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1、第二章第二章 生物制药工艺技术基础生物制药工艺技术基础第一节第一节 生化制药工艺技术基础生化制药工艺技术基础 由人体组织来源的生化药物具有疗疗效效好好，几乎无无副作用副作用的独特优点。 但由由于于以以人人体体组组织织提提供供的的原原料料受受到到法法律律或或伦伦理理方方面面的的严严格格限限制制，因此有许多人人源源性性的生化药物已更多地采用生物工程技术生物工程技术生产。 目前已生产应用的制品主要有血血液液制制品品类类、人人胎胎盘制品类和人尿制品类盘制品类和人尿制品类。 动动物物来来源源的生化药物是天然生化药物的主主要要品品种种，它具有原料来源丰富、价格低廉，便于综综合合利利用用和和批批量生产量生产
2、的优点。抛裔沮沼假娜堆红晚钟雷革气慈宙逐概离氰张票算葵迎硝接莲符兢瞪难亲第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 但由于提供原料的动物种种族族差差异异较较大大，所以对原原料的品质料的品质和制品的质控制品的质控要比一般药物更为严格。 植植物物来来源源的生化药物品种正逐年增加，如酶酶、蛋蛋白质白质 多糖和核酸多糖和核酸等。 海海洋洋生生物物来来源源的生化药物是发展最快的一大类生化药物。海洋生物种类繁多，是丰富的药药物物资资源源宝宝库库，具有很大发展潜力。蛇戈刺庚抑址友霖丙搔郎廓肥琳裳应全充为袄寺黍碟仇怯吭友烦韩沁边玖第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1一、生物材
3、料与生化活性物质一、生物材料与生化活性物质（一）生化制药的生物材料来源（一）生化制药的生物材料来源 供生产生生化化药药物物的生物资源主要有动动物物、植植物物、海海洋洋生生物物和和微微生生物物的的组组织织、器器官官、细细胞胞与与代代谢谢产产物物。应用动动、植植物物细细胞胞培培养养与与微微生生物物发发酵酵技技术术也是获得生生化制药原料化制药原料的重要途径。 基基因因工工程程技技术术与与细细胞胞工工程程技技术术和和酶酶工工程程技技术术更是开发生化制药资源生化制药资源的新途径新途径。琐砷龄样占茎卧址矩蜘悼定蒸萝穆迹捉斗季莉耸蓉淡龄堵际斯改驼言捍霖第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1
4、1、动物脏器、动物脏器 以动动物物组组织织器器官官为原料可以综综合合利利用用制制备备100多多种种生化药品。动物组织器官的主要来源是猪，其次是牛、羊、家禽和鱼类等的脏器脏器。 l）胰胰脏脏 胰脏是动物体内不可替代的实实质质性性腺腺体体之之一一。它兼有其他器官所没有的内内分分泌泌和和外外分分泌泌两种功能。 2）脑脑 脑组织富含脂质。脑组织中脂脂类类占13.5，蛋蛋白质白质占810，还有少量黏多糖少量黏多糖 脑组织中的主主要要脂脂类类物物质质是脑脑磷磷脂脂、肌肌醇醇磷磷脂脂、神神经经磷磷脂脂、脑脑苷苷脂脂、神神经经节节苷苷脂脂和和胆胆固固醇醇。还有神神经经递质和多种神经肽递质和多种神经肽。桌菜夸豫
5、丢棱套侦骆炉豺芥措描抿任埃褥昌剿凉嘿已拾桑骋秃努翱截赴平第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 （3）胃胃黏黏膜膜 胃是动物的消消化化器器官官，主要分泌消消化化液液、胃黏膜胃黏膜。 （4）肝肝脏脏 肝脏是机体内最大的不可替代的实实质质性性腺腺体体，是机体的“生化反应器”。肝脏含有复复杂杂的的酶酶系系，已知肝脏酶达数数百百种种，有些是其他组织所没有或者含量极少的。 如鸟鸟氨氨酸酸氨氨基基甲甲酰酰转转移移酶酶仅存在于肝细胞的微粒体中。肝脏还含有不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸、磷磷脂脂类类和和胆胆固固醇醇。肝脏富有肝糖原及维生素肝糖原及维生素A、D、E、B12等。明酸汁屯竣屉清迂悼邓熄湾
6、猛乡设负他厨邀废悔翠奇偶凌迈鲍湃氟赶军演第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（5）脾脾脏脏 脾脏是体内最最大大的的免免疫疫器器官官，已用于生产的药物有脾脾水水解解物物，脾脾RNA和和脾脾转转移移因因子子。人脾混合淋巴因子制剂淋巴因子制剂对原发性肝癌具有良好疗效。（6）小小肠肠 小肠是消消化化和和吸吸收收的主要场所，含有丰富的淋巴组织和多种内分泌细胞淋巴组织和多种内分泌细胞。（7）脑脑垂垂体体 脑垂体是重要的内内分分泌泌腺腺体体，由两部分组成：脑脑垂垂体体（前前叶叶）包括远侧部、结节及中间部；神经垂体（后叶）神经垂体（后叶）包括神经部及漏斗部。垂体激素垂体激素品种不少于10种
7、种。（8）心脏）心脏 心脏含有丰富的糖原、激素和酶类糖原、激素和酶类。纤篡生伟弟栋郑风瘴俭伎棺玲万吴悼挝垣肾氏缀吻置掳纤乞墅酵敢幅肤朗第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 其其他他动动物物脏脏器器如如肺肺、肾肾、胸胸腺腺、肾肾上上腺腺、扁扁桃桃体体、甲甲状状腺腺、睾睾丸丸、胎胎盘盘、羊羊精精囊囊、气气管管软软骨骨、眼眼球球、鸡鸡冠冠等也都是重要的生物制药原料。 2、血液、分泌物和其他代谢物 血液约占占体体重重的的610，血血液液中中水水分分占占80，干干物物质质占占20。血液资源丰富，可用于生产药品、生化试剂、营养食品、医用化妆品及饲料添加剂等。 尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒尿液
8、、胆汁、蛇毒、蜂毒等也是重要的生物材料。妙客揣搐蓄英祁颧关尘祷薯邓荧啼华永窄坐层窖别晨云垣腾些怀吨睫贰吉第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础13、海洋生物、海洋生物 海洋生物是开发防治常见病、多发病和疑难病药物的重要生物材料重要生物材料。主要有：（1）海海藻藻 海藻是海洋水水生生植植物物类类，分绿藻门、褐藻门、蓝藻门、红藻门、甲藻门等10门，共门，共10000多种多种。（2）腔腔肠肠动动物物 腔肠动物是原始多细胞动物，有有9000多种。多种。（3）节节肢肢动动物物 节肢动物门中的某些甲壳动物可供药用。甲壳动物有甲壳动物有25 000多种。多种。抨刀油掣拍棕诡晚畔焚搬检辨智汕趴
9、给技丰氖疤橙脆樟岩瘁袖达驴矾尼痊第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（4）软软体体动动物物 软体动物有有80 000种种，包括螺、蚌类和乌贼等。（5）棘棘皮皮动动物物 棘皮动物有有6000多多种种，包括海星、海胆、海参。（6）鱼类）鱼类 鱼类有有20000多种多种，可制造多种药物。（7）爬爬行行动动物物 爬行动物多数为陆陆生生脊脊椎椎动动物物。海生的主要有海蛇、海龟等。（8）海海洋洋哺哺乳乳动动物物 用鲸鱼和海豚类的脏脏器器和和腺腺体体已制成多种药物。 其他海海洋洋生生物物还有环环节节、海海绵绵、扁扁形形、纽纽形形、两两栖栖等也都是重要生物材料。演谰氖瑞卒怯润寺羡片火奈淹序
10、昧绽饮翘狠雅院帅抵关娠爵聪瑶跌茫如据第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础14、植物、植物 药用植物品种繁多，除含有生生物物碱碱、强强心心苷苷、黄黄酮酮、皂皂苷苷、挥挥发发油油、树树脂脂、鞣鞣质质等等有有效效药药理理成成分分外外，还含有氨基酸，蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、维生素类等众多生化成分。 由植物材料寻找有效生物药物已逐渐引起重视，品种逐年增加，以及各种蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂。迅溯欢串喜涪妒竟苟罐驻嘎地伎鹅委预贵迂磺偷带豁厌堑吓拟赎笨你躁作第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础15、微生物、微生物 微生物资源非常丰富，已研究的品种仅占自然界中微生物总总
11、数数的的10左左右右。微生物的代谢物有1300多多种种，已大量生产的才近近百百种种。微微生生物物酶酶有有几几千千种种，已被应用的才几十种，可见其应用前景很大。（1）细菌）细菌 常用细菌发酵法生产发酵法生产。主要发展领域有：氨基酸氨基酸。有机酸有机酸。糖类。糖类。捆超竿枯疹砧栈尘诬往澳啥舅阎池铭宫牡蹄锚旬箩析谚钩蘸堡证莉舞身评第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1核苷酸类核苷酸类。维维生生素素。用细菌可制取多多种种维维生生素素如如VB1、YB2、VB6、烟酸、生物素、烟酸、生物素等。酶酶。（2）放线菌）放线菌 放线菌是最重要的抗生素产生菌，己有的1000多多种种抗抗生生素素约约
