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1、高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid ChromatographyHPLC第十一章第十一章高效液相色谱法(11)课件主要内容11-1 概述概述11-2 基本理论基本理论11-3 高效液相色谱分离方法高效液相色谱分离方法11-4 高效液相色谱仪高效液相色谱仪11-5 高效液相色谱高效液相色谱应用应用高效液相色谱法(11)课件11-1 概述概述 高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱经典液相柱色谱装置色谱装置高效液相色谱仪高效液相色谱仪经典液相色典液相色谱HPLC固定相粒径固定相粒径流流动相相驱动方式方式流流动相流速相流速150
2、-200 m重力或低重力或低压泵很慢很慢3-10 m高高压泵快快(1-10mL/min)例：分离例：分离20种氨基酸种氨基酸柱长：柱长：170 cm柱径：柱径：0.9 cmF：30 mL/ht分离分离: 20 h经典柱色经典柱色谱谱HPLCt分离分离：1 h高效液相色谱法(11)课件11-2 基本理论基本理论一、色谱柱柱效的基本关系式一、色谱柱柱效的基本关系式二、分离度二、分离度GC基本理论基本理论（塔板、速（塔板、速率）也适合率）也适合于于LC高效液相色谱法(11)课件三、速率方程三、速率方程溶质溶质在在液相液相流动相流动相中的扩散系数，约中的扩散系数，约为为气相气相中扩散系数中扩散系数的的
3、万分之一万分之一A涡流扩散项涡流扩散项B/u分子扩散项分子扩散项Cu传质阻力项传质阻力项高效液相色谱法(11)课件流动相流速对板高的影响流动相流速对板高的影响1)小颗粒填料，填充均匀；小颗粒填料，填充均匀；2) 选择较低的流动相流速；选择较低的流动相流速；3) 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。 修正的速率方程：修正的速率方程：提高柱效提高柱效途径途径高效液相色谱法(11)课件11-3 高效液相色谱分离方法高效液相色谱分离方法一、吸附色谱法（液固吸附色谱一、吸附色谱法（液固吸附色谱LSC）1. .分离原理分离原理Kad值越大，保留时间越长值越大，保留时间越
4、长 吸附平衡常数吸附平衡常数吸附竞争吸附竞争X：组分分子：组分分子S：流动相分子：流动相分子高效液相色谱法(11)课件2. .固定相固定相硅胶强极性硅胶强极性氧化铝弱极性氧化铝弱极性活性炭非极性活性炭非极性分子筛分子筛强极性强极性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂固体吸附剂应用最广应用最广高效液相色谱法(11)课件硅胶表面结构硅胶表面结构弱酸性，对弱酸性，对碱性化合物碱性化合物强保留，拖强保留，拖尾尾高效液相色谱法(11)课件硅胶表面结构经热处理发生的变化硅胶表面结构经热处理发生的变化高效液相色谱法(11)课件3. .流动相流动相(洗脱剂洗脱剂) 越大，越大，表明流动相溶剂分子对
5、吸表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。剂上将被吸附的溶质洗脱下来。 溶剂分子在单位吸附剂表面上的溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能吸附自由能溶剂强度参数溶剂强度参数吸附竞争吸附竞争溶剂极性溶剂极性高效液相色谱法(11)课件例例: 硅胶固定相分离苯，硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流动相：流动相：干燥正庚烷干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷份干燥正庚烷水饱和的正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的改变流动相的组成可改变分离组成可改变分离的选择性的选择性高效液相色谱法(
6、11)课件4. .应用应用 具有具有不同官能团的化合物不同官能团的化合物 具有相同官能团，但数量不同的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物 异构体异构体例：例：几种取代位置不同的硝基苯胺几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：序：邻位邻位 间位间位 流动相极性流动相极性正相正相分配色谱分配色谱组分极性越大，组分极性越大，保留时间越长保留时间越长反相反相分配色谱分配色谱固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性组分极性越小，组分极性越小，保留时间越长保留时间越长分离强极性物分离强极性物分离弱、非极性分离弱、非极性物物高效液相色谱法(11)课件三
7、、离子交换色谱法三、离子交换色谱法（IEC）阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换阳离子交换树脂阳离子交换树脂1. .分离原理分离原理组分对交换组分对交换剂亲和力不剂亲和力不同同高效液相色谱法(11)课件2. .固定相固定相阳离子阳离子：SO3H(强强)CO2H(弱弱)阴离子：阴离子：N+R3(强强)NH2 (弱弱)基基质质合成树脂合成树脂纤维素纤维素硅胶硅胶离子交换剂离子交换剂高效液相色谱法(11)课件3. .流动相流动相水相水相缓冲液缓冲液+有机改性剂有机改性剂 （甲醇、乙醇和乙腈）（甲醇、乙醇和乙腈）调节选择性的调节选择性的主要参数主要参数盐种类及浓度盐种类及浓度pH值值各种阴离子的在
