基因组测序学习教案

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1、会计学1基因组测序基因组测序第一页，共81页。4 4 基因组测序基因组测序4.1 4.1 基因组测序的方基因组测序的方法法(fngf)(fngf)DNADNA测序是在核酸酶学和生物化学的基础上，测序是在核酸酶学和生物化学的基础上，创立并发展起来的一门重要的创立并发展起来的一门重要的DNADNA技术技术(jsh)(jsh)学。这门技术学。这门技术(jsh)(jsh)对于从分子水平上研究对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆基因的结构与功能的关系，以及克隆DNADNA片段片段的操作方面，都具有十分重要的实用价值。的操作方面，都具有十分重要的实用价值。第1页/共80页第二页，共81页。

2、DNADNA测序的两种方法：测序的两种方法： 链终止法（链终止法（the chain termination the chain termination methodmethod） 单链单链DNADNA分子的序列由与之互补的多核苷酸链的酶促合成分子的序列由与之互补的多核苷酸链的酶促合成(hchng)(hchng)来判定，互补链在某一特定的核苷酸位置终止。来判定，互补链在某一特定的核苷酸位置终止。 化学降解法（化学降解法（chemical degradation chemical degradation methodmethod）双链双链DNADNA分子被化学物质修饰后，在特定核苷酸位置被切分子

3、被化学物质修饰后，在特定核苷酸位置被切开，从而确定开，从而确定DNADNA分子的序列。分子的序列。 4 4 基因组测序基因组测序4.1 4.1 基因组测序的方基因组测序的方法法(fngf)(fngf)第2页/共80页第三页，共81页。Sanger Sanger 双脱氧链终止双脱氧链终止DNADNA测序法：测序法： 利用利用DNADNA聚合酶聚合酶和双脱氧链终止物测定和双脱氧链终止物测定DNADNA核苷酸顺序的方法，核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥是由英国剑桥(jin (jin qio)qio)分子生物学实验室分子生物学实验室的生物化学家的生物化学家F. SangerF. Sanger等人于等人于

4、19771977年发明的。年发明的。19801980年诺贝尔奖金获得者年诺贝尔奖金获得者F. SangerF. Sanger第3页/共80页第四页，共81页。Sanger Sanger 双脱氧链终止双脱氧链终止DNADNA测序测序法的基本原理：法的基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的长度只差一个核苷酸的DNADNA分分子。子。 利用利用DNADNA聚合聚合(jh)(jh)酶不能够酶不能够区分区分dNTPdNTP和和ddNTPddNTP的特性，使的特性，使ddNTPddNTP参入到寡核苷酸链的参入到寡核苷酸链的3-3-末端。因为末端。因为ddNTP

5、3ddNTP 3不不是是-OH-OH，不能与下一个核苷酸，不能与下一个核苷酸聚合聚合(jh)(jh)延伸，从而终止延伸，从而终止DNADNA链的增长。链的增长。第4页/共80页第五页，共81页。技术技术技术技术(jsh)(jsh)(jsh)(jsh)路线与要求路线与要求路线与要求路线与要求制备单链模板制备单链模板制备单链模板制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火将单链模板与一小段引物退火将单链模板与一小段引物退火将单链模板与一小段引物退火 加入加入加入加入(jir)DNA(jir)DNA(jir)DNA(jir)DNA多聚酶多聚酶多聚酶多聚酶4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸

6、种脱氧核苷酸分别加入分别加入分别加入分别加入(jir)(jir)(jir)(jir)少量少量少量少量4 4 4 4种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸 将将将将4 4 4 4种反应产物分别在种反应产物分别在种反应产物分别在种反应产物分别在4 4 4 4条泳道电泳条泳道电泳条泳道电泳条泳道电泳 根据根据根据根据4 4 4 4个碱基在个碱基在个碱基在个碱基在4 4 4 4条泳道的终止位置读出基因序列条泳道的终止位置读出基因序列条泳道的终止位置读出基因序列条泳道的终止位置读出基因序列 第5页/共80页第六页，共81页。在每一反应试管中，都加在每一反应试管中，都加入一种互不相同的入

7、一种互不相同的ddNTPddNTP和和全部全部4 4种种dNTPdNTP，其中，其中ddNTPddNTP带有带有32P32P同位素标记。反应同位素标记。反应混合物样品加在聚丙烯酰混合物样品加在聚丙烯酰胺凝胶中，按片段大小进胺凝胶中，按片段大小进行电泳分离。谱带的判读行电泳分离。谱带的判读是从胶的底部开始，所得是从胶的底部开始，所得的核苷酸碱基顺序，与模的核苷酸碱基顺序，与模板板(mbn)(mbn)链为互补链。链为互补链。第6页/共80页第七页，共81页。链终止法对链终止法对链终止法对链终止法对DNADNADNADNA多聚酶的要求多聚酶的要求多聚酶的要求多聚酶的要求(yoqi)(yoqi)(yo

8、qi)(yoqi)高酶活性高酶活性高酶活性高酶活性 保证不会反应保证不会反应保证不会反应保证不会反应(fnyng)(fnyng)(fnyng)(fnyng)提前终止提前终止提前终止提前终止无无无无5 35 35 35 3外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性 保证不切除新合成链的保证不切除新合成链的保证不切除新合成链的保证不切除新合成链的5555端，改变链长度，给读序造成误差端，改变链长度，给读序造成误差端，改变链长度，给读序造成误差端，改变链长度，给读序造成误差无无无无3 53 53 53 5外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性保证不切除新合成链的保证不切除新合成链的保证不切除新合成链

9、的保证不切除新合成链的3333端，改变链长度，给读序造成误差端，改变链长度，给读序造成误差端，改变链长度，给读序造成误差端，改变链长度，给读序造成误差第7页/共80页第八页，共81页。测序的测序的DNADNA多聚酶多聚酶目前目前目前目前(mqin)(mqin)(mqin)(mqin)普遍采用的测序酶为普遍采用的测序酶为普遍采用的测序酶为普遍采用的测序酶为Sequenase, Sequenase, Sequenase, Sequenase, 来自来自来自来自T7T7T7T7噬菌噬菌噬菌噬菌体体体体第8页/共80页第九页，共81页。n n将将将将DNADNADNADNA克隆到质粒载体克隆到质粒载体

10、克隆到质粒载体克隆到质粒载体n n这种方法是获得测序模板这种方法是获得测序模板这种方法是获得测序模板这种方法是获得测序模板DNADNADNADNA最常用最常用最常用最常用(chn yn)(chn yn)(chn yn)(chn yn)的方法。的方法。的方法。的方法。n n获得的获得的获得的获得的DNADNADNADNA通过热变性或者碱变性转变为单链通过热变性或者碱变性转变为单链通过热变性或者碱变性转变为单链通过热变性或者碱变性转变为单链DNADNADNADNA进行测序。进行测序。进行测序。进行测序。n n优点：可双向测序。优点：可双向测序。优点：可双向测序。优点：可双向测序。n n缺点：样品可

11、能有少量细菌的缺点：样品可能有少量细菌的缺点：样品可能有少量细菌的缺点：样品可能有少量细菌的DNADNADNADNA或者或者或者或者RNARNARNARNA污染，会干扰测序。污染，会干扰测序。污染，会干扰测序。污染，会干扰测序。链终止反应要求链终止反应要求(yoqi)(yoqi)单链作为模板单链作为模板如何如何(rh)(rh)得到单链得到单链DNA DNA ？第9页/共80页第十页，共81页。将将将将DNADNADNADNA克隆克隆克隆克隆(k ln)(k ln)(k ln)(k ln)到到到到M13M13M13M13噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体n nM13M13M13M13噬菌体

12、载体是专噬菌体载体是专噬菌体载体是专噬菌体载体是专 为得到单链为得到单链为得到单链为得到单链DNADNADNADNA测序模板而设计的。测序模板而设计的。测序模板而设计的。测序模板而设计的。n nM13M13M13M13噬菌体本来含有单链噬菌体本来含有单链噬菌体本来含有单链噬菌体本来含有单链DNADNADNADNA基因组，感染基因组，感染基因组，感染基因组，感染(gnrn)(gnrn)(gnrn)(gnrn)大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌的的的的M13M13M13M13可转变为双链复制型。可转变为双链复制型。可转变为双链复制型。可转变为双链复制型。 M13 M13 M13 M13噬菌体载体是双

13、链的，相噬菌体载体是双链的，相噬菌体载体是双链的，相噬菌体载体是双链的，相当于当于当于当于M13M13M13M13噬菌体的复制型。噬菌体的复制型。噬菌体的复制型。噬菌体的复制型。n n用含有待测序片段的用含有待测序片段的用含有待测序片段的用含有待测序片段的M13M13M13M13噬菌体载体感染噬菌体载体感染噬菌体载体感染噬菌体载体感染(gnrn)(gnrn)(gnrn)(gnrn)大肠杆菌，大肠杆菌，大肠杆菌，大肠杆菌，大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链DNADNADNADNA基因组。基因组。基因组。基因组。

14、n n缺点：只能用于短片段缺点：只能用于短片段缺点：只能用于短片段缺点：只能用于短片段DNADNADNADNA，大于，大于，大于，大于3kb3kb3kb3kb的片段在克隆过程中会的片段在克隆过程中会的片段在克隆过程中会的片段在克隆过程中会发生缺失和重排。发生缺失和重排。发生缺失和重排。发生缺失和重排。第10页/共80页第十一页，共81页。将将将将DNADNADNADNA克隆克隆克隆克隆(k ln)(k ln)(k ln)(k ln)到噬粒到噬粒到噬粒到噬粒n n这是一种改造过的质粒克隆载体，含有两个复制起点，一这是一种改造过的质粒克隆载体，含有两个复制起点，一这是一种改造过的质粒克隆载体，含有