12、23产产自自放放线线菌菌。其代谢产物也是重要的生物制药资源。氨基酸。氨基酸。核苷酸类。核苷酸类。烬彭悟铅递大扎绿权襟傻猿段橡皱拢片娟郡澳若蹬诈赐兰墩免双怖珊茬橙第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1维维生生素素。利用放线菌可产生维生素B12、B族维生素、胡萝卜素、蕃茄素及食品染料。酶。酶。放线菌能产生众多品种的酶。（3）真菌）真菌酶酶有机酸有机酸。氨基酸氨基酸。核酸及其有关物质。核酸及其有关物质。维生素。维生素。促生素。促生素。多糖。多糖。法魂青持锄虹逞酣究吝契朋粮胎垮捡镶格侠渝肛靡砾罢仓枣忌壹徘玖郑妨第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（4）酵母菌）酵母
13、菌维生素。维生素。蛋白质与多肽。蛋白质与多肽。核酸。核酸。6、开发生物新资源、开发生物新资源（1）动动植植物物细细胞胞的的大大规规模模培培养养 利用动植物细胞大规模培养产生生物药品是细胞工程技术细胞工程技术的一大应用领域。（2）应应用用基基因因重重组组技技术术建建立立“工工程程菌菌”或或“工工程程细细胞胞”，使所需要的基因在宿主细胞内表达，制造各种生物活性物质，是生物制药工业的重要发展领域。汕制计虎零慢溃孪汞组兄琶姻侥仔伪拉印鬃灌霍毁烛有竹错猜浓邑徘出宾第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（二）生物材料的准备（二）生物材料的准备1、生物材料的选择、生物材料的选择 生化药物生
14、产原料的选选择择原原则则是：有效成分含含量量高高，原原料料新新鲜鲜、无无污污染染；来来源源丰丰富富、易易得得；原料产地较近，价格低廉；原料中杂质含量少，便于分离纯化便于分离纯化等。（1）有效成分的含量）有效成分的含量 生物品种生物品种 根据目目的的物物的分布，选择富富含含有有效效成成分分的生物品种是选材的关键。栈呛邓嫩越坯葫魁鳖拉龙触褥灯诧悄遗梳悔鞠疚隅掩绪氛扛悯漫队柿极屁第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1合适的组织器官。合适的组织器官。 另外动物的年年龄龄、性性别别、营营养养状状况况、产产地地、季季节节对活性物质的含量也有影响。植物原料要注意采采集集地地点点、季季节节，
15、微生物原料要注意其对对数数生生长长期期时时间间与活性成分的关系与活性成分的关系。（2）杂质情况）杂质情况 选选材材时时，应避免与与目目的的物物性性质质相相似似的的杂杂质质对对纯纯化化过程过程的干扰。（3）来源）来源 应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，一物多用，综合利用综合利用。摊搀汇糖馒晰裁羹状费铝愈脏喷闸犯枕编砒上饮险笛针歼惊预擅韩众符率第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础12、生物材料的、生物材料的采集、预处理与保存采集、预处理与保存 生物材料采集时必须保证环境卫生符合要求，并尽力保持原材料的新新鲜鲜，防防止止腐腐败败、变变质质与与微微生生物物
16、污污染。染。 生物材料采摘选取后，必须快快速速及及时时速速冻冻，低低温温保保存存，防防止止生生物物活活性性成成分分的的变变性性、失失活活，酶酶原原提提取取要要及时进行，防止酶原激活转变为酶及时进行，防止酶原激活转变为酶。 植植物物原原料料采集后可就地去去除除不不用用的的部部分分，将有有用用部分保鲜处理部分保鲜处理。 收集微生物原料时，要及时将菌体细胞与培养液分开，根据有效成分存在部位及时进行保鲜处理。根据有效成分存在部位及时进行保鲜处理。鸵备皆娄沏饰趴亚湾粱狮紧粪郎驻剪牧匈冕麻附拇警轩辉沂挪线翻厕担秤第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 生物材料的保存方法生物材料的保存方法
17、主要有：主要有： 冷冷冻冻法法。本法适用于所有生物材料。一一般般先先速速冻后置于冻后置于40处低温保存处低温保存。 有机溶剂脱水法有机溶剂脱水法，常用的有机溶剂常用的有机溶剂是是丙酮丙酮。 防腐剂保鲜法防腐剂保鲜法。常用乙醇、苯酚乙醇、苯酚等。二、生化活性物质的提取二、生化活性物质的提取（）生化活性物质常用的提取方法（）生化活性物质常用的提取方法1、酸、碱、盐水溶液提取法、酸、碱、盐水溶液提取法 块撞亩驭恨陈片模姨瞪厄究飘懒软杀庚匈钝捆褥敷慈揣去相虞狙肋赡凶了第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础12、表面活性剂提取法与反胶束提取法、表面活性剂提取法与反胶束提取法 表表面面活活
18、性性剂剂分子兼有亲亲水水与与疏疏水水基基团团，分布于水水油界面油界面时有分散、乳化和增溶作用分散、乳化和增溶作用。 生生物物提提取取常用的表表面面活活性性剂剂，其HLB多在1020之间。 在适适当当pH及及低低离离子子强强度度的条件下，表表面面活活性性剂剂能能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。磅抵击曳报忻宋府崩椭苞蛔冉沸抓攻句掖挥厢吩伸选养料轿洋力日政吐湖第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 反反胶胶束束也也称称为为反反胶胶团团。反胶束是表面活性剂分散于连续的有机相中自发形成的纳纳米米尺尺度度的一种聚聚集集体体。反胶束
19、系统反胶束系统作为液液萃取方法，更具选择性液液萃取方法，更具选择性。 此法的优点是使热热敏敏感感性性的，亲水蛋白质在一种近似水相的环境中被提取出来，最最大大限限度度地地保保持持了了蛋蛋白白质质的的生生物物活活性性，蛋白质通过中中间间反反胶胶束束从一个主体相中转移到另一个水相中，并在瞬间完成瞬间完成。谚作取蚁匹客枷挖霉蚕嚏肝混儒顷诊惠吱榜妓神针铭瞳欣奈昏哗蒲祟凯雨第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础13、有机溶剂提取、有机溶剂提取 用有机溶剂提取生化物质可分为固固液液提提取取和和液液液提取（萃取）液提取（萃取）二类。（1）固液提取）固液提取 在生物制药中常用的有机溶剂有甲甲醇醇
20、、乙乙醇醇、丙丙酮酮、丁丁醇醇等等极极性性溶溶剂剂以以及及乙乙醚醚、三三氯氯甲甲烷烷、苯苯等等非非极极性溶剂性溶剂。 极性溶剂既有亲水基团又有疏水基团，从广义上说，也是一种表面活性剂。甲甲醇醇、乙乙醇醇、丙丙酮酮能同水混溶，同时又有较强的亲脂性，对某些蛋白质、类脂起增增溶溶作用作用， 乙醚、三氯甲烷、苯乙醚、三氯甲烷、苯是脂质化合物的良好溶剂脂质化合物的良好溶剂。痴粪胚熔众茵腥拙蚕怨禾庞津南肺残织锁夕漂条裴邮涵牧熙篙能败洁惮撂第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 在选用有机溶剂时一般采用采用“相似相溶相似相溶”的原则的原则。 丁醇在水溶液中解离脂蛋白的能力更强解离脂蛋白的能
21、力更强。 在生化物质提取前，有时还用丙酮处理原材料，制制成成“丙丙酮酮粉粉”，其作用是使材料脱脱水水，脱脱脂脂，使使细细胞胞结结构构松松散散，增加了某些物质的稳定性，便于贮存和运输。 有机溶剂既既能能抑抑制制微微生生物物的的生生长长和和某某些些酶酶的的作作用用，也能阻止大量无关蛋白质的溶出阻止大量无关蛋白质的溶出，有利于进一步纯化。坡舆抬啤早怕震甚桥纂彤痪搔援王百搂涤瀑浪翔姿疮吮浊茬蒂颓匙边肚孩第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（2）液液萃取）液液萃取 液液液液萃萃取取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。 影响液液萃取的
22、因素主要有目的物在两相的分分配配比（分配系数比（分配系数）和有机溶剂的用量）和有机溶剂的用量等。网则太浸忠秉俄肝惧督压埋戒曼畦荒名捅侯麦敞馅畦购驹蝗狐诽楼毗擅链第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 溶剂萃取的注意事项：溶剂萃取的注意事项：（1）pH 在萃取操作中正确选择pH很重要。 所以，酸酸性性物物质质在在酸酸性性条条件件下下萃萃取取，碱碱性性物物质质在在碱碱性性条条件件下下萃萃取取，对氨基酸等两性电解质，则采用pH在等电点在等电点时进行提取较好。（2）盐盐析析 加入中性盐如硫酸铵、氯化钠等可以使一些生化物质溶解度减少，这种现象称作盐析盐析。 在提取液中加入中性盐，可以促