8、阴离子交换剂上的滞留次序：各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快高效液相色谱法(11)课件4. .应用应用 离子型化合物、可离解的化合物、带电离子型化合物、可离解的化合物、带电荷的物质荷的物质等。如无机盐、生物大分子氨基酸、等。如无机盐、生物大分子氨基酸、核酸、蛋白质等核酸、蛋白质等高效液相色谱法(11)课件四、化学键合相色谱四、化学键合相色谱采用化学键合相采用化学键合相的液相色谱的液相色谱 固定相非常固定相非常稳定稳定，在使用中不易流失。，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，由于可将各种极性的官能团键合到
9、载体表面，因此它因此它适用适用于种类繁多样品的分离。于种类繁多样品的分离。特点特点分配色谱：分配色谱：液液色谱液液色谱+键合色谱键合色谱高效液相色谱法(11)课件1. 键合固定相制备键合固定相制备ODS(C18)键合相键合相硅胶硅胶十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非极性非极性硅烷化反应硅烷化反应使用使用pH范围：范围： 28高效液相色谱法(11)课件键合固定相类型键合固定相类型1. 疏水基团：疏水基团：烷烃（烷烃（C8和和C18）、）、苯基苯基等等2. 极性基团：极性基团：丙氨基、氰乙基、丙氨基、氰乙基、氨基氨基、醚和醇等、醚和醇等3. 离子交换基团：离子交换基团：胺基、季铵盐、磺酸、羧酸胺基、季
10、铵盐、磺酸、羧酸高效液相色谱法(11)课件2. 键合相色谱法分类键合相色谱法分类 反相键合相色谱反相键合相色谱:常用常用固定相固定相：C18分离对象分离对象非极性非极性中等极性化合物中等极性化合物常用常用流动相流动相甲醇甲醇-水水乙腈乙腈-水水反相键合相色谱反相键合相色谱疏溶剂分离机制疏溶剂分离机制固定相极性固定相极性 流动相极性流动相极性 离子性键合相色谱离子性键合相色谱 将各种将各种离子交换基团离子交换基团化学键合到硅胶基质化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。其分离原理与离子交换色谱类同。 高效
11、液相色谱法(11)课件例：例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基十八烷基键合相键合相二醇基二醇基键合相键合相高效液相色谱法(11)课件保留时间：保留时间：例：例：以以ODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇- -水为流动相分离水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸没食子酸3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸固定相固定相: 非极性非极性 流动相流动相: 极性极性组分极性组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸没食子酸没食子酸高效液相
12、色谱法(11)课件五、尺寸排阻五、尺寸排阻(凝胶凝胶)色谱法色谱法SEC、GPC相对分子质量差别相对分子质量差别大于大于10的化合物的化合物才可以分离才可以分离1. 分离原理分离原理（Size-Exclusion Chromatography）高效液相色谱法(11)课件2. .固定相固定相是一种经过交联而具有立体是一种经过交联而具有立体网状网状结构的多聚体，其中含结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。柔软而富于弹性。凝胶凝胶3. .流动相流动相不采用改变流动相组成的不采用改变流动相组成的方法控制分离度方法控制分离度凝胶色谱主要分离高分子化合物，常用
13、流动相：凝胶色谱主要分离高分子化合物，常用流动相：四氢呋喃、甲苯、二氯甲苯、二氯乙烷、氯仿、丙酮四氢呋喃、甲苯、二氯甲苯、二氯乙烷、氯仿、丙酮等；等；分离生物物质时主要用分离生物物质时主要用水、缓冲液、乙醇、丙酮水、缓冲液、乙醇、丙酮等。等。高效液相色谱法(11)课件 分离方法的选择分离方法的选择高效液相色谱法(11)课件11-4 高效液相色谱仪Waters UPLC 超高效液相色谱仪超高效液相色谱仪高效液相色谱法(11)课件高压泵高压泵流动相流动相溶剂溶剂废液废液色谱柱色谱柱进样口进样口检测器检测器高压输液系统高压输液系统 + 进样系统进样系统 + 分离系统分离系统 + 检测系统检测系统高效
14、液相色谱法(11)课件一、高压输液系统一、高压输液系统1. .高压泵高压泵要求：要求：输出压力高输出压力高平稳、脉冲小平稳、脉冲小流量稳定可调流量稳定可调耐腐蚀耐腐蚀LC最重要的部最重要的部件件高效液相色谱法(11)课件2. .梯度洗脱装置梯度洗脱装置 低压梯度（外梯度）低压梯度（外梯度） 高压梯度高压梯度 （内梯度）（内梯度） 通过改变流动相的组成来调整组分通过改变流动相的组成来调整组分的的k k值，改变分离因子值，改变分离因子值，以达到值，以达到最短时间最短时间内得到内得到最佳分离最佳分离的目的。的目的。梯度洗脱梯度洗脱改善分离改善分离缩短分离时缩短分离时间间泵泵增压增压 混合混合 混合混