15、两个复制起点，一这是一种改造过的质粒克隆载体，含有两个复制起点，一个是质粒自身个是质粒自身个是质粒自身个是质粒自身(zshn)(zshn)(zshn)(zshn)的复制起点，一个是单链的复制起点，一个是单链的复制起点，一个是单链的复制起点，一个是单链DNADNADNADNA噬菌噬菌噬菌噬菌体基因组的复制起点，当大肠杆菌细胞中同时含有噬粒和体基因组的复制起点，当大肠杆菌细胞中同时含有噬粒和体基因组的复制起点，当大肠杆菌细胞中同时含有噬粒和体基因组的复制起点，当大肠杆菌细胞中同时含有噬粒和辅助噬菌体时，因为辅助噬菌体携带的编码噬菌体复制酶辅助噬菌体时，因为辅助噬菌体携带的编码噬菌体复制酶辅助噬菌体

16、时，因为辅助噬菌体携带的编码噬菌体复制酶辅助噬菌体时，因为辅助噬菌体携带的编码噬菌体复制酶和衣壳蛋白的基因可以激活噬菌体和衣壳蛋白的基因可以激活噬菌体和衣壳蛋白的基因可以激活噬菌体和衣壳蛋白的基因可以激活噬菌体DNADNADNADNA的复制产生含单链的复制产生含单链的复制产生含单链的复制产生含单链的噬粒噬菌体。的噬粒噬菌体。的噬粒噬菌体。的噬粒噬菌体。n n优点：克隆片段可达优点：克隆片段可达优点：克隆片段可达优点：克隆片段可达10kb10kb10kb10kb以上。以上。以上。以上。第11页/共80页第十二页，共81页。PCRPCRPCRPCR产生产生产生产生(chnshng)(chnshng

17、)(chnshng)(chnshng)单链单链单链单链DNADNADNADNA第12页/共80页第十三页，共81页。引物决定模板引物决定模板引物决定模板引物决定模板(mbn)(mbn)(mbn)(mbn)链的测序起点链的测序起点链的测序起点链的测序起点第13页/共80页第十四页，共81页。Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学降解法：化学降解法：化学修饰化学修饰DNADNA测序法，是美国哈佛大学的和于测序法，是美国哈佛大学的和于19771977年发明的。年发明的。化学降解法主要化学降解法主要(zhyo)(zhyo)用于测定短片段用于测定短片段DNADNA的序列。的序列。Max

18、am-GilbertMaxam-Gilbert化学降解法的原理：化学降解法的原理：用化学试剂处理末端放射性标记的用化学试剂处理末端放射性标记的DNADNA片段，造成碱基片段，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有各种不同的特异性切割。由此产生的一组具有各种不同(b (b tn)tn)长度的长度的DNADNA链的反应混合物，经凝胶电泳和放射自链的反应混合物，经凝胶电泳和放射自显影后，直接读出待测显影后，直接读出待测DNADNA片段的核苷酸顺序。片段的核苷酸顺序。第14页/共80页第十五页，共81页。碱基特异碱基特异(ty)(ty)的化学切割的化学切割反应反应碱基碱基特异修饰方法特异修饰方法G

19、GPh8.0,Ph8.0,用硫酸二甲酯对用硫酸二甲酯对 N7N7进行甲基化进行甲基化, ,使使 C8-C9C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性键对碱基裂解有特殊敏感性A+GA+GpH2.0 pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的哌啶甲酸可使嘌呤环的N N原子化原子化, ,从而从而导致脱嘌呤导致脱嘌呤, ,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键糖苷键C+TC+T肼可打开嘧啶环肼可打开嘧啶环, ,后者重新环化成五元环后后者重新环化成五元环后易除去易除去C C1.5mol/L NaCl1.5mol/L NaCl存在时存在时, ,可用肼除去胞嘧啶可用肼除去胞嘧啶第15页/共80页第十六页，

20、共81页。技术技术(jsh)(jsh)路线路线 将双链将双链将双链将双链DNADNADNADNA样品变为单链样品变为单链样品变为单链样品变为单链 每个单链的同一方向每个单链的同一方向每个单链的同一方向每个单链的同一方向(fngxing)(fngxing)(fngxing)(fngxing)末端都用末端都用末端都用末端都用放射性同位素标记放射性同位素标记放射性同位素标记放射性同位素标记, , , ,以便显示以便显示以便显示以便显示DNADNADNADNA条带条带条带条带 分别用不同方法处理分别用不同方法处理分别用不同方法处理分别用不同方法处理, , , ,获得只差一个核苷酸获得只差一个核苷酸获得

21、只差一个核苷酸获得只差一个核苷酸的降解的降解的降解的降解DNADNADNADNA群体群体群体群体 电泳电泳电泳电泳, , , ,读取读取读取读取DNADNADNADNA的核苷酸顺序的核苷酸顺序的核苷酸顺序的核苷酸顺序第16页/共80页第十七页，共81页。化学法测序化学法测序第17页/共80页第十八页，共81页。化学修饰法的测序过程化学修饰法的测序过程（a a）利用）利用32P32P标记标记DNADNA片段的末端；片段的末端；（b b）将）将32P32P末端标记的末端标记的DNADNA片段分成片段分成(fn (fn chn)4chn)4个反应管，进行化学切割反应；个反应管，进行化学切割反应；（c

22、 c）在聚丙烯酰胺测序胶上电泳，经放射自）在聚丙烯酰胺测序胶上电泳，经放射自显影，根据带谱可读出相应的序列。显影，根据带谱可读出相应的序列。第18页/共80页第十九页，共81页。DNA DNA 序列分析自动化包括序列分析自动化包括(boku)(boku)两个方面的两个方面的内容，一方面是指内容，一方面是指“分析反应分析反应”的自动化，另的自动化，另一方面是指一方面是指“读片过程读片过程”的自动化。的自动化。自动化的自动化的DNA DNA 序列分析，也是根据序列分析，也是根据Sanger Sanger 双脱双脱氧链终止氧链终止DNADNA测序法的基本原理发展起来的。测序法的基本原理发展起来的。高

23、通量自动化测序高通量自动化测序 第19页/共80页第二十页，共81页。自动化测序原理自动化测序原理自动化测序原理自动化测序原理(yunl)(yunl)(yunl)(yunl)自动化测序类似于自动化测序类似于自动化测序类似于自动化测序类似于PCRPCRPCRPCR反应，但只用一反应，但只用一反应，但只用一反应，但只用一条引物，反应混合物中含有不同荧光条引物，反应混合物中含有不同荧光条引物，反应混合物中含有不同荧光条引物，反应混合物中含有不同荧光标记的标记的标记的标记的ddNTPddNTPddNTPddNTP与与与与4 4 4 4种种种种dNTPdNTPdNTPdNTP。由于每种。由于每种。由于每

24、种。由于每种ddNTPddNTPddNTPddNTP带有各自特定的荧光颜色带有各自特定的荧光颜色带有各自特定的荧光颜色带有各自特定的荧光颜色, , , ,而简而简而简而简化为由化为由化为由化为由1 1 1 1个泳道同时判读个泳道同时判读个泳道同时判读个泳道同时判读4 4 4 4种碱基。产种碱基。产种碱基。产种碱基。产物条带经过检测仪时给出特定信号，物条带经过检测仪时给出特定信号，物条带经过检测仪时给出特定信号，物条带经过检测仪时给出特定信号，由计算机判读并记录。由计算机判读并记录。由计算机判读并记录。由计算机判读并记录。 优点优点优点优点(yudin) (yudin) (yudin) (yud

25、in) ：可用双链可用双链可用双链可用双链DNADNADNADNA做模板；做模板；做模板；做模板；模板用量少，不必克隆；模板用量少，不必克隆；模板用量少，不必克隆；模板用量少，不必克隆；可实现高通量自动化。可实现高通量自动化。可实现高通量自动化。可实现高通量自动化。第20页/共80页第二十一页，共81页。高速高速(o s)(o s)自动自动DNADNA测序仪测序仪的的结构及工作原理结构及工作原理由激光发射器产生的激光束，由激光发射器产生的激光束，通过精密的光学系统后被导通过精密的光学系统后被导向凝胶表面的检测区。在此，向凝胶表面的检测区。在此，激光束垂直射向凝胶，同经激光束垂直射向凝胶，同经过

26、检测孔的过检测孔的DNADNA片段发生作用，片段发生作用，并提供能量激发荧光发色基并提供能量激发荧光发色基团发射出具特异性波长的荧团发射出具特异性波长的荧光。这些荧光通过聚焦光。这些荧光通过聚焦(jjio)(jjio)镜集中后传给滤光镜集中后传给滤光镜镜/ /棱镜组件，以便四种碱基棱镜组件，以便四种碱基产生的不同标记波长区别开产生的不同标记波长区别开来。经成像透像最后由高灵来。经成像透像最后由高灵敏度的相机分段收集信号，敏度的相机分段收集信号，传送给计算所分析处理。传送给计算所分析处理。第21页/共80页第二十二页，共81页。以荧光以荧光(ynggung)(ynggung)化合物标化合物标记双

