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1、RNA病毒检测简述RT-PCRRT-PCR原理原理提取总提取总RNARNA以其中的以其中的mRNAmRNA作为模板作为模板 反转录反转录cDNAcDNAPCRPCR作模板作模板获得目的基因获得目的基因总总RNARNA提取方法（试剂盒）：提取方法（试剂盒）：异硫氰酸胍苯酚法（异硫氰酸胍苯酚法（Trizol Trizol 法）法）原理：原理：（1 1）TrizolTrizol的的主要成分是酚主要成分是酚。主要作用是。主要作用是裂解细胞裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。酚是有效的释放。酚是有效的蛋白变性剂蛋白变性剂，但不能完全抑制，但不能完全抑制RNA
2、RNA酶活性，因此酶活性，因此TrizolTrizol中还加入了中还加入了8-8-羟基喹啉、羟基喹啉、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源巯基乙醇等来抑制内源和外源RNaseRNase。 异硫氰酸胍异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类属于解偶剂，是一类强力的蛋强力的蛋白质变性剂白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离核蛋白迅速与核酸分离。（2 2）氯仿氯仿可使可使蛋白变性蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主，降低蛋白的溶解度。其主要作用是要作用是分相分相，实际上是，实际上是加速有机相和水相的分
3、加速有机相和水相的分层层。上层水相，上层水相，pH 5.1pH 5.1左右，当溶液左右，当溶液pHpH在酸性的在酸性的时候，时候，DNADNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNARNA分子留在水相。分子留在水相。而当而当pHpH接近中性时，接近中性时，DNADNA就会就会溶解在水相，（导致溶解在水相，（导致pHpH中性的原因可能是中性的原因可能是trizoltrizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使使trizoltrizol过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶液过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的
4、酚。中的痕量的酚。（3 3）异丙醇作用异丙醇作用是是沉淀沉淀RNARNA。异丙醇沉淀，优点是。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀容积小且速度快，主要沉淀DNADNA和大分子和大分子rRNArRNA和和mRNAmRNA，对，对5sRNA5sRNA、tRNAtRNA不产生沉淀，所以不产生沉淀，所以RNARNA电泳电泳的标志性三条带中的标志性三条带中5sRNA5sRNA带很不清楚，未必是你的带很不清楚，未必是你的RNARNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。降解。但是异丙醇难以挥发出去。（4 4）因为上述试剂会影响后续实验，所以用）因为上述试剂会影响后续实验，所以用75%75%乙乙醇洗醇洗1-2
5、1-2次次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥发，痕量的乙醇很容易挥发掉。发，痕量的乙醇很容易挥发掉。Yeast Total RNA二、二、cDNAcDNA的合成的合成p反转录酶：依赖于反转录酶：依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶种类：两种种类：两种1 1、禽类成髓细胞病毒（、禽类成髓细胞病毒（AMVAMV）反转录酶）反转录酶包括两个多肽亚基（包括两个多肽亚基（最适温度最适温度4242） 活性：依赖于活性：依赖于RNARNA的的DNADNA合成，依赖于合成，依赖于DN
6、ADNA的的DNADNA合合成以及对成以及对DNA:RNADNA:RNA杂交体的杂交体的RNARNA部分进行内切降部分进行内切降解解(RNA(RNA酶酶H H活性活性) )。2 2、鼠白血病病毒、鼠白血病病毒(M-MLV)(M-MLV)反转录酶反转录酶 只有单个多肽亚基（只有单个多肽亚基（最适温度最适温度3737） 活性：依赖于活性：依赖于RNARNA和依赖于和依赖于DNADNA的的DNADNA合成活性，但合成活性，但降解降解RNA:DNARNA:DNA杂交体中的杂交体中的RNARNA的能力较弱，且对热的能力较弱，且对热的稳定性较的稳定性较AMVAMV反转录酶差。反转录酶差。 M-MLVM-M
7、LV反转录酶能合成较长的反转录酶能合成较长的cDNA(cDNA(如大于如大于2-3kb)2-3kb)。 pcDNAcDNA引物引物种类：种类：1 1、随机引物、随机引物：不特异的引物：不特异的引物 体系中所有体系中所有RNARNA分子全部充当了分子全部充当了cDNAcDNA第一链模板，第一链模板，PCRPCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的常用此引物合成的cDNAcDNA中中96%96%来源于来源于rRNArRNA。 2 2、Oligo(dT)Oligo(dT)：是一种对是一种对mRNAmRNA特异的引物特异的引物绝大多数真核细胞绝大