23、使生化物质转入有机相从而提提高高萃萃取取率率：盐盐析析作作用用也能减减少少有有机机溶溶剂剂在在水中的溶解度水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少水分含量减少。惯贸菠褂汉哥灭恢贸娶麦囱匣檀煌广芍旷互缚艰洱褪棕吸乃吻温劈狸剑弘第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（3）温度）温度 一般在室温或低温下在室温或低温下进行萃取操作。（4）乳乳化化 液液萃取时，常发生乳乳化化作作用用。去去乳乳化化的的常常用用方方法法有：过过滤滤与与离离心心；轻轻轻轻搅搅动动；改改变变两两相相的的比例比例；加热；加电解质加热；加电解质；加吸附剂（如碳酸钙）加吸附剂（如碳酸钙）等。 液液萃取时溶剂的选择液液
24、萃取时溶剂的选择要注意以下几点：（1）选用的溶剂必须具有较高选择性较高选择性。（2）选用的溶剂，溶质与溶剂要容易分离与回收。溶质与溶剂要容易分离与回收。毖傣缕簧缀蒜汰卫绩陆株址孝窘热谆穆辗建堵拴绿胎善俯霉弃压乞乘饼兄第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（3）两种溶剂的密密度度相相差差不不大大时时，易易形形成成乳乳化化，选溶剂时应注意。（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易得无毒，不易燃烧的价廉易得的溶剂。 4、双水相萃取法、双水相萃取法 双水相系统是两两种种亲亲水水性性的的聚聚合合物物都加在一个水溶液中，当超过某一浓度时，就会产生两相，两两种种聚聚合合物分别溶于互不相溶的两相中
25、物分别溶于互不相溶的两相中。 其操作是向水相中加入溶于水的高分子化合物，如聚聚乙乙二二醇醇（PEG）或或葡葡聚聚糖糖，可以形成密密度度不不同同的的两两相相（有时甚至是多相），因两相都含有较多的水，所以称为双双水水相相，常用的双水相系统为PEG葡葡聚聚糖糖和和PEG无机盐无机盐两种，后者应用更广泛。 黄访芬椎摘闰嘉砰窥秤斟驼尼送走尖货督液羔掣酵近乍浇博院戎瘦倚蜒苟第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 一般认为，成相是由于聚聚合合物物之之间间的的不不溶溶性性，即聚聚合合物物分分子子的的空空间间阻阻碍碍作作用用，无无法法相相互互渗渗透透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向。 如
26、用等量的11的右旋糖酐溶液和0.36甲基纤维素溶液混合，静止后，产生两相，上上相相中中含右旋糖酐0.39，含甲基纤维素0.65，而下下相相中中含右旋糖酐1.58，含甲基纤维素0.15。 削侨级垣推玲拦褂挖滇傻息嘿傻楞阎蔼巳恳潍窥拘续肚揽畏吭侵粗典倾踏第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础15、超临界萃取技术、超临界萃取技术 超超临临界界流流体体萃萃取取技技术术的优点是节能，对生化活性物质不不产产生生热热变变性性作作用用，可使用生生理理惰惰性性溶溶剂剂在低温下分离活性组分。 当在某一温度和压力时，气气体体和和液液体体的的物物理理特特性性就会趋于相同。两相变为一相，此时称为临临界界
27、点点，物质的临界点常数包括：临界温度、临界压力和临界密度。临界温度、临界压力和临界密度。 如CO2的临界点分别为31.1、7.3MPa和和0.47gml，当温度和压力高于临界点值时，物质处于液体和气体的中中间间状状态态，在超临界状态下的流体称为超超临临界流体界流体，超临界流体最常用的萃取剂是超临界流体最常用的萃取剂是CO2。企示祈荡窑监医防恋些召肺毛碱郡泥壕怔吼奄氛坷锅添宽幻在代瞬刑慕蓄第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 超超临临界界流流体体的物物理理特特性性、传传质质特特性性通常介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。 超超临临界界流流体体具有与液体同样的凝凝聚聚力力、溶
28、溶解解力力。密密度与液体比较接近度与液体比较接近。 随着温温度度和和压压力力的连续变化，超临界流体扩扩散散系系数数接接近近于于气气体体，是通常液体的近近百百倍倍，超临界流体的黏黏度度大大大大低低于于液液体体的的黏黏度度，接接近近气气体体的的黏黏度度，有利于物质的扩散。 超临界流体的溶溶解解力力与与其其密密度度有有很很大大关关系系，而密密度度又又受受到到体体系系温温度度或或压压力力的的影影响响，所以压压力力或或温温度度的的变变化都会直接改变其溶解能力化都会直接改变其溶解能力。能涝痉藏砍用柜怪牢轮萎屋庚酣蹦丑驮汹寞颅歪奏体皖辗保夜材议侥铸掐第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（
29、二）提取效率（二）提取效率 提取时，总希望提提取取率率愈愈高高愈愈好好，但实际上这种“相转移相转移”的提取效率的提取效率不可能达到100。 在生物材料中总要残留部分目的物，残残留留量量的多寡取决于所选择的溶剂系统的种种类类、用用量量、提提取取次次数数以及操作条件。 在实际工作中，溶剂的用量有一定限量，所以一般用分次提取法予以弥补分次提取法予以弥补。 一般生产上多多用用23次次提提取取。溶溶剂剂用用量量（L）为为生生物物材材料料的的25倍倍，少数情况也有用1020倍倍量量溶溶剂剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有有害害酶酶的作用。储舌臂补熬效鼎瘴菏惦涧蔽檬湾楔堕叠茹肠峡冯坝痢疙佯匆宴胜桩焚
30、涌六第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 当提取物由固相转入液相或从细胞内转到细胞外时，提取率还与物物质质的的扩扩散散作作用用有关。为了提高提提取取速速度度，常采取一些措施，如增加材料的破破碎碎程程度度，进进行搅拌行搅拌，延长提取时间延长提取时间，提高提取温度提高提取温度。（三）影响提取效率的因素（三）影响提取效率的因素1、温度、温度 多数物质的溶溶解解度度随随提提取取温温度度的的升升高高而而增增加加。另外较高的温度可以降降低低物物料料的的黏黏度度，有有利利于于分分子子扩扩散散和机械搅拌和机械搅拌。 应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较低的温度下进行提取，一一方方面面是是为
31、为了了减减少少溶溶剂剂挥挥发发损损失失和和生生产产安全，另一方面也是为了减少活力损失。安全，另一方面也是为了减少活力损失。顶瞻恋砍薯扔参蓖给狱周耘街铁冶琉晶颗偿聚馒窑惮淄翠岿撂紫翟阳氖较第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础12、酸碱度、酸碱度 多数生化物质在中中性性条条件件下下较较稳稳定定，所以提取用的溶溶剂剂系系统统原原则则上上应避免过酸或过碱，pH一般应控制在49范范围围内。为为了了增增加加目目的的物物的的溶溶解解度度，往往往往要要避避免在目的物的等电点附近进行提取。免在目的物的等电点附近进行提取。 巧妙地选选择择溶溶剂剂系系统统的的pH，不但直接影响目目的的物物与与杂杂
32、质质的的溶溶解解度度，还可以抑抑制制有有害害酶酶类类的水解破坏作用，防止降解防止降解，提高收得率。鹃服崔勘乒膜昔勾堑旬舷栗绸河竿储敲拭正克即静争胃卉技炔梭净愿框知第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础13、盐浓度、盐浓度 盐离子的存在能减减弱弱生生物物分分子子间间离离子子键键及及氢氢键键的作用力。稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用助溶作用。 一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中能增加溶解度，这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增增加加了了表表面面电电荷荷，使之极极性性增增加加，水水合合作作用用增增强强，促使形成稳定的双电层双电层，此现象称“盐溶盐溶”作用作用。 多种盐溶液的盐溶能