27、脱氧核苷酸的自动测序记双脱氧核苷酸的自动测序 荧光化合荧光化合物标记链终止物标记链终止(zhngzh)(zhngzh)法以荧法以荧光颜色为标记信号，光颜色为标记信号，每种每种ddNTPddNTP各有各有1 1种种代表颜色；整个反代表颜色；整个反应在一个试管中进应在一个试管中进行；当新合成的终行；当新合成的终止止(zhngzh)(zhngzh)单链单链通过荧光监测仪时，通过荧光监测仪时，可由光信号读出末可由光信号读出末端核苷酸并由电脑端核苷酸并由电脑记录。记录。第22页/共80页第二十三页，共81页。第23页/共80页第二十四页，共81页。毛细管电泳毛细管电泳DNADNA自动化测序自动化测序 用

28、毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板(pngbn)(pngbn)电泳，可使电泳，可使DNADNA的测序速度更为迅速。的测序速度更为迅速。这种电泳装置有这种电泳装置有9696个泳道，每次可同时进行个泳道，每次可同时进行9696次次测序，每轮实验不到测序，每轮实验不到2 2小时，小时，1 1天可完成近千次反天可完成近千次反应。应。自动化测序的改进自动化测序的改进(gijn)(gijn)第24页/共80页第二十五页，共81页。毛细管电泳测序装置：毛细管电泳测序装置： DNA DNA样品通过一样品通过一束充满凝胶的毛细管束充满凝胶的毛细管进行电泳，利用共聚进行电泳，利用共聚焦荧光

29、扫描显微镜，焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标可将核苷酸的荧光标记记(bioj)(bioj)信号放大，信号放大，并由计算机读取碱基并由计算机读取碱基顺序。顺序。第25页/共80页第二十六页，共81页。SangerSanger双脱氧双脱氧(tu yng)(tu yng)链终止链终止DNADNA测序法的测序能力：测序法的测序能力： 手工测序：最大约手工测序：最大约300bp300bp； 自动测序：最大约自动测序：最大约1200b1200b。第26页/共80页第二十七页，共81页。LI-COR 4300 DNA LI-COR 4300 DNA 遗传遗传(ychun)(ychun)分析分析系统系统L

30、I-COR 4300 DNA LI-COR 4300 DNA 遗遗传分析传分析(fnx)(fnx)系统单系统单向测序能力可达，测向测序能力可达，测序准确率序准确率 99%99%，是目，是目前测序长度最长、准前测序长度最长、准确性最高的测序仪。确性最高的测序仪。第27页/共80页第二十八页，共81页。又叫焦磷酸测序。链合成反应体系中没有又叫焦磷酸测序。链合成反应体系中没有又叫焦磷酸测序。链合成反应体系中没有又叫焦磷酸测序。链合成反应体系中没有ddNTPddNTPddNTPddNTP，各种各种各种各种dNTPdNTPdNTPdNTP分别加入，当分别加入，当分别加入，当分别加入，当dNTPdNTPd

31、NTPdNTP连接到连接到连接到连接到DNA 3-DNA 3-DNA 3-DNA 3-末端时末端时末端时末端时会释放会释放会释放会释放(shfng)1(shfng)1(shfng)1(shfng)1个焦磷酸个焦磷酸个焦磷酸个焦磷酸(PPi) ,(PPi) ,(PPi) ,(PPi) ,焦磷酸在磷酸焦磷酸在磷酸焦磷酸在磷酸焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能化酶的作用下转化为化学能化酶的作用下转化为化学能化酶的作用下转化为化学能, , , ,并发出光亮并发出光亮并发出光亮并发出光亮. . . .由此由此由此由此, , , ,往往往往反应液中每次只加入反应液中每次只加入反应液中每次只加入反应液中每

32、次只加入1 1 1 1种核苷酸种核苷酸种核苷酸种核苷酸, , , ,当加入的核苷酸结当加入的核苷酸结当加入的核苷酸结当加入的核苷酸结合时合时合时合时, , , ,反应液发出亮点反应液发出亮点反应液发出亮点反应液发出亮点, , , ,并记录核苷酸种类并记录核苷酸种类并记录核苷酸种类并记录核苷酸种类; ; ; ;当核苷当核苷当核苷当核苷酸未结合时酸未结合时酸未结合时酸未结合时, , , ,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸酸酸酸, , , ,由此来测定由此来测定由此来测定由此来测定DNADNADNADN

33、A序列。序列。序列。序列。非常规非常规DNADNA测序测序光点光点(un din)(un din)测序（测序（pyrosequencing)pyrosequencing)第28页/共80页第二十九页，共81页。光光点点(un din)测测序序原原理理图图示示第29页/共80页第三十页，共81页。DNADNADNADNA芯片芯片芯片芯片(xn pin)(xn pin)(xn pin)(xn pin)测序测序测序测序基本原理：基本原理：基本原理：基本原理： 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片

34、上, , , , 每个点每个点每个点每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置. . . .待检测待检测待检测待检测的的的的DNADNADNADNA分子与芯片温浴分子与芯片温浴分子与芯片温浴分子与芯片温浴, , , ,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确凡是能杂交的寡核苷酸都会在确凡是能杂交的寡核苷酸都会在确凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号定位置发出信号定位置发出信号定位置发出信号, , , ,然后根据获取然后根据获取然后根据获取然后根据获取(huq)(huq)(huq

35、)(huq)的信息将寡核苷的信息将寡核苷的信息将寡核苷的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装酸的顺序进行对比组装酸的顺序进行对比组装酸的顺序进行对比组装, , , ,拼接成完全的拼接成完全的拼接成完全的拼接成完全的DNADNADNADNA顺序顺序顺序顺序. . . .缺点：每次测序的长度受寡核苷酸数目的限制。缺点：每次测序的长度受寡核苷酸数目的限制。缺点：每次测序的长度受寡核苷酸数目的限制。缺点：每次测序的长度受寡核苷酸数目的限制。第30页/共80页第三十一页，共81页。利用基因芯片利用基因芯片(j yn xn pin)进行杂交进行杂交测序的原理测序的原理第31页/共80页第三十二页，共81页。第

36、三代第三代DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh)新突破新突破单分子单分子DNADNA纳米孔测序技术纳米孔测序技术(jsh)(jsh)n n来自美国华盛顿大学等处的研究人员利用(lyng)纳米生物学技术获得了新一代测序技术的突破，这种新方法能为癌症、糖尿病或某些成瘾患者量身绘制个性化基因测序蓝图，提供更加高效的个体医疗。这一研究成果公布在PNAS杂志上。第32页/共80页第三十三页，共81页。n n领导这一研究的是华盛顿大学的领导这一研究的是华盛顿大学的JensJens，其它研究人员包括：，其它研究人员包括：IanDerrington,TomIanDerrington,TomButle

37、r,ElizabethManraoButler,ElizabethManrao和和MarcusCollinsMarcusCollins等人。等人。n n接二连三的个人基因组图谱绘制陆续完成，说明了第二代测序技术的强大力量，但是第二接二连三的个人基因组图谱绘制陆续完成，说明了第二代测序技术的强大力量，但是第二代测序技术很快就遇上了强劲的对手代测序技术很快就遇上了强劲的对手第三代测序技术，也就是被称为下下一代的测序第三代测序技术，也就是被称为下下一代的测序（next-next-generationsequencingnext-next-generationsequencing）的直接测序方法。这一

38、测序技术是基于纳米孔）的直接测序方法。这一测序技术是基于纳米孔（nanoporenanopore）的单分子读取技术，不同于之前的两代技术（需要荧光或者化学发光物质的协）的单分子读取技术，不同于之前的两代技术（需要荧光或者化学发光物质的协助下助下,通过读取通过读取DNADNA聚合酶或聚合酶或DNADNA连接酶将碱基连接到连接酶将碱基连接到DNADNA链上过程中释放出的光学信号而间链上过程中释放出的光学信号而间接确定接确定(qudng)(qudng)的），可以直接读取序列信息，简洁快速。的），可以直接读取序列信息，简洁快速。第33页/共80页第三十四页，共81页。n n第一代测序技术是双脱氧链末端

39、终止法第一代测序技术是双脱氧链末端终止法根据核苷酸在某一固定的点开始，根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生随机在某一个特定的碱基处终止，产生A A，T T，C C，G G四组不同长度的一系列核四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的苷酸，然后在尿素变性的PAGEPAGE胶上电泳进行检测，从而获得胶上电泳进行检测，从而获得DNADNA序列。第二代序列。第二代测序技术是焦磷酸测序法测序技术是焦磷酸测序法由由4 4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于对已知的短序列的测序分析。而第三代测序技术则是基于纳米光反应，适于对

40、已知的短序列的测序分析。而第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法孔的单分子读取技术，这种方法(fngf)(fngf)读取数据更快、有望大大降低测序读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。这一技术的研发是系统工程，涉及生物、半导成本，改变个人医疗的前景。这一技术的研发是系统工程，涉及生物、半导体、计算机、化学、光学等多个领域，需要不同学科顶尖力量的合作。体、计算机、化学、光学等多个领域，需要不同学科顶尖力量的合作。第34页/共80页第三十五页，共81页。n n在这篇文章中，研究人员设计了一种可以在纳米孔内对在这篇文章中，研究人员设计了一种可以在纳米孔内对DNADN

