked Immunosorbsent Assay,ELISAAssay,ELISA）【原理原理】 利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底
9、物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅根据颜色的深浅, ,可以判断待检物中有无特异可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。 实验2凝集反应-ELISA备18直接直接ELISA包被包被(未知抗原未知抗原） 加入酶标抗体加入酶标抗体 洗板洗板 加底物加底物 加终止液加终止液包被包被(已知抗原）已知抗原）加入待检标本加入待检标本（未知抗体）（未知抗体）加入酶标第二抗体加入酶标第二抗体 抗抗体抗抗体 洗板洗板 加底物
10、加底物 加终止液加终止液间接间接ELISA双抗体夹心法双抗体夹心法包被包被(已知抗体）已知抗体）加入待检标本加入待检标本（未知抗原）（未知抗原） 加入酶标抗体加入酶标抗体 洗板洗板 加底物加底物 加终止液加终止液实验2凝集反应-ELISA备19乙型肝炎病毒表面抗体的检测乙型肝炎病毒表面抗体的检测 间接间接ELISA法法【测定原理测定原理】 采用纯化采用纯化HBsAgHBsAg包被反应板，加入待检标本，当包被反应板，加入待检标本，当标本中存在抗标本中存在抗- HBs- HBs时，该抗体与包被时，该抗体与包被HBsAgHBsAg结合，结合，再加入酶标羊抗人再加入酶标羊抗人IgGIgG抗体。最后形成
11、抗体。最后形成HBsAg-HBsAg-抗抗HBs-HBs-酶标抗抗体复合物，加入底物产生显色反应。酶标抗抗体复合物，加入底物产生显色反应。实验2凝集反应-ELISA备20无菌采血，离心无菌采血，离心2000rpm,3min2000rpm,3min，取上清作为待测标本，取上清作为待测标本( (见玻片凝集实验见玻片凝集实验) )每孔加入酶结合物每孔加入酶结合物1 1滴，滴，3737孵育孵育30min30min反应板中各加入待测标本反应板中各加入待测标本1 1滴，同时设阴性、阳性、空白对照孔滴，同时设阴性、阳性、空白对照孔(NS)(NS)（反应板已用纯化反应板已用纯化HBsAgHBsAg包被包被包被包被 ） 手工洗板，弃液拍干，重复手工洗板，弃液拍干，重复5 5次次 每孔加入显色剂每孔加入显色剂A A液、液、B B液各液各1 1滴，置滴，置3737孵育孵育1515分钟分钟 每孔加入终止液每孔加入终止液1 1滴，混匀滴，混匀 目测法：与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅判断结果目测法：与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅判断结果【步步骤骤】实验2凝集反应-ELISA备21实验2凝集反应-ELISA备实验报告实验报告n玻片凝集反应-ABO血型鉴定n酶联免疫吸附试验间接法（间接ELISA）实验2凝集反应-ELISA备
