荧光分光光度计的应用剖析课件

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1、荧光分光光度计的应用一、一、 荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计既可用于定量分析，荧光分光光度计既可用于定量分析，也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。第一单色器选择激发光波长（第一单色器选择激发光波长（250nm250nm的紫外光），故称为激发单色的紫外光），故称为激发单色器。第二单色器（荧光单色器）与器。第二单色器（荧光单色器）与激发光入射方向垂直，并选择荧光激发光入射方向垂直，并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确波长，可提高方法的选择性和准确度。度。 荧光分光光度法直接测定天然水中的酚实验部分实验部分1.仪器和主要试剂仪器和主要试剂日立日立 F一一3

2、000荧光分光光度计、标准酚溶液、荧光分光光度计、标准酚溶液、0.200mol/L KH2PO40.275mol/L KHPO4缓冲溶液、饱和缓冲溶液、饱和Na2C2O4溶液溶液.2.实验方法实验方法3.结果与讨论结果与讨论3.2 Na2C2O4的用量的用量天然水中含天然水中含Ca2+，Mg2+较多，特别是海水，加入缓冲溶液会出现白色浑浊，使回收率较多，特别是海水，加入缓冲溶液会出现白色浑浊，使回收率偏低，加入偏低，加入1-2滴滴Na2C2O4可消除浑浊可消除浑浊.（见表（见表1）3.4 荧光强度的稳定性荧光强度的稳定性取酚标准溶液及空白溶液，依实验方法进行荧光强度稳定性试验。测取酚标准溶液及

3、空白溶液，依实验方法进行荧光强度稳定性试验。测 定了定了2.5小小 时内荧光时内荧光 强度变化情况，发现荧光强度在强度变化情况，发现荧光强度在 1小时内基本不变。小时内基本不变。3.5 样品分析样品分析 用流动注射在线富集分离荧光分光光度计测定垃圾渗 出液中的苯胺实验部分实验部分1.1 仪器和主要试剂仪器和主要试剂（1）流动注射仪）流动注射仪, 自装配自装配, 附具有富集作用的自填装微型柱附具有富集作用的自填装微型柱; 荧光分光光度计荧光分光光度计 R F- 540( 日本岛津公司日本岛津公司) , 附有自行研制的流通管附有自行研制的流通管;721 可见分光光度计可见分光光度计( 上海第三分析

4、仪器厂上海第三分析仪器厂) 。（2）苯胺标准贮备液）苯胺标准贮备液( 10 g/ L) : 称取称取 2. 500 g 新蒸馏的无色分析纯苯胺新蒸馏的无色分析纯苯胺, 用用 25 mL 的的 1 mo L/ L 盐酸溶解后盐酸溶解后, 移至移至 250 mL 容量瓶中容量瓶中, 用蒸馏水稀释至刻用蒸馏水稀释至刻度度, 置于冰箱中保存。置于冰箱中保存。（3）苯胺工作溶液）苯胺工作溶液( 10 mg/ L) : 用移液管移取用移液管移取 1. 0 mL 的的 10 g/ L 苯胺标准贮备液于苯胺标准贮备液于 1 000 mL 容量瓶中容量瓶中, 用蒸馏水稀释至刻度用蒸馏水稀释至刻度, 使用时配制。

5、盐酸溶液使用时配制。盐酸溶液(0.5mol/L);NH3H20-NH4Cl(0.5mol/L);NH3H20-NH4Cl缓冲溶缓冲溶液液( pH= 10) 。1.2 实验方法实验方法流动注射仪附填装有阳离子型大孔吸附树脂的微型柱流动注射仪附填装有阳离子型大孔吸附树脂的微型柱, 流动注射分析过程由时序电路控制流动注射分析过程由时序电路控制, 分为再生、分为再生、进样、冲洗、洗脱进样、冲洗、洗脱 4 步步, 图图 1 是流动注射分析的流程图是流动注射分析的流程图, 旋转阀有旋转阀有 2 个工作状态个工作状态, 图中所示为图中所示为 A 状态状态, 箭箭头所示为头所示为 B 状态。状态。 各步的阀位