41、A进行快速进行快速测序的新方法，这种纳米微孔只有测序的新方法，这种纳米微孔只有1 1个纳米大小，仅够用来测量一个个纳米大小，仅够用来测量一个DNADNA的单分子链。研究人员把微孔放在一层浸泡在氯化钾溶液中的膜的单分子链。研究人员把微孔放在一层浸泡在氯化钾溶液中的膜上，并施加一个小的电压，让电流上，并施加一个小的电压，让电流(dinli)(dinli)通过微孔。不同的核苷通过微孔。不同的核苷酸通过纳米微孔时，回路中的电流酸通过纳米微孔时，回路中的电流(dinli)(dinli)就会随之改变，这些电就会随之改变，这些电流流(dinli)(dinli)称为特征信号。胞核嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶

42、称为特征信号。胞核嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶这些这些DNADNA的基本组成要素，会生成不同的特征信号。的基本组成要素，会生成不同的特征信号。第35页/共80页第三十六页，共81页。n n研究人员利用耻垢分枝杆菌porinA（MycobacteriumsmegmatisporinA.）的纳米孔创建一个DNA电子阅读器，这种方法可在极小尺度上对DNA进行(jnxng)测序，并且测序速度更快、相对更加便宜。他们的实验表明，这一方法具有对卫生保健产生广泛影响的潜力。第36页/共80页第三十七页，共81页。n n下一代下一代DNADNA测序技术测序技术(jsh)(jsh)也许能获得飞跃性的发展，改变

43、电极也许能获得飞跃性的发展，改变电极间距离从纳米至微米变化，可对病毒及过敏原等各种尺寸的分子间距离从纳米至微米变化，可对病毒及过敏原等各种尺寸的分子粒子进行超高感度、超高速度检测。当然目前第三代基因测序技粒子进行超高感度、超高速度检测。当然目前第三代基因测序技术术(jsh)(jsh)竞争也很激烈，美国宣称要在竞争也很激烈，美国宣称要在20122012年推出成熟的第三代年推出成熟的第三代基因测序仪，日本和欧洲也有相关的研发计划。我国也有这方面基因测序仪，日本和欧洲也有相关的研发计划。我国也有这方面的计划，中科院北京基因组研究所是国内权威的基因组学研究机的计划，中科院北京基因组研究所是国内权威的基

44、因组学研究机构，他们已和浪潮集团成立了构，他们已和浪潮集团成立了“中科院北京基因组研究所中科院北京基因组研究所 浪潮浪潮基因组科学联合实验室基因组科学联合实验室”，这一实验室将研发国产第三代基因测，这一实验室将研发国产第三代基因测序仪，第一台样机预计序仪，第一台样机预计20132013年问世年问世 第37页/共80页第三十八页，共81页。DNADNA顺序的组装顺序的组装(z zhun)(z zhun) 基因组的每条染色体长度可达数百万碱基对以基因组的每条染色体长度可达数百万碱基对以上，将链终止法阅读的小片段上，将链终止法阅读的小片段DNADNA组装组装(z zhun)(z zhun)成成真实的

45、排列顺序是一项浩繁而精细的工作。真实的排列顺序是一项浩繁而精细的工作。DNADNA顺序的顺序的组装组装(z zhun)(z zhun)主要有主要有3 3种方法：种方法：鸟枪法（鸟枪法（ shotgun shotgun ）；）；克隆重叠群法（克隆重叠群法（clone contigclone contig）；）； 引导鸟枪法（引导鸟枪法（ directed shotgun directed shotgun ）。）。4 4 基因组测序基因组测序4.4.序列序列(xli)(xli)组装组装第38页/共80页第三十九页，共81页。1) BAC 1) BAC 1) BAC 1) BAC 末端顺序末端顺序末

46、端顺序末端顺序(BAC-end sequenced) (BAC-end sequenced) (BAC-end sequenced) (BAC-end sequenced) 一个一个一个一个BACBACBACBAC克隆插入片段克隆插入片段克隆插入片段克隆插入片段两端的已测序的顺序两端的已测序的顺序两端的已测序的顺序两端的已测序的顺序, , , ,不包括内部顺序不包括内部顺序不包括内部顺序不包括内部顺序. . . . 可用于确定可用于确定可用于确定可用于确定BACBACBACBAC的的的的排列方向以及重叠群排列方向以及重叠群排列方向以及重叠群排列方向以及重叠群(contig)(contig)(c

47、ontig)(contig)在支架在支架在支架在支架(zhji)(scaffold)(zhji)(scaffold)(zhji)(scaffold)(zhji)(scaffold)中的排列方向中的排列方向中的排列方向中的排列方向. . . .2) 2) 2) 2) 重叠群重叠群重叠群重叠群(contig) (contig) (contig) (contig) 一群相互重叠的克隆或一群相互重叠的克隆或一群相互重叠的克隆或一群相互重叠的克隆或DNADNADNADNA顺序顺序顺序顺序, , , ,可以是草可以是草可以是草可以是草图顺序或精确顺序图顺序或精确顺序图顺序或精确顺序图顺序或精确顺序(fin

48、ished), (finished), (finished), (finished), 包括连续的包括连续的包括连续的包括连续的( ( ( (内部无间隙内部无间隙内部无间隙内部无间隙) ) ) )或不连续的或不连续的或不连续的或不连续的( ( ( (内部含间隙内部含间隙内部含间隙内部含间隙)DNA)DNA)DNA)DNA顺序顺序顺序顺序, , , ,未锚定到染色体上未锚定到染色体上未锚定到染色体上未锚定到染色体上. . . .3) 3) 3) 3) 草图顺序草图顺序草图顺序草图顺序(draft sequence) (draft sequence) (draft sequence) (draft

49、 sequence) 人类基因组测序计划定义为经人类基因组测序计划定义为经人类基因组测序计划定义为经人类基因组测序计划定义为经Phred Q20Phred Q20Phred Q20Phred Q20软件认可覆盖测序克隆片段软件认可覆盖测序克隆片段软件认可覆盖测序克隆片段软件认可覆盖测序克隆片段3-43-43-43-4倍的倍的倍的倍的DNADNADNADNA顺序顺序顺序顺序. . . . 含含含含间隙或无间隙间隙或无间隙间隙或无间隙间隙或无间隙, , , , 排列方向和位置未定排列方向和位置未定排列方向和位置未定排列方向和位置未定. . . .4) 4) 4) 4) 精确顺序精确顺序精确顺序精确

50、顺序(finished sequence) (finished sequence) (finished sequence) (finished sequence) 顺序差错率顺序差错率顺序差错率顺序差错率( ( ( (错误碱基数错误碱基数错误碱基数错误碱基数) ) ) )低低低低于于于于0.01%0.01%0.01%0.01%的的的的DNADNADNADNA序列序列序列序列, , , , 排列方向确定排列方向确定排列方向确定排列方向确定, , , ,内部不含间隙内部不含间隙内部不含间隙内部不含间隙, , , , 一般测一般测一般测一般测序覆盖率在序覆盖率在序覆盖率在序覆盖率在8-108-108

51、-108-10个当量个当量个当量个当量. . . .5) 5) 5) 5) 支架支架支架支架(zhji)(scaffold) (zhji)(scaffold) (zhji)(scaffold) (zhji)(scaffold) 一组已锚定在染色体上的重叠群一组已锚定在染色体上的重叠群一组已锚定在染色体上的重叠群一组已锚定在染色体上的重叠群, , , , 内部含间隙或不含间隙内部含间隙或不含间隙内部含间隙或不含间隙内部含间隙或不含间隙. . . . 第39页/共80页第四十页，共81页。随机测序与序列组装随机测序与序列组装 鸟枪法的顺序组装是直接从已测序的小片段鸟枪法的顺序组装是直接从已测序的小

52、片段中寻找彼此重叠的测序克隆，然后依次向两侧邻接的中寻找彼此重叠的测序克隆，然后依次向两侧邻接的序列延伸。这一方法不需要预先了解任何基因组的情序列延伸。这一方法不需要预先了解任何基因组的情况，即使况，即使(jsh)(jsh)缺少遗传图谱和物理图谱，也可以缺少遗传图谱和物理图谱，也可以完成整个基因组的组装。完成整个基因组的组装。优点优点: :不需预先了解任何基因组的情况。不需预先了解任何基因组的情况。缺点：不适合大基因组测序。缺点：不适合大基因组测序。第40页/共80页第四十一页，共81页。从下至上从下至上(zhshng)(zhshng)的策略的策略随随机法测序机法测序第41页/共80页第四十二

53、页，共81页。随机随机(su j)(su j)鸟枪法测序鸟枪法测序原理原理第42页/共80页第四十三页，共81页。 鸟枪法顺序组装鸟枪法顺序组装鸟枪法顺序组装鸟枪法顺序组装(z zhun)(z zhun)(z zhun)(z zhun)流程流程流程流程）由自动测序仪记录的测序顺序经）由自动测序仪记录的测序顺序经）由自动测序仪记录的测序顺序经）由自动测序仪记录的测序顺序经Phred Q20Phred Q20Phred Q20Phred Q20软件判断采用。筛软件判断采用。筛软件判断采用。筛软件判断采用。筛查过滤重复顺序查过滤重复顺序查过滤重复顺序查过滤重复顺序: : : : 如如如如rRNArR

