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1、抗肿瘤药物评价技术Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望抗肿瘤药物药效学指导原则抗肿瘤药物药效学指导原则细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则技术指导原则化学药物一般药理学研究技术指导原则化学药物一般药理学研究技术指导原则中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则指导原则指导原则 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至 少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人
2、癌小鼠模型。少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。 试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效 体外实验选用体外实验选用10-15株人癌细胞株株人癌细胞株 ，至少重复一次，至少重复一次23抗肿瘤药物药效学研究的要求抗肿瘤药物药效学研究的要求 体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主1南京凯基生物科技发展公司联系电话：025-52880811 025-52880812体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验 对候选化合物进行初步筛选对候选化合物进行初步筛选了解候选化合物的抗瘤谱了解候选化合物的抗瘤谱为随后进
3、行的体内抗肿瘤试验提供参考为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考试验目的目的体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验方法方法选用选用10-1510-15株人癌细胞株株人癌细胞株试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响响 使用使用MTTMTT还原法、磺酰罗丹明还原法、磺酰罗丹明B(SRB)B(SRB)染色法染色法药物与细胞共培养时间一般为药物与细胞共培养时间一般为48-72 48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁小时，贴壁细胞需先贴壁24 24 小时后再给药。小时后再给药。试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标
4、准抗试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药。肿瘤药。试验至少应重复一次试验至少应重复一次 四氮唑盐还原法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理：试验原理：试验原理：试验原理：四氮唑四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromidetetrazolium bromide是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADPNADP相关的脱氢酶在细胞内可
5、将黄色的相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTTMTT转化成不溶性的蓝紫色的甲转化成不溶性的蓝紫色的甲 月替月替 (formazan)(formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)(DMSO)溶解甲溶解甲 月替月替 后，后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。 方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT5mg/ml MTT液液2020微升微升/ /孔，继孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上
6、于续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于490nm490nm波长处检测波长处检测ODOD值。值。 观测指标观测指标观测指标观测指标 直接指标为直接指标为9696孔板上各被测孔的孔板上各被测孔的ODOD值；然后按公式（对照组值；然后按公式（对照组ODOD值值- -治疗组治疗组ODOD值）值）/ /对照组对照组ODOD值值100%100%计算出相应的细胞生长抑制率；剧情计算出相应的细胞生长抑制率；剧情况可进一步采用况可进一步采用LogitLogit法计算法计算50%50%生长抑制浓度生长抑制浓度IC50IC50值。值。 磺酰罗丹明染色法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理试验原理
7、试验原理试验原理：SRB(sulforhodamine SRB(sulforhodamine 是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。水。 SRB SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515 nm515 nm波长的波长的ODOD读数读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTTMTT法的一个缺点是法的一个缺点是ODOD值可随放置时间而变，而值可随放置时间而变，而SRBSRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。试验