8、多数真核细胞mRNAmRNA具有具有3-3-端端Poly(A)Poly(A)尾，此引尾，此引物（物（12-1812-18核苷酸）与其配对，仅核苷酸）与其配对，仅mRNAmRNA可被反转录。可被反转录。由于由于Poly(A)RNAPoly(A)RNA仅占总仅占总RNARNA的的1-4%1-4%，故此种引物合成，故此种引物合成的的cDNAcDNA比随机引物得到的比随机引物得到的cDNAcDNA在数量和复杂性方面在数量和复杂性方面均要小。均要小。 3 3、特异性引物、特异性引物 用含目标用含目标RNARNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的此类引物
9、仅产生所需要的cDNAcDNA，导致更为特异的，导致更为特异的PCRPCR扩增。扩增。 第二章第二章聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）* * * * PCR PCR PCR PCR，即聚合酶链式反应（，即聚合酶链式反应（，即聚合酶链式反应（，即聚合酶链式反应（Polymerase chain Polymerase chain Polymerase chain Polymerase chain reactionreactionreactionreaction）, , , , 是一种对特定的是一种对特定的是一种对特定的是一种对特定的DNADNADNADNA片段在体外进行快片段在体外进行快片段在
10、体外进行快片段在体外进行快速扩增的方法。速扩增的方法。速扩增的方法。速扩增的方法。 * * * * 由由由由1985198519851985年穆里斯（年穆里斯（年穆里斯（年穆里斯（K. MullisK. MullisK. MullisK. Mullis）发明，他也因此获）发明，他也因此获）发明，他也因此获）发明，他也因此获得了得了得了得了1993199319931993年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。PCRPCR的原理：的原理：体外体外体外体外DNADNADNADNA复制复制复制复制包括高温变性、包括高温变性、包括高温变性、包括高温变性、低温退火和中温低
11、温退火和中温低温退火和中温低温退火和中温延伸过程。延伸过程。延伸过程。延伸过程。一、一、PCRPCR基本步骤基本步骤三个步骤：三个步骤：1 1、变性变性(Denature)(Denature)：双链：双链DNADNA目的片段在目的片段在9494下解链。下解链。2 2、退火退火(Anneal)(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度：两种寡核苷酸引物在适当温度(50(50左右左右) )下与模板上的目的序列通过氢键配对。下与模板上的目的序列通过氢键配对。3 3、延伸延伸(Extension)(Extension)：在：在Taq DNATaq DNA聚合酶合成聚合酶合成DNADNA的最的最适温度
12、适温度(72(72左右左右) )下，以目的下，以目的DNADNA为模板进行合成。为模板进行合成。 二、二、PCRPCR反应中的主要成分反应中的主要成分p引物引物：好坏是：好坏是PCRPCR成败的关键。成败的关键。 设计原则设计原则：1 1、引物长度约为、引物长度约为16-30bp16-30bp。 2 2、引物中、引物中G+CG+C含量通常为含量通常为40%-60%40%-60%，粗略估计引物的，粗略估计引物的解链温度解链温度TmTm4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T)，且接近，且接近7272最好。最好。 3 3、四种碱基应随机分布，在、四种碱基应随机分布，在33端不存在连续端不
13、存在连续3 3个个G G或或C C，因这样会使引物在，因这样会使引物在G+CG+C富集序列区引发错误。富集序列区引发错误。 4 4、引物、引物3-3-端最好与目的序列阅读框架中密码子端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。摆动产生的不配对。5 5、在引物内，尤其在、在引物内，尤其在3-3-端应不存在二级结构，端应不存在二级结构，且且3-3-端尽量不用端尽量不用A A，尤应避免连续，尤应避免连续2 2个或个或2 2个以个以上上A A，因为，因为A A引发错配的几率高；最好选择引发错配的几率高；最好选择T T
14、。6 6、两引物之间尤其在、两引物之间尤其在3-3-端不能互补，以防出现端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4 4个连续碱基的同源性或互补性。个连续碱基的同源性或互补性。7 7、引物、引物5-5-端对扩增特异性影响不大，可在引物端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5-5-端限制酶位点外再加端限制酶位点外再加1-21-2个保护碱基。个保护碱基。 8 8、引物不与模板结合位点以外的
15、序列互补。、引物不与模板结合位点以外的序列互补。引物浓度引物浓度： 一般一般PCRPCR反应中的引物终浓度为反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。则降低产量。 p4 4种三磷酸脱氧核苷酸种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)：dNTPdNTP原液一般配成原液一般配成2.5-10mmol/L2.5-10mmol/L分装，分装，-20-20贮存。贮存。一般反应中每种一般反应中每种dNTPdNTP的终浓度为的终浓度为20-200mol/L20-200mol/L。当当