54、NArRNArRNA基因基因基因基因, , , , 转座子等。转座子等。转座子等。转座子等。2) 2) 2) 2) 重叠顺序组装重叠顺序组装重叠顺序组装重叠顺序组装: : : : 两段顺序重叠的认可标准为两段顺序重叠的认可标准为两段顺序重叠的认可标准为两段顺序重叠的认可标准为, , , ,至少至少至少至少(zhsho)40 bp(zhsho)40 bp(zhsho)40 bp(zhsho)40 bp的重叠的重叠的重叠的重叠, , , , 差异率小于差异率小于差异率小于差异率小于6%6%6%6%。3) Unitigger(3) Unitigger(3) Unitigger(3) Unitigge

55、r(重叠单元重叠单元重叠单元重叠单元) ) ) )建立建立建立建立: : : : 一组彼此重叠的一组彼此重叠的一组彼此重叠的一组彼此重叠的DNADNADNADNA顺序顺序顺序顺序, , , , 其中其中其中其中不存在争议的或不确定的重叠关系不存在争议的或不确定的重叠关系不存在争议的或不确定的重叠关系不存在争议的或不确定的重叠关系, , , , 为独立的重叠群。为独立的重叠群。为独立的重叠群。为独立的重叠群。4) 4) 4) 4) 支架支架支架支架(scaffold)(scaffold)(scaffold)(scaffold)搭建搭建搭建搭建: : : : 由一组由一组由一组由一组Unitigg

56、erUnitiggerUnitiggerUnitigger相互叠合以及由相互叠合以及由相互叠合以及由相互叠合以及由BACBACBACBAC克隆末端顺序指认彼此相邻的重叠群克隆末端顺序指认彼此相邻的重叠群克隆末端顺序指认彼此相邻的重叠群克隆末端顺序指认彼此相邻的重叠群, , , , 内部可能有间隙。内部可能有间隙。内部可能有间隙。内部可能有间隙。 第43页/共80页第四十四页，共81页。（a a）DNADNA分分子子(fnz)(fnz)被被打打断断，产产生生小小片片段段DNADNA（b b）小小片片段段(pin (pin dun)DNAdun)DNA分别测序分别测序 （c c）根根据据(gnj)

57、DNA(gnj)DNA序序列列的的重重叠关系，构建重叠群叠关系，构建重叠群 AGCCAATGCATTAGCATGCAGCCAATGCAT重叠群重叠群DNADNA序列序列小片段小片段DNADNADNADNA分子分子鸟枪法序列组装鸟枪法序列组装第44页/共80页第四十五页，共81页。鸟枪法的优势：鸟枪法的优势： 鸟枪法的主要优势在于：测序速度快，并且无须提鸟枪法的主要优势在于：测序速度快，并且无须提供相关的遗传图谱和物理图谱。供相关的遗传图谱和物理图谱。 20 20世纪世纪9090年代末，用鸟枪法在较短时间内成功地完年代末，用鸟枪法在较短时间内成功地完成了流感嗜血杆菌成了流感嗜血杆菌(gnjn)(

58、gnjn)的基因组测序，引发了一场微的基因组测序，引发了一场微生物基因组测序的热潮。这些研究项目的实施，表明鸟枪生物基因组测序的热潮。这些研究项目的实施，表明鸟枪法测序可以组建一条流水工作线，一个科研小组可以分工法测序可以组建一条流水工作线，一个科研小组可以分工合作，一部分人专门负责制备合作，一部分人专门负责制备DNADNA，一部分人负责测序和，一部分人负责测序和数据分析。经验证明，一个数据分析。经验证明，一个5Mb5Mb大小基因组的测序可以在大小基因组的测序可以在一年内完成。一年内完成。第45页/共80页第四十六页，共81页。用于测序的流感嗜血用于测序的流感嗜血用于测序的流感嗜血用于测序的流

59、感嗜血(sh xu)(sh xu)(sh xu)(sh xu)杆菌基因组文库杆菌基因组文库杆菌基因组文库杆菌基因组文库构建了两套基因组文库构建了两套基因组文库构建了两套基因组文库构建了两套基因组文库: : : :1) 1.6-2 kb1) 1.6-2 kb1) 1.6-2 kb1) 1.6-2 kb大小插入子基因组文库大小插入子基因组文库大小插入子基因组文库大小插入子基因组文库. 2 kb. 2 kb. 2 kb. 2 kb大小插入大小插入大小插入大小插入子可减少扩增时的变异率子可减少扩增时的变异率子可减少扩增时的变异率子可减少扩增时的变异率. . . . 此外此外此外此外, 2 kb, 2

60、kb, 2 kb, 2 kb大小降低了大小降低了大小降低了大小降低了克隆片段含有完整基因的可能性克隆片段含有完整基因的可能性克隆片段含有完整基因的可能性克隆片段含有完整基因的可能性, , , ,有些完整基因的有些完整基因的有些完整基因的有些完整基因的表达表达表达表达(biod)(biod)(biod)(biod)产物对宿主菌是有害的。产物对宿主菌是有害的。产物对宿主菌是有害的。产物对宿主菌是有害的。2) 15-20 kb2) 15-20 kb2) 15-20 kb2) 15-20 kb大小插入子文库大小插入子文库大小插入子文库大小插入子文库, , , , 用于支架搭建。用于支架搭建。用于支架搭

61、建。用于支架搭建。 上述两套基因组文库的克隆测序均为两端测序。上述两套基因组文库的克隆测序均为两端测序。上述两套基因组文库的克隆测序均为两端测序。上述两套基因组文库的克隆测序均为两端测序。第46页/共80页第四十七页，共81页。超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组DNADNADNADNA 琼脂糖电泳收集的区段、纯化琼脂糖电泳收集的区段、纯化琼脂糖电泳收集的区段、纯化琼脂糖电泳收集的区段、纯化 构建到质粒载体中构建到质粒载体中构建到质粒载体中构建到质粒载体中 随机挑选随机挑选随机挑选随机挑选19687196871968719687个克隆个克隆个

62、克隆个克隆, , , ,进行进行进行进行(jnxng)28643(jnxng)28643(jnxng)28643(jnxng)28643次测序次测序次测序次测序, , , ,得到可得到可得到可得到可读顺序为读顺序为读顺序为读顺序为11 631 485 bp11 631 485 bp11 631 485 bp11 631 485 bp，相当于基因组总长的，相当于基因组总长的，相当于基因组总长的，相当于基因组总长的6 6 6 6倍倍倍倍 组装成组装成组装成组装成140140140140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群个覆盖

63、全基因组范围的独立的顺序重叠群 各重叠群当中有各重叠群当中有各重叠群当中有各重叠群当中有42424242个物理间隙和个物理间隙和个物理间隙和个物理间隙和99999999个顺序间隙个顺序间隙个顺序间隙个顺序间隙第47页/共80页第四十八页，共81页。 各重叠群间仍有间隙各重叠群间仍有间隙各重叠群间仍有间隙各重叠群间仍有间隙(jin x)(jin x)(jin x)(jin x) 顺序间隙顺序间隙顺序间隙顺序间隙(jin x) (jin x) (jin x) (jin x) 物理间隙物理间隙物理间隙物理间隙(jin x)(jin x)(jin x)(jin x) 载体或宿主载体或宿主载体或宿主载体

64、或宿主(szh)(szh)(szh)(szh)菌菌菌菌 选用不当而被丢失选用不当而被丢失选用不当而被丢失选用不当而被丢失的顺序的顺序的顺序的顺序测序时遗漏测序时遗漏测序时遗漏测序时遗漏(ylu)(ylu)(ylu)(ylu)的测序的测序的测序的测序解决办法解决办法: :通过相邻已知顺通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因序作为探针筛选已有的基因组文库组文库解决办法解决办法: :利用其它宿主菌利用其它宿主菌与载体重新构建文库与载体重新构建文库第48页/共80页第四十九页，共81页。 间间间间 隙隙隙隙 的的的的 类类类类 型型型型测序后将测序后将测序后将测序后将DNADNADNADNA顺序进行组

65、装顺序进行组装顺序进行组装顺序进行组装, , , ,会发现存在不连续的区段会发现存在不连续的区段会发现存在不连续的区段会发现存在不连续的区段(q (q (q (q dun)dun)dun)dun)，它们产生于，它们产生于，它们产生于，它们产生于: : : :1) 1) 1) 1) 因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺序因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺序因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺序因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺序, , , ,仍存在仍存在仍存在仍存在于克隆文库中于克隆文库中于克隆文库中于克隆文库中, , , , 这类间隙称为顺序间隙。这类间隙称为顺序间隙。这类间隙称为顺序间隙。这类间

66、隙称为顺序间隙。2) 2) 2) 2) 因克隆载体自身的限制或因克隆载体自身的限制或因克隆载体自身的限制或因克隆载体自身的限制或DNADNADNADNA顺序特殊的组成等原顺序特殊的组成等原顺序特殊的组成等原顺序特殊的组成等原因造成某些顺序丢失或未能克隆因造成某些顺序丢失或未能克隆因造成某些顺序丢失或未能克隆因造成某些顺序丢失或未能克隆, , , , 这类间隙称为物理间这类间隙称为物理间这类间隙称为物理间这类间隙称为物理间隙。隙。隙。隙。第49页/共80页第五十页，共81页。间隙间隙间隙间隙(jin x)(jin x)(jin x)(jin x)的缝合的缝合的缝合的缝合n n顺序间隙顺序间隙顺序