6、置为各步的阀位置为: 再生再生 V 1 ( A) 、V 2( A ) , 进样进样 V 1 ( B) 、 V 2 ( A) , 冲洗冲洗 V 1 ( A) 、 V 2 ( A) , 洗脱洗脱V 1 ( B) 、V 2 ( B) 。首先用盐酸溶液再生树脂; 然后进样, 在 p H 3 的条件下, 苯胺主要以C6 H5 N H3+正离子形态存在, 被树脂吸附; 然后快速冲洗掉树脂颗粒间的残留样品; 最后进行洗脱, 在 p H = 10 的条件下, 苯胺主要以 C 6H5N H2 分子形态存在, 吸附的C6 H5 N H3+转变为C 6H 5 N H 2 后被洗脱至荧光分光光度计内的流通管中, 用时

7、间扫描动态检测洗脱液荧光强度。1.3结果与讨论3.1 工作曲线 用移液管分别取 0. 0、 0. 5、0. 6、0 . 7、0. 8、0. 9、1. 0、2. 0、3 . 0、4. 0、5. 0 、6. 0 m L 10. 0 mg/ L 的苯胺标准溶液于一组 100 mL 容量瓶中, 定容后配制成含苯胺分别为 0. 00、0. 05 、0. 06、 0. 07、0. 08、 0. 09、0 . 10、0. 20、0. 30、 0. 40、0. 50 、0. 60 mg/ L 的标准溶液, 按上述实验条件动态检测荧光强度, 绘制荧光强度和质量浓度的工作曲线为: F = 48. 9C+ 15.

8、2, r = 0. 999 9。 线性范围为 0. 070. 50 mg/ L 。3.2干扰在上述实验条件下研究了 3 m g / L 的苯酚、 联苯胺、2, 4- 二硝基苯胺、 对氨基苯甲酸、二苯胺等对 0. 30 mg/ L 的苯胺的干扰情况。 结果表明: ( 1) 酚类物质、 联苯胺、 2, 4 - 二硝基苯胺、 二苯胺等胺类物质不干扰苯胺的测定, 这主要是因为它们不能以正离子的形态被树脂吸附; ( 2) 对氨基苯甲酸等也不干扰苯胺的测定。3.3水样的测定及显著性检验将此法应用于垃圾渗出液的测定。 取垃圾渗出液蒸馏, 得到1 L 蒸馏液, 然后用本法直接进样分析, 结果见表 1。 表 1

9、 同时给出了对蒸馏液进行萃取后用 HPL C 测定的结果及 t 检验的结果。可以看出, 在 95% 的置信水平下, 两种方法没有显著性差异, 结果令人满意。 2.4 回收率实验取 1 L 垃圾渗出液蒸馏, 向蒸馏液中分别加入含苯胺 0. 100、0. 200 mg 的标准溶液, 然后用蒸馏水稀释至2 L 后直接进样分析, 结果见表1。可以看出, 本法的回收率在 96% 104 % 之间。图 2 b、 c 是垃圾渗出液的加标回收荧光光谱。2.5流动注射- 荧光分光光度计联用的检测性能 荧光分光光度计法测定腊肉中维生素C1 实验部分实验部分1.1仪器与试剂仪器与试剂 荧光分光光度计荧光分光光度计F