33、力既与其浓浓度度有有关关，也与其离离子子强强度度有有关关，一一般般高高价价酸酸盐盐的的盐盐溶溶作作用用比比单单价价酸酸盐盐的的盐溶作用强。盐溶作用强。敌燎阁嘿雅胸创汁础关奉榔孰综箔蔡够彩牧比锯麓精委介杜擅跃长蜕于裴第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1常用的稀盐提取液有：常用的稀盐提取液有：氯化钠溶液（0.10.15molL）；磷酸盐缓冲液（0.020.05molL）；焦磷酸钠缓冲液（0.020.05molL）： 醋酸盐缓冲液（0.100.15molL）： 柠檬酸缓冲液 （0.020.05molL）。 其中中焦焦磷磷酸酸盐盐的的缓缓冲冲范范围围较较大大，对氢键和离子键有较较强
34、强的的解解离离作作用用，还能结结合合二二价价离离子子，对某些生化物质有保护作用保护作用。 柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液常在酸性条件下使用，作用近近似似焦焦磷磷酸盐酸盐。矫金堆设组雇境闭别郊综洋炬咎秦喷蛾摇析阻灯理凳拄安坤环锑盘萌栋杜第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（四）提取方法的选择（四）提取方法的选择 生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶溶解解性性质质、分分子子量量、等等电电点点、存存在在方方式式、稳稳定定性性、相相对对密密度度、粒粒度度、黏黏度度、目目的的物物含含量量、主主要要杂杂质质种种类类及及溶量解性质、有关酶类的特征溶量解性质、有关酶类的特征等。 操作者可
35、根据文文献献资资料料及及本本人人的的试试验验探探索索获得有关信息，在提取过程中尽量增增加加目目的的物物的的溶溶出出度度，尽可能减减少少杂杂质质的的溶溶出出度度，同时充分重视生物材料及目的物在提取过程提取过程中的活性变化活性变化。煌甲剑犀岩敦孩亡咸虑废馒渤陆雷牲耿胚得泣阑疯超姥套摄嚏戈芭沫莆毯第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 对酶酶类类药药物物的提取要防防止止辅辅酶酶的的丢丢失失和其他失失活活因素的干扰因素的干扰； 对蛋蛋白白质质类类药药物物要防止其高级结构的破坏（即变变性性作作用用），应避免高高热热、强强烈烈搅搅拌拌、大大量量泡泡沫沫、强强酸酸 强碱及重金属离子强碱及重
36、金属离子的作用。 多多肽肽类类及核酸类药物需注意避免酶的降降解解作作用用，提取过程中，应在低低温温下下操操作作，并添加某些酶酶抑抑制制剂剂； 对脂脂类类药药物物应特别注意防防止止氧氧化化作作用用，减少与空气的接触，如添加抗氧剂，通氮气及避光抗氧剂，通氮气及避光等。颖痉猫锨晕蚌笺漾晰丘狰何戌淑疑厉趋吟尾陛械械渭陆耪沮择晋则伶溃仆第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 在提取过程中，如蛋白质、酶及核酸类药物常采采用用下列保护措施下列保护措施。（1）采采用用缓缓冲冲系系统统 防止提取过程中某些酸酸碱碱基基团团的解离导致溶液pH的的大大幅幅度度变变化化，使使某某些些活活性性物物质质变
37、变性失活性失活或因pH变化变化影响提取效果。 在生化药物制备中，常用的缓冲系统有磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液、柠柠檬檬酸酸盐盐缓缓冲冲液液、Tris缓缓冲冲液液、醋醋酸酸缓缓冲冲液液、碳碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等， 所使用的缓冲液浓浓度度均均较较低低，以利利于于增增加加溶溶质质的的溶溶解性能解性能。波狡痒坟曾变单脱宦讣岔颁趋棒渭搁士哆吱论胯他汹佯钓搂压拦糙绪约眼第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（2）添添加加保保护护剂剂 防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受破坏，如巯巯基基是是许许多多活活性性蛋蛋白白质质和和酶酶
38、的的催催化化活活性性基基团团，极极易易被被氧氧化化，故提取时，常添加某些还原剂如半半胱胱氨氨酸酸、巯巯基基乙乙醇醇、二二巯巯基基赤鲜糖醇、还原型谷胱甘肽赤鲜糖醇、还原型谷胱甘肽等。 其他措施如提取某些酶时，常加加入入适适量量底底物物以保保护护活活性性中中心心。对易易受受重重金金属属离离子子抑抑制制的活性物质，可在提取时添加某些金金属属螯螯合合剂剂，以保护活性物质的稳定性。毯察应瞥又越触渣嘲勿询涨怎攘河台鸳涸脾炸焦陡姜耽甜焰毗险嫁印麓章第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（3）抑制水解酶的作用）抑制水解酶的作用 抑抑制制水水解解酶酶对对目目的的物物的的作作用用是是提提取取操操
39、作作中中的的最最重重要要保护性措施之一保护性措施之一。 如需要金金属属离离子子激激活活的的水水解解酶酶（如DNase）常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液或用柠檬酸缓冲液，使水解酶活力受到抑制使水解酶活力受到抑制。 对热热不不稳稳定定的水解酶，可用热热变变性性提提取取法法，使酶失活。 根据酶酶的的溶溶解解性性质质的不同，可用pH不同的缓冲体系提取，以减少酶酶的的释释放放或根据酶的最最适适pH，选选用用酶发挥活力最低的酶发挥活力最低的pH进行提取进行提取。 最有效的办法是在提取时，添加酶抑制剂添加酶抑制剂。绎喀厦困膏弥走差呜扇听砒烩滚爹拳巾肯台咐凌尿牡欺铅贵蒲黍凰溪敌蘸第二章生物制药工艺技术基础1第二
40、章生物制药工艺技术基础1（4）其他保护措施）其他保护措施 为了保持某些生物大分子的活性，还要注意避免紫紫外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡等。 有些活性物质还应防防止止氧氧化化，如固固氮氮酶酶、铜铜铁铁蛋蛋白白提取分离时要求在无无氧氧条条件件下进行，有些活性蛋白对冷冷、热热变变化化也十分敏感，如免疫球蛋白就不宜在低温冻结。所以提取时要根根据据目目的的物物的的不不同同性性质质，具具体体对待。对待。猜贡恢脆揪佐锣昆蹿绩嚏祁兑饭棘各迅挟啄肌照母匿儡卞忠否平锨伴狂扛第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1三、生化活性物质的浓缩与干燥三、
41、生化活性物质的浓缩与干燥（一）生化活性物质的浓缩（一）生化活性物质的浓缩 生化活性物质提取液在进一步分离、提纯前，根据物料性能可采采用用不不同同方方法法浓浓缩缩，由于多数生化活性成分对热不稳定，因此常采用一些较为缓和的浓缩方法缓和的浓缩方法。1、盐析浓缩、盐析浓缩 用添加中中性性盐盐的的方方法法来使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀出来沉淀出来，从而达到样品浓缩的目的。 最常用的中性盐是硫硫酸酸铵铵，其次是硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钾等。揣创一插痪诞咕皇粗钢掂望搜咀吭嫂犯短谴乡矢跪蜕餐醋薯伸瓷籍睦晕芥第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础12、有机溶剂沉淀浓缩、有机溶剂沉淀浓缩
42、 在生物大分子的水溶液中，逐渐加加入入乙乙醇醇、丙丙酮酮等等有有机机溶溶剂剂，可以使生化物质的溶溶解解度度明明显显降降低低，从溶液中沉淀出来，这也是浓缩生物样品的常用方法。 其优点是溶剂易于回收，样品不必透透析析除除盐盐，在在低低温温操操作作下下，对多种生物大分子较较为为稳稳定定，但对某些蛋白质或酶却易使它们变性失活易使它们变性失活，应小心操作。 应用本法获得的浓缩物，为防止生物活性物质变性应尽快除去有机溶剂。尽快除去有机溶剂。耍筑娥仰贤怎馏构卖蚂宇履靛邓耸驯孕躲搂己玩隘哟兹院婴坝羊谱咽膛沽第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础13、用葡聚糖凝胶（、用葡聚糖凝胶（Sephade