67、间隙顺序间隙(jin x)(jin x)(jin x)(jin x)可以通过利用相邻已知顺序作为可以通过利用相邻已知顺序作为可以通过利用相邻已知顺序作为可以通过利用相邻已知顺序作为探针，筛选已有的基因组文库，挑选阳性克隆重新测探针，筛选已有的基因组文库，挑选阳性克隆重新测探针，筛选已有的基因组文库，挑选阳性克隆重新测探针，筛选已有的基因组文库，挑选阳性克隆重新测序进行缝合。序进行缝合。序进行缝合。序进行缝合。n n物理间隙物理间隙物理间隙物理间隙(jin x)(jin x)(jin x)(jin x)的缝合需要利用其他载体或者宿的缝合需要利用其他载体或者宿的缝合需要利用其他载体或者宿的缝合需要

68、利用其他载体或者宿主菌重新构建一个基因组文库，然后利用间隙主菌重新构建一个基因组文库，然后利用间隙主菌重新构建一个基因组文库，然后利用间隙主菌重新构建一个基因组文库，然后利用间隙(jin (jin (jin (jin x)x)x)x)两侧的序列作为探针，或者制备相应的两侧的序列作为探针，或者制备相应的两侧的序列作为探针，或者制备相应的两侧的序列作为探针，或者制备相应的PCRPCRPCRPCR引物，引物，引物，引物，从新文库筛选阳性克隆，重新测序。从新文库筛选阳性克隆，重新测序。从新文库筛选阳性克隆，重新测序。从新文库筛选阳性克隆，重新测序。第50页/共80页第五十一页，共81页。顺序顺序顺序顺

69、序(shnx)(shnx)(shnx)(shnx)间隙缝合间隙缝合间隙缝合间隙缝合第51页/共80页第五十二页，共81页。第52页/共80页第五十三页，共81页。流感流感流感流感(li n)(li n)(li n)(li n)嗜血杆菌基因组测序结果嗜血杆菌基因组测序结果嗜血杆菌基因组测序结果嗜血杆菌基因组测序结果1) 1) 1) 1) 两端测序的结果称为读序两端测序的结果称为读序两端测序的结果称为读序两端测序的结果称为读序(read), (read), (read), (read), 每个读序长约每个读序长约每个读序长约每个读序长约400 bp.400 bp.400 bp.400 bp.2)

70、2) 2) 2) 在在在在DNADNADNADNA顺序组装前顺序组装前顺序组装前顺序组装前, , , ,由自动测序仪给出的每个读序都必须经由自动测序仪给出的每个读序都必须经由自动测序仪给出的每个读序都必须经由自动测序仪给出的每个读序都必须经PhredPhredPhredPhred软软软软件处理件处理件处理件处理, , , , 以确定给出的顺序质量与可靠性。这一步以确定给出的顺序质量与可靠性。这一步以确定给出的顺序质量与可靠性。这一步以确定给出的顺序质量与可靠性。这一步(y b)(y b)(y b)(y b)为为为为顺序认可顺序认可顺序认可顺序认可(calling for)(calling fo

71、r)(calling for)(calling for)。3) 3) 3) 3) 流感嗜血杆菌基因组测序共组装了流感嗜血杆菌基因组测序共组装了流感嗜血杆菌基因组测序共组装了流感嗜血杆菌基因组测序共组装了24304243042430424304个片段个片段个片段个片段, , , ,建立了建立了建立了建立了140140140140个重叠个重叠个重叠个重叠群群群群(contig).(contig).(contig).(contig).根据某些克隆跨越不同的根据某些克隆跨越不同的根据某些克隆跨越不同的根据某些克隆跨越不同的contig, contig, contig, contig, 再合并为再合并为

72、再合并为再合并为42424242个个个个支架支架支架支架(scaffold)(scaffold)(scaffold)(scaffold)。4) 4) 4) 4) 整个组装的基因组顺序存在整个组装的基因组顺序存在整个组装的基因组顺序存在整个组装的基因组顺序存在42424242个物理间隙个物理间隙个物理间隙个物理间隙, 99, 99, 99, 99个顺序间隙。基因组个顺序间隙。基因组个顺序间隙。基因组个顺序间隙。基因组全长全长全长全长1830137bp(1.8 Mb).1830137bp(1.8 Mb).1830137bp(1.8 Mb).1830137bp(1.8 Mb).第53页/共80页第五

73、十四页，共81页。鸟枪法的局限：鸟枪法的局限： 对于结构复杂的大基因组而言，鸟枪法的序列组装的起始对于结构复杂的大基因组而言，鸟枪法的序列组装的起始阶段工作量非常大。首先需要对小片段进行序列分析，找阶段工作量非常大。首先需要对小片段进行序列分析，找出重叠群，需要分析的小片段的数量太大，达到现有计算出重叠群，需要分析的小片段的数量太大，达到现有计算机能力的极限。此外，基因组中普遍存在的重复序列是十机能力的极限。此外，基因组中普遍存在的重复序列是十分棘手的问题，在序列组装时可能出现错误分棘手的问题，在序列组装时可能出现错误(cuw)(cuw)连接，连接，使某些片段从原位置跳到另一无关位置。因此，对

74、于缺少使某些片段从原位置跳到另一无关位置。因此，对于缺少重复顺序的小基因组（重复顺序的小基因组（5Mb5Mb）而言，鸟枪法仍为最佳的选）而言，鸟枪法仍为最佳的选择，但对于大基因组而言，还需要更加有效的策略。择，但对于大基因组而言，还需要更加有效的策略。第54页/共80页第五十五页，共81页。重叠群法或图位法：重叠群法或图位法：实践证明，在实践证明，在5Mb5Mb的范围内，用鸟枪法进行测序组装可以的范围内，用鸟枪法进行测序组装可以获得较好的效果。因此，对于大基因组而言，可以先将基获得较好的效果。因此，对于大基因组而言，可以先将基因组因组DNADNA分解为若干个较大的分解为若干个较大的DNADNA

75、片段，构建基因组文库。片段，构建基因组文库。每个大片段克隆可以独立进行鸟枪法测序，亦可以组建重每个大片段克隆可以独立进行鸟枪法测序，亦可以组建重叠群后进行鸟枪法测序。因此称为克隆重叠群测序法。叠群后进行鸟枪法测序。因此称为克隆重叠群测序法。更理想的是，重叠群经分子标记更理想的是，重叠群经分子标记(bioj)(bioj)定位于遗传图谱定位于遗传图谱或物理图谱上，并利用分子标记或物理图谱上，并利用分子标记(bioj)(bioj)验证顺序组装的验证顺序组装的结果。因此，该方法又称为图位法。结果。因此，该方法又称为图位法。限定限定(xindng)(xindng)测序与序列组装测序与序列组装第55页/共

76、80页第五十六页，共81页。限定限定限定限定(xindng)(xindng)(xindng)(xindng)测序与序列组装测序与序列组装测序与序列组装测序与序列组装一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用用用用(ciyng)(ciyng)(ciyng)(ciyng)这一方法。这一方法。这一方法。这一方法。如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆

77、重叠群如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群, , , ,先先先先进行各个进行各个进行各个进行各个BACBACBACBAC克隆的随机测序，再进行序列组装。克隆的随机测序，再进行序列组装。克隆的随机测序，再进行序列组装。克隆的随机测序，再进行序列组装。 水稻基因组测序计划采取得策略与此相同。水稻基因组测序计划采取得策略与此相同。水稻基因组测序计划采取得策略与此相同。水稻基因组测序计划采取得策略与此相同。第56页/共80页第五十七页，共81页。从上至下的策略从上至下的策略(cl)(cl)图位法图位法测序测序第57页/共80页第五十八页，共81页。将支架将支架(zhji)锚定到物理图锚定到物

78、理图上上第58页/共80页第五十九页，共81页。线虫线虫(xin chn)(xin chn)基因组测序策略基因组测序策略图图位法位法第59页/共80页第六十页，共81页。 指导鸟枪法（指导鸟枪法（ The directed shotgun approach The directed shotgun approach ）建立在基因）建立在基因组图谱基础上的组图谱基础上的”鸟枪法鸟枪法”。是对随机鸟枪法的改良和发展。要。是对随机鸟枪法的改良和发展。要是为了克服随机鸟枪法组装中，由于重复序列引起的错误排序。是为了克服随机鸟枪法组装中，由于重复序列引起的错误排序。 例如，在人类例如，在人类(rnli)

79、(rnli)基因组测序中，要复盖基因组测序中，要复盖99%99%的基因组序列，的基因组序列，就要完成就要完成70007000万次测序（按每次可读万次测序（按每次可读500bp500bp左右算）。如果完全采左右算）。如果完全采用随机鸟枪法，要从用随机鸟枪法，要从70007000万序列中寻找重叠的序列，又要避免广万序列中寻找重叠的序列，又要避免广泛存在的高密度重复顺序的干扰，显然是做不到的。泛存在的高密度重复顺序的干扰，显然是做不到的。指导测序与序列指导测序与序列(xli)(xli)组装组装第60页/共80页第六十一页，共81页。人类基因组测序的安排：人类基因组测序的安排：（1 1）构建插入片段平