10、7000 ( 日立公司日立公司) ；DHG9241A恒温培养箱；抗坏血酸、恒温培养箱；抗坏血酸、偏磷酸偏磷酸 、乙酸钠、乙酸钠 、硫脲、硫脲 、硼酸、硼酸; 2，6 二氯靛酚、盐酸邻苯二胺。二氯靛酚、盐酸邻苯二胺。1.2实验方法实验方法1.2.1样品前处理样品前处理精确称取匀浆后的腊肉精确称取匀浆后的腊肉25g置于烧杯中，加入置于烧杯中，加入20mL50g/ l偏磷酸，超声偏磷酸，超声20min后，过后，过滤至滤至100mL棕色容量瓶中，用棕色容量瓶中，用50g/ L偏磷酸定容吸取滤液偏磷酸定容吸取滤液1.00mL于试管中于试管中,加入加入0.1ml2g/l二氯靛酚二氯靛酚( 使使VC氧化成脱

11、氢氧化成脱氢VC) ，混匀，混匀( 此时溶液呈微红色此时溶液呈微红色) 再加入再加入0.10ml 30g/ l硫脲摇匀，使红色褪去硫脲摇匀，使红色褪去( 还原过量的二氯靛酚还原过量的二氯靛酚).向试管中加入向试管中加入1.00mL3%硼酸硼酸50%乙酸乙酸钠钠摇匀摇匀,室温下静置室温下静置15min 在暗室中迅速向试管中加入在暗室中迅速向试管中加入5.00mL0.2g/ l盐酸邻苯二胺，摇匀盐酸邻苯二胺，摇匀,在室温下反应在室温下反应30min 同时做试剂空白同时做试剂空白.1.2.2抗坏血酸标准溶液准确称取60真空干燥2h的0.0500g抗坏血酸，用50g/L偏磷酸溶解并定至50mL棕色容量

12、瓶中，即为1mg /L的抗坏血酸标准储备液.用偏磷酸逐级稀释，配置成0 0.2 1 5 10 20mg /L标准溶液，其余步骤同样品前处理.1.2.3荧光光度计参数条件测量模式: 光度测量法，激发波长350nm，发射波长430nm，积分时间0.1s，延迟时间按0.1s，激发波长狭缝宽度5.0nm，发射波长狭缝宽度5.0nm，光电倍增管电压250V.2 结果与讨论2.1 方法的检出限 标准曲线和相关系数连续11次进空白样品，根据3倍标准偏差计算得出本方法VC检出限为0.95mg/kg 回归方程为Y=0.0073X0.029，相关系数为0.9996。可见本方法检出限较低，在测量浓度020mg /L

13、范围内线性良好。2.2样品的测定及回收率按本方法测定腊肉中VC，同时在待测样品中加入已知量抗坏血酸标准溶液，按测定步骤进行加标回收实验，结果见表2 方法的回收率在87.2%94.3%之间，测定结果满足分析要求。2.3荧光分光光度计法与2，4二硝基苯肼比色法比较肉类中VC测定常采用传统的2，4二硝基苯肼比色法，荧光分光光度计法则很少见报道。肉制品中VC含量都很低，2，4二硝基苯肼法的检出限较高 、重复性也较差，而荧光分光光度计法检出限低 精密度较高 故将荧光分光光度计法与2，4二硝基苯肼比色法对腊肉中VC的测定结果相比较，结果见表3 。从表3可知，这两种方法测定腊肉中VC含量，其结果无显著差且荧

14、光分光光度计法精密度更好。 可见，荧光分光光度计法测定肉制类样品中VC具有快速准确 精密度高等优点。 H P L C - R F 法快速测定水中苯并( a ) 芘利用高效液相色谱仪利用高效液相色谱仪( HP LC ) , 将样品中苯并将样品中苯并( a) 芘与其他芘与其他 有机物分离有机物分离, 并同并同 荧荧光分光光光分光光 度计度计( R F) 的微的微 流动池相联流动池相联, 作荧光测定作荧光测定, 组成了组成了 HPL C - RF 测定体系测定体系, 进进 行饮用行饮用 水检测。该水检测。该 方法相方法相 对标准对标准 差为差为 4.5 % 7.2% , 回收回收 率为率为8 6 .