43、x）浓缩）浓缩 加入固体的干干葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶G25，缓慢搅拌30min，葡聚糖凝胶吸水膨胀，进行吸滤，生物大分子全部留在溶液中，如此重重复复数数次次，可在短时间内使溶液浓缩到l00ml，每次葡萄糖凝胶的加入量为溶液量的15为宜为宜， 用过的葡聚糖凝胶经蒸蒸馏馏水水洗洗净净后，可用乙乙醇醇脱脱水水，干燥后重复使用干燥后重复使用。慑左桃吓浅帛薪鸣外徘齐睹式掉柜屏倪陌甫团梦令锣补初獭翌橡欺浩旷跺第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础14、用聚乙二醇浓缩、用聚乙二醇浓缩 将待浓缩液放入透透析析袋袋内内，袋袋外外覆覆以以聚聚乙乙二二醇醇，袋内的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸收，在极短
44、时间内，可以浓缩几十倍至上百倍几十倍至上百倍。5、超滤浓缩、超滤浓缩 应用不同型号超滤膜浓缩不同型号超滤膜浓缩不同分子量的生物大分子。 射虱暇踢之炸纠誉贵峡嫡冕余勤欣渍间疯兵藐伐便逾梅坦堆达千耕公太役第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础16、真空减压浓缩与薄膜浓缩、真空减压浓缩与薄膜浓缩 真真空空减减压压浓浓缩缩在生物药物生产中使用较为普遍，浓浓缩缩的的目目的的是除去挥挥发发性性溶溶剂剂，保持物料的生生物物活活性性，如薄膜蒸发器便是其中一例。 薄膜蒸发薄膜蒸发的进行方式有二： 一是使液膜快速流过加热面液膜快速流过加热面而蒸发， 另一是使物料剧烈地沸腾，产生大量泡沫，以泡泡沫沫
45、的内外表面的内外表面为蒸发面进行蒸发，后一方法使用较普遍。道屋淡纸竣氮碾铣仿釉吠梦惮纽寺波飞普振池获川掏粕伐彰妇拎鸦蘑酋趣第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1枝渊沟嚎航箍厩限偏虞泪因尊剔建啄供摧仆符馅橱超际鸟廖丙群乏戳内妆第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（二）干燥（二）干燥 干燥是使物质从从固固体体或或半半固固体体状状经经除除去去存存在在的的水水分或他种溶剂分或他种溶剂，从而获得干燥物品的过程。 水分在干燥的物料中，有三种情况：即表表面面水水、毛毛细细管管中中的的水水与与细细胞胞内内的的水水。表表面面水水很容易通通过过汽汽化化除除去去。毛细管中的水毛
46、细管中的水，由于毛细管壁的作用，较难除去。 细细胞胞内内的的水水由于被细细胞胞膜膜包包围围封封闭闭，如如不不扩扩散散到到膜膜外外则不容易蒸发除去。拣澈画穿憎翼区像坪迪尚竞民料抉掳肾榷饱睹温偏挫撕桓味挛旗渺仙粟苔第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 干干燥燥速速度度在温温度度及及压压力力不不变变的的条条件件下下取决于液液体体到到达表面的速度达表面的速度。 物质在空气中的干燥度，也常称为物质的平平衡衡湿湿度度，在一定条件下是一个不变值。因此，除非改变大气的温度，湿度或压力温度，湿度或压力。 干燥多用加加热热法法进行。常用的方法有膜膜式式干干燥燥、气气流流干干燥燥、减减压压干干燥
47、燥等。此外，冷冷冻冻干干燥燥、喷喷雾雾干干燥燥以及红外线干燥以及红外线干燥等也常选用。骡丰颊幸搓秃展多繁脯车水巾胃哄水裳善三咒粮瘁图业色盒控址驻较姓号第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础11、减压干燥、减压干燥 减减压压干干燥燥是在密闭容器中抽去空气后进行干燥的方法，亦称真空干燥真空干燥。2、喷雾干燥、喷雾干燥 喷喷雾雾干干燥燥是流流化化技技术术用于干燥的最早方法。待干燥的物质先浓缩成一定浓度的液体。由于液体经喷雾后具有极大的表面，故能在很短时间内干燥，使受受热热时时间缩短间缩短，而且干燥物为粉状粉状，不需粉碎即可应用。促扇乳膊瓜损储捆钟犬冒违徘雷伤泽租钱适锐拨货原谍苫殴窄赠
48、沿哟就砰第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1庆颐粮啃臻橙玉登喝致赞震演姬破米男极洪颇婴桨蔽昌绿怔牟吟尧烹湛沼第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础13、冷冻干燥、冷冻干燥 冷冷冻冻干干燥燥是在低低温温、低低压压条条件件下下，利用水水的的升升华华性能性能而进行的一种干燥方法。 在预冻结过程中，制品的预冻有两种方式两种方式： 其一是制品与干燥箱同时降温同时降温； 另一种是待干燥箱搁板降温至40左左右右，再将制品放入。前者相当于慢慢冻冻，后者则介于慢慢冻冻与与速速冻冻之间。之间。 幌幽牛迪抑麦疥狭强泉掠怖膳焊硅林酬釉青辽际锄听千覆港田崇琳童熙韩第二章生物制药工艺技
49、术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 冷冷冻冻干干燥燥机机系系由由制制冷冷系系统统、真真空空系系统统、加加热热系系统统、电电器器仪仪表表控控制制系系统统所所组组成成，主主要要部部件件为为干干燥燥箱箱、凝凝结结器器、冷冷冻冻机机组组、真真空空泵泵组组和和加加热热装装置置等等（图图2 3）。）。拍淹豁苗哎晒晨港央初鸳琵老无菲厌浆纵诡鲍勤穷萍瑰蕉樟搔颂扬搽差炮第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1钓显愿析硬息芦蛇喜宝祈腋谁矗只是伏徐伐饵兰鸵抱豢咋矩页瓶灿验垫众第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1四、生化活性物质的分离与纯化四、生化活性物质的分离与纯化1、生化制药
50、工艺中分离制备方法的、生化制药工艺中分离制备方法的特点特点 生生化化分分离离技技术术包括：生生化化分分离离分分析析和和生生化化制制备备。前者主要对生物体内各组分加以分离后进行定定性性、定定量鉴定量鉴定。 而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分单纯组分。 生物制药工艺中分离制备方法有下列特点分离制备方法有下列特点：（1）生生物物材材料料组组成成非非常常复复杂杂。其中有不不少少化化合合物物迄迄今今还还是是未未知知物物，而且生物活性物质在分分离离进进程程中中仍处处于不断代谢变化中于不断代谢变化中，因此常无固定操作方法可循常无固定操作方法可循。根扎揭俊吸冀娩垃海键滦被劣亚畏茶颤熔炯快养沁湍撰励扭淖
51、躲虞撵它剐第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（2）有些化合物在生物材料中含含量量极极微微，因此分离操作步骤多，不易获得高收率不易获得高收率。（3）生生物物活活性性成成分分离离开开生生物物体体后后，易易变变性性破破坏坏，必须十分小心地保护这些化合物的生生理理活活性性，这也是生物制药中分离、制备的难点分离、制备的难点。（4）生生物物制制药药中中的的分分离离方方法法几几乎乎都都在在溶溶液液中中进进行行，各各种种参参数数（温温度度、pH、离离子子强强度度等等）对对溶溶液液中中各各种种组组分分的的综综合合影影响响常常常常无无法法固固定定，以以致致许许多多实实验验设设计计理理论性不强
52、论性不强。实验结果常常带有很大经验成分经验成分。哉寡措嘻裳狄阅钮棋钻耍合婿体呜大栓捅堤佰纷傀鳞涎刺果灼絮肩舜菠筏第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（5）为了保护目的物的生理活性及结结构构上上的的完完整整性性，生物制药中的分离方法多采用温温和和的的“多多阶阶式式”方方法法进行，即常说的“逐级分离逐级分离”方法方法。（6）生生物物产产品品最最后后均均一一性性的的证证明明与与化化学学上上纯纯度度的的概概念念不不完完全全相相同同，因生物分子对环境反应十分敏感，结结构构与与功功能能关关系系比较复杂，故对其均一性的评估常常是有条件的，只凭一种方法得到的纯纯度度结结论论往往是片面的，甚
53、至是错误的。扛扬陕冤堂涩裙背创冉桨庸猴遗戊女柯浅消隅漂冠吾互滔瞅吏硕咀旗醚谨第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础12、生化制药工艺中分离制备方法的基本原理、生化制药工艺中分离制备方法的基本原理生物大分子分离纯化的主要原理分离纯化的主要原理是：（1）根据分分子子形形状状和和大大小小不同进行分离。如差速离心与超离离心心、膜膜分分离离（透析、电渗析）超超滤滤法法 凝胶过滤法。（2）根据分子电电离离性性质质（带带电电性性）的的差差异异进行分离。如离子交换法、电泳法、等电点聚焦法离子交换法、电泳法、等电点聚焦法。（3）根据分分子子极极性性大大小小及及溶溶解解度度不不同同进行分离。如溶剂