15、合 泵输入泵输入 按比例按比例高效液相色谱法(11)课件等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱高效液相色谱法(11)课件梯度洗脱的梯度洗脱的特点特点 改善分离改善分离, 加快分析速度；加快分析速度； 改善峰形改善峰形, 减少拖尾减少拖尾; 可能引起可能引起基线漂移基线漂移梯度洗脱适用于：梯度洗脱适用于： 分配比变化范围宽的复杂样品分配比变化范围宽的复杂样品高效液相色谱法(11)课件3. .贮液瓶及流动相贮液瓶及流动相1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2) 适用于所选择的检测器。适用于所选择的检测器。3) 化学惰性好，以免破坏固定相。化学惰性
16、好，以免破坏固定相。4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5) 纯度高，溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。纯度高，溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。对流动相溶剂的一般要求对流动相溶剂的一般要求高效液相色谱法(11)课件二二、进样系统、进样系统 准备状态准备状态 进样状态进样状态六通阀进样六通阀进样装置装置 自动进样器自动进样器 直接进样直接进样进样阀进样阀自动进样器自动进样器高效液相色谱法(11)课件三三、色谱柱、色谱柱内径：内径：16 mm，柱长：柱长：530 cm；柱填料粒径：柱填料粒径： 5m 分离柱分离柱色谱仪心色谱仪心脏脏 预柱（保护柱
17、、前置柱）预柱（保护柱、前置柱）高效液相色谱法(11)课件四四、检测系统、检测系统1. .紫外吸收检测器紫外吸收检测器( (ultraviolet photometric detector)(b) 可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器(c) 二极管阵列检测器二极管阵列检测器(a) 固定波长紫外检测器固定波长紫外检测器通用型通用型选择型选择型氘灯氘灯190-600nm光栅光栅流流通通池池测测量量光光电电二二极极管管参比参比光电二极管光电二极管分束器分束器聚焦聚焦高效液相色谱法(11)课件两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器二
18、极管阵列检测器(b)(a)高效液相色谱法(11)课件灵敏度高灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱、梯度洗脱、色谱峰的识别和纯度分析色谱峰的识别和纯度分析。不能分析紫外没有吸收的化合物。流动相选择有限制。不能分析紫外没有吸收的化合物。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂CS2氯仿氯仿四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙腈乙腈 甲醇甲醇水水紫外截止紫外截止波长波长/nm380245212210190205187紫外检测器特点紫外检测器特点高效液相色谱法(11)课件2. .荧光检测器荧光检测器( (fluorescencl detec
19、tor)灵敏度高，比灵敏度高，比UV高高103倍倍选择性好，选择性好，可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 弧灯弧灯220-650nm高效液相色谱法(11)课件3. .示差折光检测器示差折光检测器( (differentical refractive index detector) ) 利用组分与流动相的利用组分与流动相的折射率折射率之差进行检测。之差进行检测。 通用性好通用性好，灵敏度较低灵敏度较低，不适用于梯度洗脱不适用于梯度洗脱。高效液相色谱法(11)课件4. .电化学检测器电化学检测器(electrochemical detector)电导检测器电导检测器安培检测器安培检测器7. .质谱检
20、测器质谱检测器LC-MS6. 化学发光检测器化学发光检测器5. .蒸发光闪射检测器蒸发光闪射检测器(evaporative light seattering detector, ELSD)高效液相色谱法(11)课件11-5 LC应用应用一、定性分析一、定性分析 纯品对照法纯品对照法 光谱检测器定性：光谱检测器定性：IR、NMR、MS二、定量分析二、定量分析 同同GC高效液相色谱法(11)课件本章基本要求1. 液相色谱法分类液相色谱法分类2. 液相色谱仪器基本构成液相色谱仪器基本构成3. 高效液相色谱法分析条件的选择高效液相色谱法分析条件的选择4. 反相键合相色谱法原理及特点反相键合相色谱法原理及特点5. 梯度洗脱方法特点梯度洗脱方法特点6. 液相色谱定性和定量分析方法液相色谱定性和定量分析方法高效液相色谱法(11)课件作 业p.219 3，4，5，6，8，9 高效液相色谱法(11)课件