80、均为）构建插入片段平均为2kb2kb的人类基因组质粒文库的人类基因组质粒文库(wnk)(wnk)，每个克隆经双向测序可读顺序约，每个克隆经双向测序可读顺序约500bp500bp。（2 2）构建插入片段平均为）构建插入片段平均为10kb10kb的人类基因组质粒文库的人类基因组质粒文库(wnk)(wnk)，每个克隆经双向测序读取端部序列约，每个克隆经双向测序读取端部序列约500bp500bp。人类基因组中大多数重复顺序的长度在人类基因组中大多数重复顺序的长度在5kb5kb或略长，或略长，10kb10kb文库文库(wnk)(wnk)的构建有助于在序列组装时校正重复的构建有助于在序列组装时校正重复顺序

81、产生的差错。顺序产生的差错。（3 3）参考人类基因组图）参考人类基因组图, ,特别是大量的特别是大量的STSSTS位标作为基位标作为基点点, ,进行序列组装，排成重叠克隆群。进行序列组装，排成重叠克隆群。第61页/共80页第六十二页，共81页。2kb clones2kb clones10kb clones10kb clones10kb clones10kb clones5kb 5kb 重复序列重复序列10kb10kb克隆可以作为克隆可以作为(zuwi)2kb(zuwi)2kb克隆的克隆的支架支架10kb10kb克隆可以校正克隆可以校正5kb5kb重复重复序列序列(xli)(xli)产生的差错产

82、生的差错第62页/共80页第六十三页，共81页。两种策略两种策略两种策略两种策略(cl)(cl)(cl)(cl)的比较的比较的比较的比较鸟枪法策略鸟枪法策略鸟枪法策略鸟枪法策略 指导测序指导测序指导测序指导测序策略策略策略策略不需背景信息不需背景信息不需背景信息不需背景信息 构建克隆群构建克隆群构建克隆群构建克隆群 ( ( ( (遗传、物理图谱遗传、物理图谱遗传、物理图谱遗传、物理图谱) ) ) )时间时间时间时间(shjin)(shjin)(shjin)(shjin)短短短短 需要几年的时间需要几年的时间需要几年的时间需要几年的时间(shjin) (shjin) (shjin) (shjin

83、) 需要大型计算机需要大型计算机需要大型计算机需要大型计算机得到的是草图得到的是草图得到的是草图得到的是草图(Draft) (Draft) (Draft) (Draft) 得到精细图谱得到精细图谱得到精细图谱得到精细图谱第63页/共80页第六十四页，共81页。两种策略两种策略(cl)的比较的比较第64页/共80页第六十五页，共81页。4 4 基因组测序基因组测序基因组测序的其他基因组测序的其他(qt)(qt)路线路线重要区域重要区域(qy)(qy)的优先测序的优先测序 人们对感兴趣的基因人们对感兴趣的基因(jyn)(jyn)或与疾病相关的或与疾病相关的基因基因(jyn)(jyn)优先测序。优先

84、测序。如：人类主要组织相容性复合区位于第如：人类主要组织相容性复合区位于第6 6号染号染色体，与人类免疫系统有关，因而优先测序。色体，与人类免疫系统有关，因而优先测序。第65页/共80页第六十六页，共81页。EST (Expressed sequence tag) EST (Expressed sequence tag) EST (Expressed sequence tag) EST (Expressed sequence tag) 测序测序测序测序ESTESTESTEST是一种重要的基因组图分子标记是一种重要的基因组图分子标记是一种重要的基因组图分子标记是一种重要的基因组图分子标记, ,

85、, ,以以以以ESTESTESTEST为探针很容易从为探针很容易从为探针很容易从为探针很容易从 cDNAcDNAcDNAcDNA文库中筛选全基因文库中筛选全基因文库中筛选全基因文库中筛选全基因, , , ,又可从又可从又可从又可从BACBACBACBAC克隆中找到其基因组克隆中找到其基因组克隆中找到其基因组克隆中找到其基因组的基因序列。的基因序列。的基因序列。的基因序列。 优点优点优点优点: : : : A A A A） mRNA mRNA mRNA mRNA 可直接反转录成可直接反转录成可直接反转录成可直接反转录成cDNA,cDNA,cDNA,cDNA,而且而且而且而且cDNAcDNAcDN

86、AcDNA文库也比较容文库也比较容文库也比较容文库也比较容易构建易构建易构建易构建(u jin);(u jin);(u jin);(u jin); B B B B ） 对对对对cDNAcDNAcDNAcDNA文库大量测序文库大量测序文库大量测序文库大量测序, , , ,即可获得大量即可获得大量即可获得大量即可获得大量ESTESTESTEST的序列的序列的序列的序列; ; ; ; C C C C） EST EST EST EST为基因的编码区为基因的编码区为基因的编码区为基因的编码区, , , ,不包括内含子和基因间区域不包括内含子和基因间区域不包括内含子和基因间区域不包括内含子和基因间区域,

87、, , ,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因。一次测序的结果足以鉴定所代表的基因。一次测序的结果足以鉴定所代表的基因。一次测序的结果足以鉴定所代表的基因。第66页/共80页第六十七页，共81页。浏览浏览浏览浏览(li ln)(li ln)(li ln)(li ln)测序（测序（测序（测序（sequence skimming)sequence skimming)sequence skimming)sequence skimming)粗略分析初步测序结果，从中寻找基因编码顺粗略分析初步测序结果，从中寻找基因编码顺粗略分析初步测序结果，从中寻找基因编码顺粗略分析初步测序结果，从中寻找基因编码顺序的方

88、法。序的方法。序的方法。序的方法。从很长一个区段从很长一个区段从很长一个区段从很长一个区段(q dun)(q dun)(q dun)(q dun)获得一些随机顺序，获得一些随机顺序，获得一些随机顺序，获得一些随机顺序，如果这一区段如果这一区段如果这一区段如果这一区段(q dun)(q dun)(q dun)(q dun)含有基因，就集中挑含有基因，就集中挑含有基因，就集中挑含有基因，就集中挑选该区段选该区段选该区段选该区段(q dun)(q dun)(q dun)(q dun)某一部分进行测序，查找某一部分进行测序，查找某一部分进行测序，查找某一部分进行测序，查找基因编码区。基因编码区。基因编

89、码区。基因编码区。4 4 基因组测序基因组测序基因组测序的其他基因组测序的其他(qt)(qt)路线路线第67页/共80页第六十八页，共81页。几种不同生物几种不同生物(shngw)(shngw)基因组测序基因组测序的策略：的策略： 大肠杆菌大肠杆菌(gnjn)(gnjn)基因组测序基因组测序图位法图位法; ; 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌(gnjn)(gnjn)基因组测序基因组测序鸟枪法鸟枪法; ; 果蝇基因组测序果蝇基因组测序鸟枪法鸟枪法; ; 人类基因组测序人类基因组测序图位法和鸟枪法图位法和鸟枪法; ; 水稻基因组测序水稻基因组测序 图位法和鸟枪法。图位法和鸟枪法。4 4 基因组测序基因组测

90、序基因组测序计划基因组测序计划(jhu)(jhu)第68页/共80页第六十九页，共81页。n n1990 1990 1990 1990 人类基因组计划起动；人类基因组计划起动；人类基因组计划起动；人类基因组计划起动；n n1995 1995 1995 1995 第一个原核生物（细菌）基因组测序完成；第一个原核生物（细菌）基因组测序完成；第一个原核生物（细菌）基因组测序完成；第一个原核生物（细菌）基因组测序完成；n n1996 1996 1996 1996 第一个真核生物（酵母）的基因组测序完成；第一个真核生物（酵母）的基因组测序完成；第一个真核生物（酵母）的基因组测序完成；第一个真核生物（酵母

91、）的基因组测序完成；n n1998 1998 1998 1998 第一个多细胞生物（线虫）的基因组测序完成；第一个多细胞生物（线虫）的基因组测序完成；第一个多细胞生物（线虫）的基因组测序完成；第一个多细胞生物（线虫）的基因组测序完成；n n2000 2000 2000 2000 果蝇和拟南芥的基因组测序完成；果蝇和拟南芥的基因组测序完成；果蝇和拟南芥的基因组测序完成；果蝇和拟南芥的基因组测序完成；n n 人类和水稻人类和水稻人类和水稻人类和水稻(shudo)(shudo)(shudo)(shudo)的第一张基因组草图的第一张基因组草图的第一张基因组草图的第一张基因组草图完成；完成；完成；完成；

92、n n2001 2001 2001 2001 人类基因组测序完成；人类基因组测序完成；人类基因组测序完成；人类基因组测序完成；n n 水稻水稻水稻水稻(shudo)(shudo)(shudo)(shudo)（籼稻和粳稻）基因组草图（籼稻和粳稻）基因组草图（籼稻和粳稻）基因组草图（籼稻和粳稻）基因组草图完成。完成。完成。完成。n n2003200320032003年年年年4 4 4 4月，人类基因组计划的完成是一项非常重要的成月，人类基因组计划的完成是一项非常重要的成月，人类基因组计划的完成是一项非常重要的成月，人类基因组计划的完成是一项非常重要的成就就就就 4 4 基因组测序基因组测序基因组测

93、序计划基因组测序计划(jhu)(jhu)第69页/共80页第七十页，共81页。n n原始顺序：直接从克隆载体插入子阅读的单个顺序，尚未组装原始顺序：直接从克隆载体插入子阅读的单个顺序，尚未组装原始顺序：直接从克隆载体插入子阅读的单个顺序，尚未组装原始顺序：直接从克隆载体插入子阅读的单个顺序，尚未组装(z zhun)(z zhun)(z zhun)(z zhun)。n n成对末端顺序：从任何基因组文库的克隆插入子两端读取的原成对末端顺序：从任何基因组文库的克隆插入子两端读取的原成对末端顺序：从任何基因组文库的克隆插入子两端读取的原成对末端顺序：从任何基因组文库的克隆插入子两端读取的原始顺序。始顺