8、。 方法要点方法要点方法要点方法要点： 用用10%10%冷三氯乙酸与冷三氯乙酸与4 4固定已经受试样品处理的细胞固定已经受试样品处理的细胞1h1h，洗涤，洗涤，干燥；加入干燥；加入4mg/ml SRB4mg/ml SRB液液100100微升微升/ /孔孔 染色染色15min15min，1%1%冰醋酸洗涤，干燥；冰醋酸洗涤，干燥；最后加入最后加入150150微升微升/ /孔孔 的的TrisTris溶液，在酶标仪上与溶液，在酶标仪上与515nm515nm波长处检测波长处检测ODOD值。值。观测指标观测指标观测指标观测指标 同同MTTMTT法。另外，法。另外，NCINCI目前采用以下指标评价化合物的
9、体外抗肿目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤活性。测定的瘤活性。测定的ODOD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的值包括对照组、加药组及加药时的细胞的ODOD值值C C、T T、和和T0T0。据此计算：。据此计算： 生长抑制率（生长抑制率（%）= =（T TT0T0）/ /（CT0CT0）100% 100% ； 按生长抑制率按生长抑制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出IC50IC50 染料排斥法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理试验原理试验原理试验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死：活细胞有
10、排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。方法要点方法要点方法要点方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是0.4%0.4%台盼蓝液，混匀，室温染色台盼蓝液，混匀，室温染色5-15min5-15min，将已染色的细胞悬液滴加至血细，将已染色的细
11、胞悬液滴加至血细胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。观测指标观测指标观测指标观测指标：按（未染色细胞数：按（未染色细胞数/ /细胞总数）细胞总数）X100%X100%计算活细胞率，对照组活计算活细胞率，对照组活细胞率应在细胞率应在90%90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（LD50LD50）作为药物抗肿瘤活性的指标。）作为药物抗肿瘤活性的指标。 阿拉马蓝法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理试验原理试验原理试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内：非荧光性蓝
12、色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的的NADPHNADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm530nm和和590nm590nm处读处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。方法要点方法要点方法要点方法要点：细胞经受试样品处理后，加入：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul10-20ul阿拉马蓝染液，阿拉马蓝染液，继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分继续培养一定时间，用微培养板自动读数
13、仪在激发与发射波长分别为别为530nm530nm和和590nm590nm处读取荧光强度值。处读取荧光强度值。观测指标观测指标观测指标观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算一步计算IC50IC50值。值。 集落形成法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理试验原理试验原理试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6 6代或代或6 6代以上时，代以上时，其后代所组成的群体其后代所组成的群体( (集落集落) )便含便含5050个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细个以上细
14、胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。方法要点方法要点方法要点方法要点：将浓度为：将浓度为500500个细胞个细胞/ml/ml的对数生长期细胞悬液的对数生长期细胞悬液2ml2ml种至种至35ml35ml的培的培养皿，并加受试样品适量，培养养皿，并加受试样品适量，培养7d7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数含计数含5050细胞以上的集落。细胞以上的集落。
15、观测指标观测指标观测指标观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%40%，再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用LogitLogit法计算受试样法计算受试样品的品的IC50IC50值。值。 集落形成率集落形成率= =集落数集落数/ /细胞接种数细胞接种数X100%X100% 集落形成抑制率集落形成抑制率= =（1-1-用药组集落形成率）用药组集落形成率）/ /对照组集落形成率对照组集落形成率X100%X100% 生长曲线测定法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性