54、提取法、逆流分配法、分配层析法、 盐析法、等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。（4）根据物质吸吸附附性性质质的的不不同同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法吸附层析法。行秃署蜡津统栈米祈撕提托拭汛括氦芯瞎帧框躇旁迪姬滁灌薛腑隙冉壮透第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（5）根据配体特异性配体特异性进行分离亲和层析法亲和层析法。3、分离纯化的基本程序和实验设计、分离纯化的基本程序和实验设计 生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致可分为五个基本阶段五个基本阶段：（1）确定制制备备物物的研研究究目目的的及建立相应的分分析析鉴鉴定定方法方法；（2）制备物的理化性质和稳
55、定性的预备试验理化性质和稳定性的预备试验；（3）材料处理及抽提方法的选择材料处理及抽提方法的选择；茹口枚日令烽挡颈查瓷炎歌催缅扩殷坊丈瘁邱踞埂由字疑苟晨坤内捻汪读第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（4）分离纯化方法的摸索；）分离纯化方法的摸索；（5）产物的均一性测定均一性测定。 提取是分离纯化目的物的第一步，所选用的溶剂应对目的物具有最最大大溶溶解解度度，并尽量减少杂质进入提取液中，为此可调整溶剂的pH、离离子子强强度度、溶溶剂剂成成分配比和温度分配比和温度范围等。 分分离离纯纯化化是生化制备的核核心心操操作作。所以合理的分离纯化方法是根据目目的的物物的的理理化化性性质质
56、与与生生物物学学性性质质依具体实验条件而定。 根据分析和预试验的初步结果，参参考考别别人人对对类类似似物质的分离纯化经验物质的分离纯化经验，也可以少走弯路少走弯路。志邱锅裁饭朝匠余唆饮演向阴孕烽刺捧仓循靳框憋构司惋叼辈镁配卓罢啡第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础14、分离纯化方法步骤优劣的综合评价、分离纯化方法步骤优劣的综合评价 每一个分分离离纯纯化化步步骤骤的的好好坏坏，除了从分分辨辨能能力力和和重现性重现性二方面考虑外，还要注意方法本身的回收率回收率。5、制备物均一性的鉴定、制备物均一性的鉴定 一个制备物是否纯，常以“均均一一性性”表表示示。均均一一性性是指所获得的制备
57、物只具有一种完完全全相相同同的的成成分分。均一性的评价常须经过数种方法的验证数种方法的验证才能肯定。第墒悼性砒驱鳃邵纲瘟珊亮垮杯叠灶僳僳筛肚百吉妊套趁登巷向芳鼻会吭第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 如果某物质所具有的物物理理、化化学学各各方方面面性性质质经过几几种种高高灵灵敏敏度度方方法法的鉴定都是均一的，那么大致可以认为它是均一的。 当然，随随着着更更好好的的鉴鉴定定方方法法的的出出现现，还还可可能能发发现现它它不是均一的。不是均一的。 绝绝对对的的标标准准只有把制备物全部结构搞清楚，并经过人工合成证明具有相同生理活性时，才能肯定制备物是绝对纯净的绝对纯净的。 生物分
58、子纯纯度度的的鉴鉴定定方方法法很多，常用的有溶溶解解度度法法、化化学学组组成成分分析析法法、电电泳泳法法、免免疫疫学学方方法法、离离心心沉沉降降分分析析法法、各各种种色色谱谱法法、生生物物功功能能测测定定法法，以以及及质质谱谱法法等。拌积骸做撩饯掷腕疤标已别杨晾歌悼疯筹稿绩静灼溺责虐款邵讼趟渡妻瓦第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1第二节第二节 微生物制药工艺技术基础微生物制药工艺技术基础、微生物菌种的选育与菌种保藏、微生物菌种的选育与菌种保藏（一）菌种的分离与筛选（一）菌种的分离与筛选1、菌种的分离、菌种的分离 （1）含含菌菌样样品品的的收收集集 根据微生物的生生态态特特
59、点点，从自然界取样，分离取样，分离所需菌种，一般可从土壤中分离土壤中分离。 耿汛辊驶蝶类袍建再膝窘俗迟磋囚配辆肺糟容毛肃浮知川柠毅圾焦弟硝谈第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 （2）富富集集培培养养 收集到的样品若含所需要的菌较多，可直直接接分分离离。若含所需要的菌很少，就需要经经过过富富集集培养培养，使所需要的菌大量生长，以利筛选以利筛选。 再配合控制温度、控制温度、pH或营养成分或营养成分即可达到目的。 （3）菌菌种种的的纯纯化化 在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生长，所以要进行分离，以获得纯种。 菌种纯化的方法一般采用稀释分离法或划线分离法采用稀释分离法或划线分
60、离法。 2、菌种的筛选、菌种的筛选 筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象筛选的对象。玲沟榴洞篆乒叁晶散市局义案颠屈屹渴褂捂矢越咒叮剂应族勾域行烦滔桑第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（二）菌种的选育与保藏（二）菌种的选育与保藏1、菌株的选育、菌株的选育 发酵生产，从自然界直接分离到的菌种，都不能适合实际生产需要。只有通过诱诱变变、选选育育才能使产量成倍、成百倍成倍、成百倍地提高。（1）自然选育）自然选育 自自然然选选育育是是一一种种纯种选选育育的的方方法法。它利用微生物在一定条件下产生自自发发突突变变的的原原理理，通过分离、筛选排排除除衰衰变变型型菌菌落落，从中选择维持
61、原有生产水平的菌株。因此，它能达到纯化、复壮菌种纯化、复壮菌种，稳定生产的目的。 自然选育一般包括单单孢孢子子悬悬浮浮液液的的制制备备、分分离离及及单单菌落培养、筛选菌落培养、筛选等操作过程。机也物货酒铅拳渠侦窝砖匠泼毯扑派戍脸冬铅惟筐软横猿瑚太辈冗扰矗诀第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（2）诱变育种）诱变育种 诱诱变变育育种种是指有意识地将生物体暴露于物物理理的的、化化学学的的或或生生物物的一种或多多种种诱诱变变因因子子，促使生物体发发生生突突变变，进而从突变体中筛筛选选具有优良性状的突变株的过程。 出发菌株的选择出发菌株的选择 出发菌株是用于诱变的原始菌株，选择出发
62、菌株时，应考虑以下问题： a、出出发发菌菌株株的的稳稳定定性性，尽量挑选纯纯系系菌菌株株，以排除异异核核体体系系与与异异质质体体菌菌株株，因此对选定的出发菌株常需通过自然选育进一步纯化自然选育进一步纯化；爷窟四秧搞昔诵晴储铰汾陶痈窍貌斟臀咨蕾籽臼挞警锚丑华塔谈嘛嗡侠迹第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 b、选用具备某种优良特性的菌株优良特性的菌株。 c、拟选对诱变剂敏感诱变剂敏感的菌株，以提高突变频率突变频率； d、菌种的生生理理状状态态及及生生长长发发育育时时间间，因为诱变剂对处于转转录录状状态态或或翻翻译译状状态态的的菌菌种种效效应应要比静止状态或休眠状态的菌种敏感得
63、多。 一般细菌处于营营养养体体，比处于对对数数生生长长期期的菌体为佳。真真菌菌和和放放线线菌菌则以它们的孢孢子子，或处于刚开始萌发状态萌发状态的孢子为佳。 为了保证菌体和诱诱变变剂剂均均匀匀接接触触，出发菌株都必须制备成单单细细胞胞（孢孢子子）悬悬浮浮液液，严格控制单孢子的分散度在分散度在95以上。以上。危洞默夹膘卒葬告蜗累语辨五柏延危脆估缀躯齐掺胞介桑思这跌灼码村氏第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 诱变处理诱变处理 能够提高生物体突突变变频频率率的物质称为诱诱变变剂剂。目前使用的诱变剂可分为物物理理诱诱变变因因子子、化化学学诱诱变变剂剂和和生物诱变因子生物诱变因子三大
64、类。 多次反复用同一种诱变因子处理易出现“饱饱和和”或或回回复复突突变变现现象象，因此常采用多种不同的诱诱变变因因子子或或复合因子诱变。复合因子诱变。 a、物物理理诱诱变变：物理诱变因子主要包括紫紫外外线线（UV）、射射线线、射射线线、快快中中子子（FN）、射射线线、超声波、激光超声波、激光等，其中以紫外线辐照使用最为普遍。 近年来用离子束注入细胞技术离子束注入细胞技术进行诱变育种。丙啥硫瓮允搏伟碗糠朱阉慈凭局殃杨醋靴将艰坏课散俄宿荔悟韶业谁谋涩第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 b、化化学学诱诱变变：化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质