15、5% 93.5% , 检测限为检测限为 0. 0009g/ L 。1 背景介绍背景介绍苯并苯并( a ) 芘是多环芳烃中致癌性最强的化合物之一。环境中多环芳烃主要来自煤和石油芘是多环芳烃中致癌性最强的化合物之一。环境中多环芳烃主要来自煤和石油的的燃烧以及裂解过程。在热电厂、燃烧以及裂解过程。在热电厂、 煤气厂、煤气厂、 焦化厂以及石油化工企业的生产中焦化厂以及石油化工企业的生产中, 都有多都有多环芳环芳烃排入大气烃排入大气, 这些企业的废水中也都含有多环芳烃。我国地表水环境质量标准规定这些企业的废水中也都含有多环芳烃。我国地表水环境质量标准规定类类水水苯并苯并( a ) 芘含量为芘含量为 2.

16、810-6mg/ L。因此。因此, 对水体中苯并对水体中苯并( a) 芘的日常检测具有重要意义。芘的日常检测具有重要意义。目前苯并目前苯并( a)芘的检测主要芘的检测主要 采用层析采用层析- 荧光分光光度法和高效液相色谱法。今应用高效荧光分光光度法和高效液相色谱法。今应用高效液液相色谱仪和荧光分光光度计对日常饮用水中苯并相色谱仪和荧光分光光度计对日常饮用水中苯并( a ) 芘进行检测芘进行检测, 满足了地表水的测定满足了地表水的测定要要求。求。2 实验部分实验部分2.1 主要仪器及试剂主要仪器及试剂高效液相色高效液相色 谱仪谱仪, 51 0 泵泵, Wa t e r s 公司公司;Rheody

17、ne 7725 i 六通进样阀六通进样阀, 带带 20 L 进样进样定量管定量管; R F- 53 01 荧光分光光度计荧光分光光度计, 带带 12 L 液相微流动池，日本液相微流动池，日本 岛岛 津津 公公 司司; C18色谱柱（色谱柱（150 mm 3 . 9 mm 5m）。石油醚）。石油醚( 沸程沸程 60 90 重重 蒸蒸 馏馏 ) ; 甲醇。甲醇。0.05 mg / L 苯并苯并( a) 芘标准溶液芘标准溶液: 临用时临用时, 用甲醇稀释用甲醇稀释 0.040 g / L 苯并苯并( a) 芘标准储备芘标准储备液液.2.2 测定条件测定条件流动相流动相 甲醇甲醇 ：水：水= 90：1

18、0 , 0 .7 mL/ mi n;RF5301PC工作站工作站; 波长波长 激发激发 36 8 nm, 发射发射 4 07 nm; 狭缝宽激发狭缝宽激发5 nm, 发射发射 5 nm; 数据采集间隔数据采集间隔0 .02 min 。2.3 微流动池校正微流动池校正在激发波长在激发波长 400 nm 、 发射波长发射波长 450 nm 的条件下的条件下, 将将 10g/ L 硫酸奎宁溶液硫酸奎宁溶液 5 mL 由由微流微流动池流动相进口处注入管道动池流动相进口处注入管道, 调节前后左右旋钮使荧光值达最大。调节前后左右旋钮使荧光值达最大。2.4 校准曲线绘制校准曲线绘制分别吸取一系列分别吸取一系

19、列005mg/L005mg/L苯并苯并 ( a) 芘芘 标准溶液盛于有标准溶液盛于有 500 mL 水的分液漏斗中水的分液漏斗中, 加加入入石油醚石油醚10 mL , 用力震荡用力震荡 40 0 次次, 静置分层后静置分层后, 弃去水相弃去水相,经无水硫酸钠脱水后经无水硫酸钠脱水后, 移入自移入自制浓制浓缩瓶中缩瓶中( 图图 1 ) ,以高纯氮气吹至近干以高纯氮气吹至近干, 用甲醇定容至用甲醇定容至 0.5 mL , 进样进样20L 测定。测定。以浓度与荧光强度作线性回归以浓度与荧光强度作线性回归, 回归方程为回归方程为 y = 357.9 2 x + 3.685, r = 0.9998。色谱