16、试验试验原理试验原理试验原理试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来映出来 。方法要点方法要点方法要点方法要点：
17、将浓度为将浓度为1000010000个细胞个细胞/ml/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml5ml种至种至25ml25ml的培养瓶，或按每孔的培养瓶，或按每孔100100微升种至微升种至9696孔板，并加受试样品适量，培养后孔板，并加受试样品适量，培养后分别于即刻和分别于即刻和1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6、7d7d进行检测。前者可采用台盼蓝染色计进行检测。前者可采用台盼蓝染色计数活细胞，后者可采用数活细胞，后者可采用MTTMTT法或法或SRBSRB法读取法读取ODOD值，并据此进行作图与计算。值，并据此进行作图与计算。 观测指标观测指标观测指标观测指
18、标 1 1、倍增时间、倍增时间(TD),(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出将实际生在曲线进行直线回归求出0 0和和t t时刻的时刻的理论细胞数理论细胞数N0N0和和N tN t，据此计算：，据此计算：TD=0.301t/TD=0.301t/（log N tlog N0log N tlog N0）；）；2 2 增殖细增殖细胞杀伤率（胞杀伤率（%）=( N0N0)/ N0100%=( N0N0)/ N0100%；3 3 细胞生长饱和密度（细胞生长饱和密度（N sN s），代表），代表高坪期每毫升细胞数的均数。高坪期每毫升细胞数的均数。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验白血病（白血病（6株）
19、：株）：CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR肺癌（肺癌（9株）：株）：A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322、 MNCI-H460、NCI-H522乳腺癌：乳腺癌：BT-549、HS578T、MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、ATCC、 MDA-MB-435、MDA-N、T-47D卵巢癌：卵巢癌：IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3肾癌：肾癌：786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF-393、SN12C、T
20、K-10、UO-31前列腺癌：前列腺癌：DU-145、PC-3中枢神经系统肿瘤：中枢神经系统肿瘤：SF-268 、SF-295 、SF-539、 SFB-19 、SFB-75、U251黑色素瘤：黑色素瘤：M14、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、 UACC-257、LOCIMV美国美国NCI抗肿瘤药物体外筛选使用的抗肿瘤药物体外筛选使用的60种人类细胞种人类细胞体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验瘤谱细胞株结合我国瘤谱细胞株结合我国实际情况实际情况呼吸系统、消化系统、呼吸系统、消化系统、血液系统、妇科肿瘤血液系统、妇科肿瘤选用人正常细胞株
21、选用人正常细胞株初步确定受试样品对初步确定受试样品对正常组织和肿瘤组织正常组织和肿瘤组织的选择性的选择性选用耐药细胞株选用耐药细胞株考察受试样品的抗耐考察受试样品的抗耐药作用药作用国内国内体外体外筛选筛选的细的细胞株胞株选择选择选用人血管内皮细胞选用人血管内皮细胞株进行同步考察株进行同步考察细胞株有相当一部分细胞株有相当一部分是国内自己建株是国内自己建株胃癌、肝癌胃癌、肝癌体外初筛经典三株细胞体外初筛经典三株细胞A549HepG-2HCT-116兼顾选择使用动物（小鼠）肿瘤与人的肿瘤细胞；兼顾选择使用动物（小鼠）肿瘤与人的肿瘤细胞；筛选实验以快速生长的细胞为主；筛选实验以快速生长的细胞为主；兼
22、顾选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞兼顾选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞样品初筛时应该注意三点样品初筛时应该注意三点体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验对于化学合成物或天然产物的提对于化学合成物或天然产物的提对于化学合成物或天然产物的提对于化学合成物或天然产物的提取物初筛时可以选择取物初筛时可以选择取物初筛时可以选择取物初筛时可以选择100100、1010、1 1 g/mLg/mL三个浓度进行初步筛选三个浓度进行初步筛选三个浓度进行初步筛选三个浓度进行初步筛选测定测定测定测定IC50IC50时，至少应该设置时，至少应该设置时，至少应该设置时，至少应该设置5 5个个个个浓度，浓度间隔可采用等比