16、dNTPdNTP终浓度大于终浓度大于50mmol/L50mmol/L时可抑制时可抑制Taq DNATaq DNA聚合聚合酶的活性。酶的活性。4 4种种dNTPdNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTPdNTP的不足出现的错误掺入。的不足出现的错误掺入。 pMgMg2+2+： MgMg2+2+浓度对浓度对Taq DNATaq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常通常M
17、gMg2+2+浓度范围为浓度范围为0.5-2mmol/L0.5-2mmol/L。对于一种新的。对于一种新的PCRPCR反应，可以用反应，可以用0.1-5mmol/L0.1-5mmol/L的递增浓度的的递增浓度的MgMg2+2+进进行预备实验，选出最适的行预备实验，选出最适的MgMg2+2+浓度。浓度。 在在PCRPCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或电荷的基团，例如磷酸基团或EDTAEDTA等可能影响等可能影响MgMg2+2+浓度的物质，以保证最适浓度的物质，以保证最适MgMg2+2+浓度。浓度。 p模板模板：PCRPCR中
18、模板中模板DNADNA可以是单链分子，也可以是双链分可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子子，可以是线状分子，也可以是环状分子( (线状分线状分子比环状分子的扩增效果稍好子比环状分子的扩增效果稍好) )。 就模板就模板DNADNA而言，影响而言，影响PCRPCR的主要因素是模板的数的主要因素是模板的数量和纯度。量和纯度。一般反应中模板量为一般反应中模板量为10102 2-10-105 5个拷贝。扩增单拷贝个拷贝。扩增单拷贝基因，需要基因，需要0.1g0.1g的人基因组的人基因组DNADNA，10ng10ng的酵母的酵母DNADNA，1ng1ng的大肠杆菌的大肠杆菌D
19、NADNA。多拷贝基因扩增用量。多拷贝基因扩增用量更少。更少。模板过多可能增加非特异性产物。模板过多可能增加非特异性产物。DNADNA中的杂质中的杂质也会影响也会影响PCRPCR的效率。的效率。 pTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶：一般一般Taq DNATaq DNA聚合酶活性半衰期为聚合酶活性半衰期为92.5 130min92.5 130min，95 40min95 40min， 97 5min97 5min。Taq DNATaq DNA聚合酶的酶活性单位定义为聚合酶的酶活性单位定义为74 30min74 30min，掺入掺入10nmol/L dNTP10nmol/L dNTP到核酸
20、中所需的酶量。到核酸中所需的酶量。Taq DNATaq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般般PCRPCR中出错率为中出错率为210210-4-4核苷酸核苷酸/ /每轮循环，在利用每轮循环，在利用PCRPCR克隆和进行序列分析时尤应注意。克隆和进行序列分析时尤应注意。 所用的酶量可根据所用的酶量可根据DNADNA、引物及其它因素的变化进、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。过少则使产量降低。反应结束后，需要灭活反应结束后，需要灭活Taq DNATaq DNA聚
21、合酶。聚合酶。 灭活灭活Taq DNATaq DNA聚合酶的方法有：聚合酶的方法有：(1) PCR(1) PCR产物经酚产物经酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀。氯仿抽提，乙醇沉淀。 (2) (2) 加入加入10mmol/L10mmol/L的的EDTAEDTA螯合螯合MgMg2+2+ 。 (3) 99-100(3) 99-100加热加热10min10min。目前已有。目前已有直接纯化直接纯化PCRPCR产物的产物的KitKit可用。可用。 p反应缓冲液反应缓冲液：反应缓冲液一般含反应缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl (2010-50mmol/L TrisCl (20下下pH8.3-8.
22、8)pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl50mmol/L KCl和适当浓度的和适当浓度的MgMg2+2+。50mmol/L50mmol/L的的KClKCl有利于引物的退火。有利于引物的退火。 加入加入5mmol/L5mmol/L的二硫苏糖醇的二硫苏糖醇(DTT)(DTT)或或100g/ml100g/ml的牛血的牛血清白蛋白清白蛋白(BSA)(BSA)，可稳定酶活性；加入，可稳定酶活性；加入T4T4噬菌体的基噬菌体的基因因3232蛋白对扩增较长蛋白对扩增较长DNADNA片段有利。片段有利。各种各种Taq DNATaq DNA聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。 结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！29