20、图见图。色谱图见图 2.2.5 水样测定水样测定取水样取水样 500 mL 于分液漏斗中于分液漏斗中, 以下按绘制校准曲线步骤进行以下按绘制校准曲线步骤进行, 进样进样 20 L 测定。测定。3 结果与讨论结果与讨论3.1萃取溶剂的选择萃取溶剂的选择用石油醚、用石油醚、 环己烷和苯环己烷和苯 3 种溶剂萃取水中苯并种溶剂萃取水中苯并( a) 芘的效率无明显差异芘的效率无明显差异, 从溶剂毒性从溶剂毒性和挥和挥发性考虑发性考虑, 选用石油醚作为萃取溶剂。选用石油醚作为萃取溶剂。3.2精密度精密度对两种模拟水样作精密度试验对两种模拟水样作精密度试验, 每个水样平行测定每个水样平行测定 6 次次,

21、每次进样每次进样 2 0 L, 结果见表结果见表 1 3.3加标回收率加标回收率分别取不同含量的模拟水样进行加标回收试验分别取不同含量的模拟水样进行加标回收试验, 结果列表结果列表 2, 回收率为回收率为 86.5% 93.5% 。3.4方法检测限方法检测限将仪器调到最佳状态将仪器调到最佳状态, 测出测出 3 倍噪声的荧光强度值为倍噪声的荧光强度值为 4.210 , 代入校准曲线代入校准曲线, 得浓缩液得浓缩液 的检测限为的检测限为 0.0009mg / L, 以以 500 mL 水样浓缩至水样浓缩至 0.5 m L计算计算, 方法的检测限为方法的检测限为 0.0009 g/ L .该方法灵敏

22、度高该方法灵敏度高, 操作简便、操作简便、 快速快速, 适合于环境水样中苯并适合于环境水样中苯并( a ) 芘的分析芘的分析。生活饮用水中痕量砷和汞的氢化物双道原子荧光测定法1 背景介绍背景介绍砷、砷、 汞是生活饮用水中常见的污染物汞是生活饮用水中常见的污染物, 水中的砷、汞主要来自于工、水中的砷、汞主要来自于工、 农业废水及自然污染。农业废水及自然污染。污污染的水通过食物链的传递和富集进入机体染的水通过食物链的传递和富集进入机体, 并在机体内蓄积并在机体内蓄积, 引起慢性中毒引起慢性中毒, 所以对生活饮用所以对生活饮用水水中砷、中砷、 汞的监测具有重要意义。通常测定砷、汞的监测具有重要意义。

23、通常测定砷、 汞的方法主要有比色法、汞的方法主要有比色法、 分光光度法、分光光度法、 原子原子荧荧光法等光法等, 但是这些方法都是对砷、但是这些方法都是对砷、 汞分别进行测定。采用汞分别进行测定。采用 AF S- 23 0 双道原子荧光光度计建立双道原子荧光光度计建立同同时测定的方法。时测定的方法。2 实验部分实验部分2.1实验原理实验原理样品加入硫脲样品加入硫脲- 抗坏血酸后抗坏血酸后, 样品中样品中As( V) 被还原成被还原成 A s ( ) 。样品中的。样品中的 As( Hg) 与与硼硼氢化钾反应生成挥发性的氢化物氢化钾反应生成挥发性的氢化物, 以氩气为载气以氩气为载气, 将氢化物在石