94、序。始顺序。始顺序。n n完成顺序：已完成测序的任何一个克隆或基因组的顺序，它们完成顺序：已完成测序的任何一个克隆或基因组的顺序，它们完成顺序：已完成测序的任何一个克隆或基因组的顺序，它们完成顺序：已完成测序的任何一个克隆或基因组的顺序，它们是连续的，不含内部间隙，误差率少于是连续的，不含内部间隙，误差率少于是连续的，不含内部间隙，误差率少于是连续的，不含内部间隙，误差率少于0.01%0.01%0.01%0.01%。n n覆盖面（或深度）：每个核苷酸在完成顺序中平均出现的次数，覆盖面（或深度）：每个核苷酸在完成顺序中平均出现的次数，覆盖面（或深度）：每个核苷酸在完成顺序中平均出现的次数，覆盖面

95、（或深度）：每个核苷酸在完成顺序中平均出现的次数，或者说完成顺序的长度与组装或者说完成顺序的长度与组装或者说完成顺序的长度与组装或者说完成顺序的长度与组装(z zhun)(z zhun)(z zhun)(z zhun)顺序长度之比。顺序长度之比。顺序长度之比。顺序长度之比。4 4 基因组测序基因组测序人类人类(rnli)(rnli)基因组的测序与组装基因组的测序与组装测序与序列组装的有关测序与序列组装的有关(yugun)(yugun)概念概念第70页/共80页第七十一页，共81页。Celera GenomicsCelera Genomics人类人类(rnli)(rnli)基因组的测序策基因组的

96、测序策略略采集采集(cij)5(cij)5个自愿者的个自愿者的DNADNA样品样品构建构建(u jin)3(u jin)3种不同插入子大种不同插入子大小的基因组文库小的基因组文库2Kb, 10Kb2Kb, 10Kb和和50Kb50Kb完成约完成约27002700万次插万次插入子末端测序入子末端测序, ,总长总长14800Mb14800Mb随机测序与序列组装方法和随机测序与序列组装方法和指导测序与序列组装方法指导测序与序列组装方法相结合进行序列组装相结合进行序列组装PFPPFP发表的公开数发表的公开数据主要为据主要为BACBAC克隆克隆的顺序的顺序, ,共共GeneBankGeneBank下载下

97、载104018104018个个BACBAC末末端顺序端顺序第71页/共80页第七十二页，共81页。 国际国际(guj)(guj)人类基因组测序联人类基因组测序联合体测序策略合体测序策略构建构建BACBAC克隆克隆 限制性酶处理获得指纹限制性酶处理获得指纹 根据指纹重叠方法组建根据指纹重叠方法组建BACBAC克隆重克隆重叠群叠群 根据根据STSSTS标记，将标记，将BACBAC克隆重叠群克隆重叠群标定在物理图上标定在物理图上 每个每个BACBAC克隆内部采用鸟枪法测序、克隆内部采用鸟枪法测序、组装组装 将将BACBAC插入顺序与插入顺序与BACBAC克隆指纹及克隆指纹及重叠群对比，将已阅读的顺序

98、重叠群对比，将已阅读的顺序锚定到物理图上锚定到物理图上第72页/共80页第七十三页，共81页。人类人类人类人类(rnli)(rnli)(rnli)(rnli)基因组测序结果基因组测序结果基因组测序结果基因组测序结果基因数是基因数是3 3万、万、4 4万还是万还是1010万？万？ 人类遗传基因数量比原先人类遗传基因数量比原先估计估计(gj)(gj)的少很多。目前研究表的少很多。目前研究表明，人类基因组中约有明，人类基因组中约有3 3万至万至4 4万个万个蛋白编码基因，仅仅是果蝇基因数蛋白编码基因，仅仅是果蝇基因数目的两倍，人有而鼠没有的基因只目的两倍，人有而鼠没有的基因只有有300300个。此结

99、论是由两大科研小组个。此结论是由两大科研小组的数据从的数据从DNADNA水平上得出的水平上得出的 。第73页/共80页第七十四页，共81页。人类基因组研究的惊人人类基因组研究的惊人人类基因组研究的惊人人类基因组研究的惊人(jngrn)(jngrn)(jngrn)(jngrn)发现发现发现发现 19 19号染色体是含基因最丰富的染色体，而号染色体是含基因最丰富的染色体，而1313号染色号染色体含基因量最少体含基因量最少 目前已经发现和定位目前已经发现和定位(dngwi)(dngwi)了了2600026000多个功能基多个功能基因，其中尚有因，其中尚有42%42%的基因尚不知道功能的基因尚不知道功

100、能 人类基因组中存在人类基因组中存在“热点热点”和大片和大片“荒漠荒漠”。在染。在染色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域只有只有“无用无用DNA” DNA” 不包含或含有极少基因的成分。不包含或含有极少基因的成分。基因组上大约有基因组上大约有1 14 4的区域没有基因的片段。的区域没有基因的片段。 的基因包含重复的序列。这说明那些原来被认为的基因包含重复的序列。这说明那些原来被认为是是“垃圾垃圾”的的DNADNA也起重要作用，应该被进一步研究。也起重要作用，应该被进一步研究。第74页/共80页第七十五页，共81页。单核苷酸多态性单核苷酸多

101、态性单核苷酸多态性单核苷酸多态性 人类的基因密码是相同的，而人类的基因密码是相同的，而差异不到，不同人群仅有差异不到，不同人群仅有140140万个万个核苷酸差异。这些差异是由核苷酸差异。这些差异是由“单一单一核苷酸多样性核苷酸多样性”（SNPSNP）产生的，它）产生的，它构成了不同个体的遗传基础，个体构成了不同个体的遗传基础，个体的多样性被认为是产生遗传疾病的的多样性被认为是产生遗传疾病的原因。在整个基因组序列中，人与原因。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同说明人类不同“种属种属”之间并没有之间并没有本质本质(bnzh)(bnzh)

102、上的区别。上的区别。 第75页/共80页第七十六页，共81页。人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划(jhu)(jhu)(jhu)(jhu)的意义的意义的意义的意义 随着人类基因组逐渐被破译，一随着人类基因组逐渐被破译，一张生命之图将被绘就，人们的生活张生命之图将被绘就，人们的生活也将发生巨大变化。人类基因研究也将发生巨大变化。人类基因研究的意义在于它可以支持和推动生命的意义在于它可以支持和推动生命科学中一系列重要的基础性研究。科学中一系列重要的基础性研究。如基因组遗传语言的破译，基因的如基因组遗传语言的破译，基因的结构与功能关系，生命的起源和进结构与功能关系，生命的起源和进

103、化，细胞发育、生产化，细胞发育、生产(shngchn)(shngchn)、分化的分子机理，疾病发生的机理分化的分子机理，疾病发生的机理等。等。第76页/共80页第七十七页，共81页。人类人类(rnli)(rnli)基因组计划的伦理学基因组计划的伦理学A) A) 个人个人(grn)DNA(grn)DNA顺序的隐私权，如：顺序的隐私权，如：“次等次等”基因携带者可能受到岐视，职基因携带者可能受到岐视，职业限制，医疗保险等问题。业限制，医疗保险等问题。B) B) 基因专利问题。基因专利问题。第77页/共80页第七十八页，共81页。后人类后人类后人类后人类(rnli)(rnli)(rnli)(rnli

104、)基因组计划基因组计划基因组计划基因组计划 伴随着人类基因组计划的迅速进展，伴随着人类基因组计划的迅速进展，基因的全序列逐步被完整的测出，会基因的全序列逐步被完整的测出，会出现大量的不知道任何功能信息的序出现大量的不知道任何功能信息的序列。因此，在列。因此，在HGPHGP完成之后完成之后(zhhu)(zhhu)，即全部人类基因被定序之后，即全部人类基因被定序之后(zhhu)(zhhu)，还需要：，还需要：破解贮存于基因组之中的遗传语言破解贮存于基因组之中的遗传语言; ;识别、分离、鉴定和克隆所有基因；识别、分离、鉴定和克隆所有基因；搞清每个基因的功能及基因之间的相互搞清每个基因的功能及基因之间

105、的相互作用和相互关系。作用和相互关系。第78页/共80页第七十九页，共81页。本章本章(bn zhn)(bn zhn)小节小节名词解释：名词解释：顺序间隙、物理间隙、支架、覆顺序间隙、物理间隙、支架、覆盖面盖面问答：问答：1 1）自动化测序的原理？）自动化测序的原理？2 2）基因组测序与组装有哪些策）基因组测序与组装有哪些策略？他们略？他们(t men)(t men)各有什么优缺各有什么优缺点？点？3 3）重叠群之间的间隙有哪两种）重叠群之间的间隙有哪两种？它们是如何产生的？如何进行？它们是如何产生的？如何进行缝合？缝合？第79页/共80页第八十页，共81页。内容(nirng)总结会计学。无3 5外切酶活性。M13噬菌体本来含有单链DNA基因组，感染大肠杆菌的M13可转变为双链复制型。肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去。用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，可使DNA的测序速度更为迅速。一些已绘制了遗传(ychun)图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法。基因数是3万、4万还是10万。如何进行缝合第八十一页，共81页。