23、间隔，浓度，浓度间隔可采用等比间隔，浓度，浓度间隔可采用等比间隔，浓度，浓度间隔可采用等比间隔，例如：例如：例如：例如：1 1、2 2、4 4、8 8、1616或或或或0.010.01、0.10.1、1 1、1010、100100。美国美国美国美国NCINCI现用的浓度为现用的浓度为现用的浓度为现用的浓度为10-410-4、10-510-5、10-610-6、10-710-7、10-8mol/L10-8mol/L。 凯基现用的浓度为凯基现用的浓度为1、2、4、8、16、32、64、128、256、药物与细胞共培养时间一药物与细胞共培养时间一般为般为48-72 小时，贴壁细胞小时，贴壁细胞需先贴
24、壁需先贴壁24 小时后再给药。小时后再给药。样品与细胞作用时间样品与细胞作用时间待筛样品的浓度待筛样品的浓度体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验评价标准评价标准以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线采用曲线采用Logit法计算半数有效浓度法计算半数有效浓度(IC50值或值或EC50值值)合成化合物或植物提取纯品的合成化合物或植物提取纯品的IC5010 gm1或植物粗提或植物粗提物的物的IC5020 gm1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。杀伤作用。体外试验至少重复一次体外试验至少重复一
25、次体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验体外筛选其他方法：体外筛选其他方法：MTS法、刃天青法法、刃天青法以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法 溶媒对照组与阴性对照组比较，溶媒对照组与阴性对照组比较，OD值应在值应在5%，且无统计学差异，且无统计学差异应考虑到受试物在水溶液中的稳定性，比如环磷酰胺在水溶液中的半衰应考虑到受试物在水溶液中的稳定性，比如环磷酰胺在水溶液中的半衰 期为期为3h脂溶性的受试物常用脂溶性的受试物常用DMSO助溶，但助溶，但DMSO终浓度不低于终浓度不低于0.1%测出的测出的OD值有事会出现假阴性（加值有事会出现假
26、阴性（加MTT等染色剂时更换培养基）等染色剂时更换培养基）注意事项注意事项体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验举例例HepG-2 72hGroupMeanSDInhibitive RateNegative Control 0.9550.010Positive Control 0.9520.0100.29%Solvent Control 0.1650.00782.74%化合物XXXIC50=22.588uM100M0.0510.00594.66%80M0.1010.00989.47%60M0.1520.00884.08%40M0.2850.00470.16%20M0.6620.01330.72%
27、10M0.7660.02019.81%5M0.8470.01111.31%2.5M0.9180.0103.92%1.25M0.9400.0101.59%表表 化合物化合物XXX对人肝癌细胞对人肝癌细胞HepG-2体外增殖的影响体外增殖的影响体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验优点操作简单操作简单 用药量少用药量少取材可直接用于人体肿瘤取材可直接用于人体肿瘤得出结果快速得出结果快速缺点细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故假阳性率高假阳性率高假阳性率高假阳性率高非直接
28、对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞体内抗肿瘤试验结果是评价候选化合物有效性的最重要指标体内抗肿瘤试验结果是评价候选化合物有效性的最重要指标体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型
29、。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性均为有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。肿瘤具有治疗作用。通常情况下，以人癌异体移植模型试验结果来评价细胞毒类抗通常情况下，以人癌异体移植模型试验结果来评价细胞毒类抗肿瘤药物的有效性。肿瘤药物的有效性。体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验小鼠肿瘤模型小鼠肿瘤模型大鼠肿瘤模型大鼠肿瘤模型人源异种移植肿瘤模型人源异种移植肿瘤模型自发性肿瘤自发性肿瘤自发性肿瘤自发性肿瘤诱发的肿瘤诱发的肿瘤诱发的肿瘤诱发的肿瘤移植性肿瘤移植性肿瘤移植性肿瘤移植性肿瘤 （a a）皮
30、下肿瘤模型）皮下肿瘤模型）皮下肿瘤模型）皮下肿瘤模型 （b b）腹水瘤模型）腹水瘤模型）腹水瘤模型）腹水瘤模型 （c c）原位接种模型）原位接种模型）原位接种模型）原位接种模型动物模型动物模型实验动物物体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验动物要求健康，符合等级动物要求，三证动物要求健康，符合等级动物要求，三证 裸鼠：裸鼠：SPF级，小鼠：清洁级、级，小鼠：清洁级、SPF级级 实验动物质量合格证实验动物质量合格证 实验动物生产许可证实验动物生产许可证 实验动物使用许可证实验动物使用许可证雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同 妇科肿瘤使用雌性小鼠、前列腺