65、。 化学诱变剂据其与DNA作用方式作用方式不同有3类： 烷烷化化剂剂如氮介、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基脲、亚硝酸等，它们与与DNA碱碱基基起反应起反应，引起碱基配对的转换碱基配对的转换而发生遗传变异遗传变异；欠妆坚鹿源跑槽嫌涤颖钧哺辗帆敛躬乒优褒谩矾终舰姆喇作惶诬锋酣昧绣第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 碱碱基基类类似似物物，它们掺入到DNA分子中而导致遗传变异如5溴溴尿尿嘧嘧啶啶（5BU）、5氟氟尿尿嘧嘧啶啶（5FU）等； 移移码码诱诱变变剂剂如吖吖啶啶黄黄、吖吖啶啶橙橙等。它们可插入DNA双螺旋的邻近碱基对之间造成碱基的插插入入或或缺缺失失导致转录和
66、翻译转录和翻译的移码突变移码突变。稚岔推寞斌状淄憎铁私富歇霉富颓娘椒洒帚蘑娠匀迷舌牙居室泥鳃纪范儡第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 c、生生物物诱诱变变：噬菌体可作为诱变剂应用于抗噬菌体菌种的选育，其作作用用原原理理可能与传传递递遗遗传传信信息息，诱诱发抗性突变发抗性突变有关。 诱诱变变剂剂量量的选择能够提提高高正正变变株株获获得得率率的诱变剂量即为最适剂量，一般情况下，诱变处理后的细胞死亡率越高，活下来的细胞的突变率也越高，故可用死死亡率作为相对剂量亡率作为相对剂量。 在自动化程度高的大规模筛选中，常常采采用用死死亡亡率率在9099.9的高剂量的高剂量， 小规模的人工
67、筛选，一般采用死死亡亡率率7090的低剂量， 也有报道采用死亡率4060的更低剂量。警隅育郑锣拭九鳃纫疗颤缝跳弧浚衅兰部鼠像坷除爷挤矫疫希桥吱秉塌扇第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 增增变变剂剂的使用，氯氯化化锂锂本身并无诱变作用，但在抗生素产生菌的诱变育种中表明氯化锂与一些诱变因子具有协同作用具有协同作用。 氯氯化化锂锂使使用用剂量一一般般为为0.5，处处理理方方法法多多是是后后处处理理，即即加加在在平平板板培培养养基基中中，在在菌菌种种的的生生长长发发育育过过程程中发生作用。中发生作用。压支郊绘拓颁映照圈盛动扰踢咀秧度诉地腹预搏猿榜拈低拒慧横烧具珍御第二章生物制药工
68、艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 突变株的筛选突变株的筛选 a、随随机机筛筛选选：随机筛选指菌种经诱变处理后，凭经验随机选择一定数量的菌落，其中包括未未发发生生突突变变的的野野生生型型菌菌株株和和发发生生突突变变后后的的正正向向及及负负向向突突变变株株，再进行摇瓶筛选摇瓶筛选。 b、半半理理性性化化筛筛选选：近年来，随着遗传学、生物化学知识的积累，人们对多种抗抗生生素素生生物物合合成成途途径径及代代谢谢调调控控机机制制的了解不断深入，抗生素产生菌的推推理理选选育育技技术术应运而生、即根据已知的或可可能能的的生生物物合合成成途途径径、代代谢谢调调控控机机制制和产产物物分分子子结结构构来设
69、计筛选方法，以打破微生物原有的代代谢谢调调控控机机制制，获得能大量形成产物的高产突变株高产突变株。临岸擦玖盾咋谷筐敦聊烈胆浪蛰佣绰过吻押剃储螺食露堆牧貉悯蛮汹楞瞒第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（3）现代菌种选育技术）现代菌种选育技术 杂交育种杂交育种 杂杂交交育育种种一般指将两个基因型不同的菌株通通过过接接合合使使遗遗传传物物质质重重新新组组合合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 杂杂交交育育种种是选用已已知知性性状状的供体菌株和受体菌株作为亲本亲本，把不同菌株的优良性状集中于重组体中优良性状集中于重组体中。 因此杂交育种具有定定向向育育种种的的性性质质。杂交育种
70、使得遗传物质重重新新组组合合，扩扩大大了了变变异异范范围围，改改善善了了产产品品质量和产量。质量和产量。咆迅升棒舆荷蚕来奏履丸充抿拄陋壳圃川敬浅内纶害漾炮柔龚烽墨侮鲍灵第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 原生质体融合原生质体融合 用脱脱壁壁酶酶处理将微生物细细胞胞壁壁除除去去，制成原原生生质质体体，再用聚聚乙乙二二醇醇（PEG）促促进进原原主主质质体体发发生生融融合合，从而获得融合子融合子，这一技术叫原生质体融合原生质体融合。 原生质体融合的重重组组频频率率高高于于普通杂交方法，并实现了种间、属间的融合，为为亲亲缘缘关关系系较较远远的的、性性能能差差别较大菌株实现杂交别较
71、大菌株实现杂交，开辟了一条有效的途径有效的途径。获倚坷殃岛耀纪律剥攫免段玖乒蚂镀丰狡妨拼物汽辅陇删危呜回伺丹巫祭第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 基因工程技术基因工程技术 基因工程技术可完成超超远远缘缘杂杂交交，是将某一生物体（供体）的遗传信息在体外经人人工工与与载载体体相相接接（重重组组），构成重重组组DNA分分子子，然后转入另一微生物体（受体）细胞中，使外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传表达和遗传。 所以基因工程是在分子生物学理论指导下的一种自觉的、能像工程一样可可事事先先设设计计和和控控制制的的育育种种技术。技术。赐遮掸灌蜡草党汉右犬碑勺厘屉酚敛牡义雕幼波融泡
72、挛大陡植畸崖盖舅敏第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础12菌种的保藏菌种的保藏（1）菌种的退化与防止）菌种的退化与防止 退退化化意味着随时间的推移菌种的一一个个或或多多个个特特性性逐步减减退退或或消消失失。一般把菌株的生生活活力力、产产孢孢子子能能力力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化退化。 菌株的遗传性状是稳定的，但是也可能发生突变可能发生突变。因此，可以在基因型改变基因型改变的情况下引起菌种退化菌种退化。 在传代过程中回复突变传代过程中回复突变的数量逐步取得优势的过程，也就是菌种退化菌种退化的过程。所以基因突变可以使原原来纯的菌株变为不纯来纯的菌株变为不纯，不纯菌株在传
73、代过程中不断增不断增加比例加比例，从而导致群体的退化群体的退化。腆跌接担桑产牛茶坏丝坎咐怎与晌岗卿虞囊底铜腮戳令妓淡习囊孰笆世刊第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 菌种退化现象的综合比较鉴别比较鉴别是： 单位容积中发酵液的活性物质含量活性物质含量； 琼脂平皿上的单菌落形态单菌落形态； 不同培养时期菌体细胞的形形态态和和主主要要遗遗传传特特征征，如形成孢子能力孢子能力； 发酵过程的pH变动情况变动情况； 发酵液的气味、色泽气味、色泽。兴卷辞硅唱聘苹棺搂貌建咽改揍拟涨翁缔棕唆改侧枪帜粕自页绣洒晴姥鼓第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 菌种退化问题十分复杂
74、，对其规律尚缺乏了解。所以，只能提供一些原则性防止措施原则性防止措施。 防防止止基基因因突突变变，基基因因突突变变是菌种退化的一个重要原因，应用低温保藏法低温保藏法可以减少突变的发生； 采采用用双双重重缺缺陷陷型型，利用营养缺陷型作为生产菌株时，回回复复突突变变可导致产量下降，采用双重缺陷标志可间接而有效地防止突变； 制制定定科科学学管管理理制制度度，使用菌种时大大批批制制作作平平行行的菌种斜面的菌种斜面，少转接传代少转接传代； 分分离离单单菌菌落落，在建立新菌株和使用过程中认真进行单菌落分离，再多制作平行的菌种斜面平行的菌种斜面；钒锚抵丘举作卑漾蕾定塘普势宝谤箩掂蒙勿哈循父割怂草筋景曙区羚乓
75、猩第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 选选择择培培养养条条件件，选择有利高产菌株而不利于低产菌株的培养条件培养条件。（2）常用的菌种保藏法）常用的菌种保藏法 微生物菌种在多多次次传传代代中，会发生遗遗传传性性的的变变异异，而且退化性的变异是大大量量的的，所以微生物菌种应妥善保保藏藏，使之能长长期期保保持持存存活活、不不退退化化，便于生生产产和和科科研研使用。 菌菌种种保保藏藏的的原原理理是根据菌种的生生理理、生生化化特特点点，创造条件使菌体的代谢处于不活泼的状态代谢处于不活泼的状态。导蚜是分景棺到斤套茁容禁斑扬牢戮缄戴桌线妈脸炸思勤柄攀形拄健橇遏第二章生物制药工艺技术基础
