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1、 液相色谱柱的选择和维护 1, 液相色谱柱的选择 2, 液相色谱柱的使用与维护(2) 从样品的基本类型出发,可以将样品归入几大类： 合成高分子: 合成高分子 高分子复合物大分子(M 10K) 生物高分子: 蛋白质 核酸 糖及糖缀合物 多肽 有机化合物 药物 其它小分子(M 10K) 天然产物 无机离子(3) 合成高分子的分离 分子量大、且分布不均匀 最有效的色谱分离方法是排阻色谱（SEC） 通常称之为GPC。 注意使柱子的分子量范围，即孔径与待分离 高分子相配。 通常选用交联聚苯乙烯凝胶柱子，硅胶基质 柱亦可应用。 选择合适的计算机软件，以便可与其它分子 量测定法，如粘度法相比对。 使用聚苯乙
2、烯标样以标定流出曲线。(4) 合成高分子复合物分析 这里的复合物指添加有各种添加剂或助剂的 高分子制品。 添加剂和助剂通常为小分子，其总含量低于 主体（基质）高分子材料，但种类繁多，一 般的分离程序多采用样品预处理法将基质与 助剂分离，但复杂体系分离困难。 推荐以排阻色谱法将基质高分子与助剂分离； 助剂再以正相色谱或反相色谱分离,然后再以 结构测定方法定性(MS、LCMS、NMS等)(5) 蛋白质分离、分析 可选用的色谱模式有SEC（此处亦称GFC）、离子 交换、疏水相互作用和反相色谱。特殊情况下选 用亲和色谱。 所有分离蛋白质的色谱柱填料都必须是大孔或无 孔的。 从复杂体系中分离出目的蛋白往
3、往需将几种方法 联合使用。 多数情况下，多步骤分离过程的第一步和最后一 步多采用GFC。第一步为粗分离，最后一步为脱 盐。 灵活运用离子交换色谱，有时可以事半功倍。 疏水作用色谱有利于保护乃至提高活性回收 率；但高盐浓度往往造成设备的腐蚀和环境 问题。 反相色谱为迫不得已时所用。其缺点是成本 高、产品易失活及溶剂造成环境问题。 亲和色谱具最高的选择性，最适于固定的单 一品种产物的分离与纯化。 使用反相色谱时，以碳链短的填料较为适宜。(6) 核酸分析 核酸分析时，优先选择无孔型填料 寡核苷酸分析时，既可选用多孔型填料， 也可选用无孔型填料。通常，链长在 200bps以上时，亦选用无孔型。 核酸分
4、析时首选粒径24、无孔的DEAE型 或季胺盐型离子交换填料 合成的寡核苷酸一般链长较短，可采用多 孔型填料 未脱保护基的寡核苷酸可以用反相色谱法 分析，离子交换色谱亦可应用。(7) 糖及糖缀合物 有些寡糖分子量很小，为方便起见一并在 一起讨论 对糖类的分析可采用亲水相互作用色谱、 SEC、反相色谱和高pH值离子交换色谱 高分子量的糖及糖缀合物宜选用 SEC 分离 高pH下的离子交换结合脉冲安培法检测， 可获得高分辨率和高灵敏度。 如不需要分辨率，则首选亲水相互作用色 谱。（氨丙基键合相、高CH3CN含量水溶液 为流动相）保留值虽水增多而下降。 新出现的高聚物型氨基柱亦可使用。 反相色谱分离糖时
5、，往往使用水为流动相， 与通常的RP柱相反。残留有较多硅醇基或金 属离子的柱子有时可获得较好效果。 如前所述，石墨化碳柱有可能在糖分离上发 挥优势。(8) 多肽分离分析 首选的方法是反相色谱 标准方法是以0.1%TFA-H2O-CH3CN为流动 相进行梯度淋洗 如使用高分子型反相柱,则可以用HCl取 代TFA，HCl的紫外吸收小是其一大优点。 强亲水性肽的分离可使用石墨化碳填料柱。(9) 其它小分子有机化合物的分离与分析 几乎所有的色谱模式均可应用于此类化合物。 对于非极性化合物，首选正相色谱。硅胶、氧 化铝和硅胶键合正相（二醇型、CN型、NH2型 均可应用）。 若用于分析，则推荐使用硅胶键合