24、英电热原子化器中将氢化物在石英电热原子化器中原原子化子化, 在特制的在特制的 As( Hg) 空心阴极灯照射下空心阴极灯照射下, 基态原子被激发而跃迁基态原子被激发而跃迁, 再回到基态时再回到基态时发发射出特征波长的荧光射出特征波长的荧光, 其荧光值其荧光值( I f ) 与与 As ( Hg ) 含量成正比含量成正比, 根据标准系列进行根据标准系列进行定量。定量。2.2 仪器与试剂仪器与试剂AF S - 230a 型双道原子荧光光度计， 标准溶液 A s 1 mg/ ml, Hg 1 mg/ ml; 砷汞混合标准储备液 A s 1g/ ml, Hg 0. 1g/ ml; 砷汞混合标准应用液

25、As 100 n g/ ml , Hg 10 n g/ ml; 标准溶液稀释均用蒸馏水；还原剂( 5% 硫脲- 抗坏血酸溶液) ；5% HCl 溶液 ； 0. 01 mo l/ L N a O H 溶液；1% K HB4 - Na O H 溶液2.3 分析步骤分析步骤 3 结果与讨论结果与讨论3.1负高压的选择负高压的选择 在试验条件下在试验条件下, 选择不同的光电倍增管负高压选择不同的光电倍增管负高压 300、 290、 28 0、 260 V 时测时测定和定和绘制标准曲线绘制标准曲线, 试验表明负高压在试验表明负高压在 290 V 时时, 砷、砷、 汞标准曲汞标准曲 线线 r均大于均大于

26、0 . 999。3.2硼氢化钾溶液浓度的影响硼氢化钾溶液浓度的影响试验表明硼氢化钾的浓度高试验表明硼氢化钾的浓度高, 砷测定曲线回归好砷测定曲线回归好, 但是汞测得荧光值小但是汞测得荧光值小,回归线回归线性性低低; 硼氢化钾的浓度降低硼氢化钾的浓度降低, 又不能满足砷测定的要求又不能满足砷测定的要求, 所以试验选择所以试验选择 1% 的硼的硼氢化氢化钾溶液。结果见表钾溶液。结果见表 1 。3.3标准曲线绘制标准曲线绘制 在选定的测定条件下在选定的测定条件下, 对标准溶液重复测定结果见表对标准溶液重复测定结果见表 2。3.4 精密度精密度 用仪器内存统计程序用仪器内存统计程序, 取不同浓度标准进

27、行取不同浓度标准进行 12 次重复测定次重复测定, RSD 均小于均小于 6. 0% , 表明本法表明本法精精密度符合卫生分析要求。密度符合卫生分析要求。3.5 加标回收率加标回收率取样品取样品, 分别加入高、分别加入高、 中、中、 低低 3 个浓个浓 度标准度标准, 测得回收率测得回收率 95. 0% 102. 5% 。结果见。结果见表表 4。3.6 标准差及检出限标准差及检出限对砷的对砷的 空白进空白进 行行 12 次次 连续测连续测 定定, 结结 果分果分 别为别为 0. 00、 0. 19、0. 00、 0. 00、 0. 1 6、 0. 21、 0. 35、 0. 03、 0. 00

28、、 0. 17、 0. 00, 计算标准差计算标准差 s , 为为0. 110 3, 检出限为检出限为 0. 423 4。对汞的空白进行对汞的空白进行 12 次连续测定次连续测定, 结果分别为结果分别为 0. 00、 1. 14、 1. 14、 0. 36、 0. 0 3、 0. 00、0, 00、 0. 15、 0. 19、 0. 00、 1. 24、 0. 00, 计计 算标准算标准 差差 s , 为为0. 472 9, 检出限为检出限为 1. 772 9。3.7 讨论讨论以上结果表明以上结果表明: 用原子荧光用原子荧光 AF S - 230 双道测定生活饮用水中砷汞双道测定生活饮用水中砷汞, 具有较高的灵敏度具有较高的灵敏度和精和精密度密度, 且操作简便且操作简便, 可实现自动化分析可实现自动化分析, 适用于日常检测。适用于日常检测。使用荧光分光光度计监测水中非离子型聚氨酯胶团形成