31、癌等使用雄性小鼠妇科肿瘤使用雌性小鼠、前列腺癌等使用雄性小鼠小鼠鼠龄为小鼠鼠龄为5-6周，体重为周，体重为18-22克克 裸鼠裸鼠6周龄以后，会产生体液免疫、周龄以后，会产生体液免疫、NK细胞、细胞、B淋巴细胞免疫，成瘤率会下降淋巴细胞免疫，成瘤率会下降 同批动物体重相差不超过同批动物体重相差不超过20%评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验肿瘤瘤株瘤瘤株用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。 模模型建立和使用应注意
32、：型建立和使用应注意：(1) 移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。(2) 移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。(3) 对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型(4) 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于 15-20代 呼吸系统肿瘤小鼠肺癌 Lewis妇科肿瘤小鼠乳腺癌 4T1人肺癌 NCI-H460小鼠宫颈癌 U14人肺腺癌 A549人乳腺癌 MDA-MB-435消化系统肿瘤小鼠胃癌 MFC人乳腺癌 MDA-MB-231人胃癌 BGC-803人乳腺癌 MX-1人胃癌 HGC-27人乳腺癌 BCaP-37人低分
33、化胃癌 BGC-823人宫颈癌 SiHa人低分化胃癌 MGC-803人宫颈癌 Hela人低分化胃癌 MKN-45人卵巢癌 A2780人中分化胃癌 SGC-7901人卵巢癌 SK-OV-3人高分化胃癌 MKN-28生殖系统肿瘤人肾癌 Ketr-3小鼠肝癌 H22人膀胱癌 EJ人肝癌 QGY-7701人膀胱癌 T24人肝癌 SMMC-7721人前列腺癌 PC-3人肝癌 Bel-7402人前列腺癌 PC-3M人肝细胞性肝癌 IM3白血病人白血病 HL-60人肝癌 HepG-2人白血病 K562人结肠癌 Ls-174-T人耐阿霉素白血病 K562/Adr人结肠癌 CL187皮肤肿瘤小鼠黑色素瘤 B16
34、F1人结肠癌 HCT-116小鼠黑色素瘤 B16F10人结肠癌 SW1116小鼠黑色素瘤 B16BL6人结肠癌 HT-29人黑色素瘤 A375人胰腺癌 BxPC-3人黑色素瘤 M14头颈部肿瘤人喉表皮癌 Hep-2其它肿瘤小鼠肉瘤 S180人舌鳞癌 Tca-113小鼠艾氏腹水瘤 EAC体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验小鼠肿瘤模型小鼠肿瘤模型优点：潜伏期短、移植瘤成活率高、生长均匀、无自发缓解、试验优点：潜伏期短、移植瘤成活率高、生长均匀、无自发缓解、试验周期短、费用低周期短、费用低缺点：动物肿瘤在生物学和遗传学上与临床不一致，在药物敏感性缺点：动物肿瘤在生物学和遗传学上与临床不一致，在药物
35、敏感性方面与人体肿瘤方面与人体肿瘤 不一致不一致仅可用于候选化合物的初步筛选仅可用于候选化合物的初步筛选常用小鼠肿瘤常用小鼠肿瘤H22、S180、Lewis人癌裸鼠异种移植肿瘤模型人癌裸鼠异种移植肿瘤模型优点：实验结果与临床较符合、优点：实验结果与临床较符合、可用于研究获得性药物抗性可用于研究获得性药物抗性缺点：饲养条件要求高、接种成活率低、移植瘤个体差异大、缺点：饲养条件要求高、接种成活率低、移植瘤个体差异大、部分模型部分模型 很难构建、生存时间不适合作为试验终点很难构建、生存时间不适合作为试验终点人癌裸鼠皮下移植瘤操作简单、易于观察与结果判定，但皮下移植瘤缺人癌裸鼠皮下移植瘤操作简单、易于
36、观察与结果判定，但皮下移植瘤缺乏肿瘤最典型的特性乏肿瘤最典型的特性- -转移，是现在评价抗肿瘤药物活性的主要模型转移，是现在评价抗肿瘤药物活性的主要模型体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量酸小量酸(0.1-0.5N HCl)或碱或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，调节溶解，调节pH在在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或助溶的药物，或用吐温用吐温60、吐
37、温、吐温80、2-3%淀粉、淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射药物配制药物配制体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验试验设模型对照组、阳性对照组、治疗组。试验设模型对照组、阳性对照组、治疗组。治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植后次日将动物随机分组
38、，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至瘤直径，待肿瘤生长至100300mm3后将动物随机分组。后将动物随机分组。动物数普通小鼠每组动物数普通小鼠每组10只，裸鼠只，裸鼠6只。只。组别设置组别设置试验设计试验设计体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置设置如何确定试验剂量如何确定试验剂量临床等效剂量（根据体表面积换算）临床等效剂量（根据体表面积换算）根据半数致死量（根据半数致死量（1/10-1/20预摸）或者高剂量使用最大耐受量或预摸）或者高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量的剂量根据文献估计剂量根据文