6、正相柱，其 重复性能优于硅胶柱。 GPC柱可用于复杂体系中小分子化合物的分离， 但宜使用小孔径GPC填料。 对于极性化合物，可使用GFC；必要时可以在 流动相中加入水溶性有机溶剂。 极性化合物首选的分离方法是反相。 可解离水溶性化合物可选用离子交换型柱。 可解离化合物还可以利用离子对色谱以反相 色谱柱进行分离。 即使是同类型的反相柱，也会具有不同的选 择性，宜细致地加以选择。(11) 无机离子分析 通常可选用离子色谱 一般的离子交换色谱亦可应用。二、色谱柱的使用和维护 （以硅胶基质反相柱为例）1，使用中需注意的事项 新柱子应注意其保存在什么溶剂中；应以 互溶渐进原则置换所需的体系。 新柱子应测
7、定并记载其初始性能档案。包 括：柱效、柱压、色谱峰不对称因子。 测定柱效时可选用厂商提供的标准样合色 谱条件，以进行比较。 为考察自己所分离的体系，可选定12种 标准物合分离条件，以进行测定、比较。(2)、色谱条件的选择 色谱操作条件的选择，需严格遵循该色 谱柱所能承受的条件，主要包括： pH 值：一般为pH2-8，特殊者需根据说明书 操作 压力：硅胶基质的反相填料一般可用于400bar 以下操作；大孔及高孔容填料会大大降低 压力脉冲：进样阀切换导致高压脉冲 缓冲液：严格注意置换方法，防止盐结晶危害 设备。 方向：新柱子均标出出入口或方向(3)、引起色谱柱性能降低和分离变坏的原因 柱压升高：
8、机械性杂质堵塞进口滤片，导致压力升高 霉菌生长导致的压力升高。 溶质非特异吸附造成的阻力增大和压力升高 不同性质、互不混溶流动相造成的压力升高。 使用缓冲液后因盐析出造成的压力升高 溶质在流动相中沉淀造成的压力升高。分离性能下降 区分自然下降和不当使用下降：柱子一般可 正常使用 20005000 次进样；保护良好的柱 子更可达 10000 次以上，一次不当使用即可 造成永久性损坏甚至报废。 过低、过高的pH值会造成填料配基的脱落和 基质的溶解，造成柱子性能的极大破坏；这 种柱子的柱床往往已减少。 样品污染造成柱子形成非特异性吸附层，改 变了柱子的表面活性，使分离性能发生变化。 压力脉冲造成多孔
9、填料的崩坏和柱床结构的变 化。 不当制造和质劣滤板使填料流失而形成柱床体 积的改变。 入口滤板上机械性杂质造成的进样分流。 未完全平衡的柱子表面状况不稳定柱外效应： 如过长的连接管线，连接管线内径太大等均 造成柱效下降。、峰形异常： 分裂峰： 堵塞在入口滤片上的固体杂质导致的样品溶 液流型变化 柱入口处柱床塌陷。 进样阀切换不连续 峰拖尾： 填料表面性能改变，如pH不当引起的配基脱 落。 非特异性吸附造成填料表面活性位点的损失 及“新”活性位点的产生。 过大的进样量造成非线性吸附。 性能变换的柱子导致相邻峰不完全分离。无规杂峰： 流动相中高保留杂质的积累与慢洗脱 流动相长霉导致的复杂杂质 管路
10、等吸附杂质的释放 上次进样后没洗脱的强保留峰在以后的进 样时出峰。 样品的分解与变质：以生物样品为甚 梯度洗脱时的杂质浓集效应基线不断提高： 强保留杂质的慢解吸倒峰： 无或低光吸收峰或吸光度比流动相低的溶 剂峰。（4）柱子的清洗与再生 针对故障发生的原因，可消除大部分故障 清洗： （恒溶剂）多次进样后，以20倍柱体积的 90100的甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋 喃等强溶剂清洗 对用过缓冲液的柱子，先以同浓度但不含 缓冲液成分的流动相洗20倍柱体积后，再 以强溶剂洗。 有时可直接以纯水洗至柱内无盐后，再以 强溶剂洗脱。 如上述情况无效，则换用更强溶剂情况，如 逐步置换至乙酸乙酯乃至烃类情况。返回原 系统时亦应逐步更替。 可用于清洗的溶剂体系： 100甲醇；100乙腈 75乙腈25异丙醇； 100异丙醇 100氯仿； 100正已烷 50DMSO或DMF/H2O 如使用有UV吸收的溶剂（如氯代烃）则 需将基线洗至稳定的基线 过高的粘度会导致高压，应注意不使其 超压 “掉头使用”：一般无妨，但注意若进口 滤片孔大时，不可掉头。 掉头使用时宜卸下检测器 上述讨论是针对硅胶为基质的柱子而言的。若是有机基质的柱子则简单得多。有机基质多有良好的化学稳定性，因此，只须用0.10.5 mol/L的碱溶液即可简单地进行柱子的清洗和消毒。