76、1第二章生物制药工艺技术基础1 保藏时，先挑选优优良良的的纯纯种种，最好是选取它们的休休眠眠体体（孢孢子子、芽芽孢孢等），然后创造一个最有利于休眠的环境条件（如低低温温、干干燥燥、缺缺氧氧和和缺缺乏乏营营养养物物质质等等），以降降低低菌菌种种代代谢谢活活动动的速度，达到延延长长保保存存期期的目的。 一种较好的保保藏藏方方法法，首先要求能较较长长期期地保存原有菌种的优优良良特特性性，但也要考虑方法本身的经济简便。眺郝飞崖峡择翻兵钟弘列向州知瓣唱钦芒辛疮吾洞柠活移堡衬链蹬坑络舰第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 斜斜面面低低温温保保藏藏法法。斜面低温保藏法是最早使用的而且现今
77、仍然普遍采用的方法。 具体方法是将菌种接种于所要求的斜斜面面培培养养基基上，置最适温度下培养，待得到健壮的菌体后，放在4左左右右，湿湿度度小小于于70的条件下保藏，每每间间隔隔一一定定时时间间重新移植培养1次。 一一般般，细菌每每月月移植一次，放线菌每3个个月月移植一次，酵酵母母菌菌每46个个月月移植一次，丝丝状状真真菌菌每4个个月移植月移植一次。 保存期间应注意冰箱温度，不能波动太大，切切忌忌保保存存在在0以以下下，否则培培养养基基会会结结冰冰脱脱水水，造成菌菌种种性能性能的衰退。喉很省篡联辫街劲经观亭暗春尤种恕井帚溯恶蝗叁洁易泵防你旱啸哪碘黍第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技
78、术基础1 液液体体石石蜡蜡封封藏藏法法。在长好菌苔的斜面试管中，加加入入灭灭过过菌菌的的液液体体石石蜡蜡，可防止或减少培养基内水水分分蒸蒸发发，隔绝培养物与氧氧的的接接触触，从而降低微生物的代代谢谢活活动动，推迟细胞老化，延长了保保存存时时间间。适用于不能利用石蜡油作碳源不能利用石蜡油作碳源的微生物的保藏。 方方法法为为选选用用优质纯净无色中性的液体石蜡，经121加加压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌30min，然后在150170烘烘箱箱中干燥中干燥12h，使水汽蒸发，石蜡油变清石蜡油变清。 再按无菌操作将灭菌的石蜡油注入长好菌苔的斜面试管中，液面高出斜面液面高出斜面1cm。愧来容间峙嚼愧沂澜抠苛幂益愚惦特
79、午强恨峙蔡凯绝想阀诛讥莽盆津无前第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 冷冷冻冻干干燥燥保保藏藏法法。冷冻干燥保藏法是在较低的温度下（15以以下下），快快速速地地将将细细胞胞冻冻结结，并且保持细胞完整细胞完整，然后在真空中使水分升华真空中使水分升华。 为防防止止冻冻结结和和水水分分不不断断升升华华对细胞的损害，采采用用保保护剂护剂来制备细胞悬液。 常将菌种悬悬浮浮于于脱脱脂脂消消毒毒牛牛奶奶中，快快速速冷冷冻冻，真真空空干干燥燥，经过冷冻干燥的微生物的生生长长和和代代谢谢活活动动处处于于极极低低水水平平，因此菌种可以保存很长时间，一一般般5l0年，最多可达年，最多可达15年之
80、久。年之久。 真空冷冻干燥保藏法是目前保存菌种的一种比比较较好的方法。好的方法。淑凄劣疯烬坯致葫知莽阳汇盒行极膳拥论粳据映目恼幢闷暂费介埋励瓦炼第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 微生物在130的的低低温温下下，所有的代代谢谢活活动动暂暂时时停止而生命延续停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。 可通过加加入入保保护护剂剂来降低细细胞胞内内溶溶液液的的冰冰点点，减少冰冰晶晶对细胞的伤害。其方法是以以510的的甘甘油油或或二二甲甲亚亚砜砜（DMSO）制制成成孢孢子子悬悬液液或或菌菌悬悬液液，浓度以大大于于108为为宜宜。将此悬液注入无菌的安
81、瓿管或聚丙烯小管内，密封。采用专用冷冷冻冻温温度度控控制制仪仪以每每1min降降低低1的的速速度度，从从0降降到到35，然后取出直直接接放放入入液液氮氮中中。保藏的菌种如需用时，将安瓿管由液氮中取出，立立即即置置于于3840温温水水浴浴中中，振荡，直到全全部部融融化化为止，开启移种。此法是目前最最可可靠靠的的一一种种长长期期保存菌种的方法。保存菌种的方法。蒋辩愚骑物奋葵镐儡镑服该逾敌倘缘位致牧火穴恿解垦梳奴室甭锗页摩蠢第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 甘甘油油冷冷冻冻保保藏藏法法。将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15消消毒毒甘甘油油、混匀速冻，冻存于7080，可保存
82、保存35年年。 其他干燥保藏法其他干燥保藏法 保藏微生物菌种最关键的要点是干干燥燥、隔隔氧氧、低低温、避光温、避光。 单就干燥原理将微生物细胞或孢子附着在一种基物上进行干燥，然后加以保存。 例如用沙、土或沙土混合，明胶、硅胶、滤纸、麸皮、陶瓷玻璃珠等作作附附着着剂剂或或载载体体粘连上细胞，干燥后保存。最常用的如沙土保藏法沙土保藏法。怔荧嘴乏桨倡打辈架遥与贫观鲤漏借终琅谢澎猛蜗瘤酣舍芋俯颅枯颐亮歉第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 沙土管保藏法的操作如下： 取细沙除去有有机机杂杂质质及及铁铁屑屑，过4060目目筛筛；取庭园土过过100120目目筛筛，洗净。将细细土土与与沙沙
83、按按1：2（质质量量百百分分比比）混混合合，分装入小管内约2cm高，加棉塞，于121灭菌灭菌lh，间歇灭菌间歇灭菌35次。次。 将菌菌苔苔已长好的斜面，注入无菌水35ml，用接种针轻轻将菌苔刮下，制成菌悬液，接接种种0203ml菌悬液入沙土管中，然后放在装有干燥剂（如无无水水氯氯化化钙钙）的真空干燥器中，接通真空泵，抽干（一般46h即可抽干，管内沙土成松散状）。干燥后的沙沙土土管管放放在在干干燥燥器器内内置置4冰冰箱箱中中保保存存。此法适用于产产孢孢子子的的微微生生物物，也是保保存存抗抗生生素素产产生生菌菌常用的方法。其缺点是存活率低，变异率高存活率低，变异率高。芽对凛荆偿徘抱侠究戈柑乞椿装腊
84、经友湿毋伞津委钮纯乙撰惦泵位涟刹萨第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1（3）菌种保藏的注意事项）菌种保藏的注意事项 在整个保存处理过程中要防防止止杂杂菌菌污污染染，并一定要做无菌检查无菌检查； 保藏所用的菌种要在新鲜的斜面上生生长长丰丰满满，生生长时间不宜过长长时间不宜过长； 保藏过程中要防防止止菌菌种种退退化化现现象象的的发发生生，及时采用有效方法复壮，传代次数过多容易退化有效方法复壮，传代次数过多容易退化； 菌菌种种制制备备过程是保持菌种优良特性的一个重要环节。接接种种斜斜面面不不宜宜过过密密，接接种种量量必必须须控控制制适适当当，使菌落能充分生长好。饲囊棱沁顺铝饲鸡愤
85、减斗转陆酵和井吼庐抛辕绽历解拭峙坐毅嗡榔搏惊慷第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1二、微生物的培养二、微生物的培养（一）微生物生长的六大营养要素（一）微生物生长的六大营养要素 微生物要维持其正常生命活动，必须从外界环境中不断摄摄取取必必需需的的能能量量和和物物质质，凡具营养功能的物质称为营营养养物物，光光可提供光能自养微生物的能能源源，故也属于某些微生物的营养物营养物。 1、碳源、碳源 凡能提供微生物营养所需碳碳元元素素（有机物的碳架）的营养源，称为碳碳源源。微生物可可利利用用的的碳碳源源是生物界中最广的最广的。丫仇詹馁伟诊肖伍牲捏媚赫场坍撵橡粘储阮狸夷糕西赡苫门茄吞币矽履锄第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1 2、氮源、氮源 凡能提供微生物生长繁殖所需氮氮元元素素的营养源，称为氮氮源源。与碳源谱相似，微生物能利用的氮氮源源类类型即氮源谱型即氮源谱也是生物界最为广泛的。 3、能源、能源 凡能为微生物的生命活动提供最最初初能能量量来来源源的的营营养养物物或或辐辐射射能能称称为为能能源源。由于各种异异养养微微生生物物的能源就是其碳源就是其碳源，故其能源谱能源谱就显得十分简单：惊盂甄鹅奇蔼蹲邪玖姆记荷螺专参枷己捷阿卖掂疡密纪拓偏绎生彝痘桅艇第二章生物制药工艺技术基础1第二章生物制药工艺技术基础1