39、献估计剂量剂量设置剂量设置试验设计试验设计体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验模型对照组给予相应的溶剂；模型对照组给予相应的溶剂；阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物（阳性组阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物（阳性组必须作出阳性结果，否则有理由怀疑筛选方法和指标的可信度）必须作出阳性结果，否则有理由怀疑筛选方法和指标的可信度）如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳性对照药作为阳性对照药原型剂对照原型剂对照阳性对照药选择原则阳性对照药选择原则 疗效确切与被试物质化学结构类似；与被试物
40、质有类似的作用机理 对照组设置对照组设置试验设计试验设计体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。给药方案。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。的。可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。可采取瘤周、瘤内、肌
41、肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。给药方案和给药途径给药方案和给药途径试验设计试验设计腹水瘤模型腹水瘤模型接种给药后，观察和记录动物接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数。死亡时间，计算生存天数。如阴性对照组如阴性对照组20%动物存活动物存活时间超过时间超过4周，表明腹水瘤生周，表明腹水瘤生长不良，实验作废长不良，实验作废。裸鼠移植瘤模型裸鼠移植瘤模型推荐使用测量瘤径的方法，动推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物抗肿瘤的效应。态观察受试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数根据移植肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般
42、为瘤的生长情况而定，一般为每周每周2-3次次,每次测量同时还每次测量同时还需称鼠重需称鼠重。免疫缺陷小鼠皮下移植的肿瘤很少发生转移，多数死于原发肿免疫缺陷小鼠皮下移植的肿瘤很少发生转移，多数死于原发肿瘤。而临床肿瘤病人大多死于肿瘤转移，动物和临床肿瘤病人瘤。而临床肿瘤病人大多死于肿瘤转移，动物和临床肿瘤病人的死亡原因不同。因此，对于人癌异体移植试验，生命延长率的死亡原因不同。因此，对于人癌异体移植试验，生命延长率并不是理想的观测指标。并不是理想的观测指标。体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验裸鼠皮下移植瘤模型裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤体积肿瘤体积(tumor v
43、olume,TV)的计算公式为：的计算公式为：V = 1/2ab2 或或/6abc其中其中a、b、c分别表示长宽高。两公式的相关性极好，可采用任一公式。分别表示长宽高。两公式的相关性极好，可采用任一公式。根据测量结果计算出相对肿瘤体积（根据测量结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），）， RTV = Vt / V0。其中其中V0为分笼给药时为分笼给药时(即即d0)测量所得肿瘤体积，测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%） TRTVT/C % =
44、100% CRTVTRTV：治疗组：治疗组RTV ；CRTV：阴性对照组：阴性对照组RTV。疗效评价标准：疗效评价标准：T/C % 60 %为无效；为无效；T/C % 60%，并经统计学处理，并经统计学处理P0.05为为有效有效评价标准评价标准评价标准评价标准体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验原位接种模型原位接种模型小鼠肿瘤模型小鼠肿瘤模型生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤径的评价方法。径的评价方法。生长较快小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。试验生长较快小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。试验结束后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤结束后处死
45、动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克，或克，或20%肿肿瘤重量小于瘤重量小于400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。废。 给药组平均瘤重给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重阴性对照组平均瘤重肿瘤生长抑制率肿瘤生长抑制率 = 100% 阴性对照组平均瘤重阴性对照组平均瘤重 评价标准评价标准 肿瘤生长抑制率肿瘤生长抑制率40%为无效；肿瘤生长抑制率为无效；肿瘤生长抑制率40%，并经统计学处理，并经统计学处理P0.05为有效为有效 不同原位接种模型可采用不同评价方法，不同原位接种模型可采用不同评价方法，主要有瘤重和生存时间评价法。如肝原主要有瘤重和生存时间评价法。如肝原位接种可用瘤重评价，颅内接种可用生位接种可用瘤重评价，颅内接种可用生存时间评价。评价方法、标准和注意事存时间评价。评价方法、标准和注意事项同腹水瘤模型和小鼠肿瘤模型。项同腹水瘤模型和小鼠肿瘤模型。评价标准评价标准评价标准评价标准 南京凯基生物科技发展公司联系电话：025-52880811 025-52880812
