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1、.性传播疾病的实验室诊断1.讲授内容 性病概述（性病的概念、危害、研究范围） 梅毒的实验室诊断（临床、实验室诊断） 淋病的实验室诊断（临床、实验室诊断） 非淋菌性尿道炎（临床、实验室诊断） 生殖器疱疹（临床、实验室诊断） 尖锐湿疣的实验室诊断（临床、实验室诊断）2性病（Venereal diseases, VD）是指通过性交传染的、具有明显生殖器损害症状的全身性疾病，亦称为经典性病。包括梅毒、淋病、 软下疳和性病性淋巴肉芽肿。性传播疾病（sexually transmitted diseases , STD）：是指通过性接触可以传染的一组传染病，在我国，人们简称为性病。其概念不同于经典性病，包
2、容的病种 20余种。性病防治管理办法: 梅毒，淋病，尖锐湿疣，非淋菌性尿道炎，生殖器疱，软下疳，性病性淋巴肉芽肿，艾滋病。STD是自古就有的，只是由于人类活动范围的扩大，交流增多，性行为更随意，性病的范围在不断扩大。性病在我国广泛流行，它不仅危害个人健康，也殃及家庭，遗害后代，同时还危害社会,成为严重的公共卫生和社会问题。.性传播疾病的概念3性病的危害(1) 感染性病后不及时发现并彻底治疗，不仅可损害人的生殖器官，导致不孕不育、异位妊娠、早产、流产和死胎等，有些性病还可损害心脏、脑等人体的重要器官，甚至导致死亡。有些性病一旦染上是难以治愈的，如尖锐湿疣、生殖器疱疹。 有相当一部分的性病患者症状
3、较轻或没有任何明显的症状，但却可以通过各种性病传播途径传给其他健康人。4性病的危害(2) 性病的流行还给家庭带来严重危害。例如淋病，通常情况是，夫妇中的一方由于某种原因而感染上淋病，然后通过夫妻间的性生活，传染给对方，家中的孩子或是通过母婴途径传播，或是通过日常生活的接触而被感染，使得一家人都深受其害。 性病还能促进艾滋病的传播和流行。5陕西省皮肤性病防治所 朱参胜1.临床：早期、准确诊断，发现无症状感染者评估治疗效果，判断治愈指导临床用药，耐药性监测2.流行病学监测：2011.7病例报告患病率调查耐药监测3. 科研： 基础性 应用型研究Generated by Foxit PDF Creat
4、or Foxit Software For evaluation only.性病实验室诊断的应用6.性病研究范围性病防治管理办法指定的8种性病1. 梅毒2. 淋病3. 尖锐湿疣4. 非淋菌性尿道炎5. 生殖器疱疹6. 软下疳7. 性病性淋巴肉芽肿8. 艾滋病7梅毒概念：梅毒（英文名称：syphilis）是由苍白（梅毒）螺旋体(Treponema pallidum)引起的慢性、系统性性传播疾病(VD, STD)。绝大多数是通过性途径传播，临床上可表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潜伏梅毒。临床上以阴部糜烂，外发皮疹，筋骨疼痛，皮肤起核而溃烂，神情痴呆为主要表现的传染病。是中华人民共和国传染病防
5、治法中，列为乙类防治管理的病种。.一、梅毒syphilis8一期梅毒：标志性临床特征是硬下疳，潜伏期24周，外生殖器部位发生暗红色硬肿块、浅溃疡，有软骨样硬度，周围淋巴结肿大。二期梅毒：在一期梅毒12个月之后，全身皮肤、粘膜发生对称泛发皮疹、斑疹、丘疹、脓疱疹等。粘膜可发生粘膜斑、扁平湿疣，传染性强。.9三期梅毒：发生在感染后23年乃至10年，皮肤为树胶样肿，还可涉及骨、关节、心、血管，表现为主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全和主动脉瘤等，侵及神经为脊髓痨，全身麻痹。10梅毒流行简况（1） 全球每年约有1200万新发病例，主要集中在南亚、东南亚和非洲。 于1505年经印度传入我广东，至今已500多年。
6、 解放前是中国四大性病之首，60年代初基本被消灭，80年代再次发生和流行。 1991年报告病例数为1870例，1995年11336例，1997年33668例。呈明显增多趋势，临床经常可见一、二期梅毒，也已发现三期梅毒和先天梅毒。 在义务献血员中发现隐性梅毒。11梅毒流行简况（2） 梅毒患者的皮肤、粘膜中含梅毒螺旋体，未患病者在与梅毒患者的性接触中，皮肤或粘膜若有细微破损则可得病。 极少数可通过输血或其它途径传染。 获得性梅毒 （后天）的早期梅毒病人是传染源，95%是通过不洁性交传染，少数通过接吻、握手、输血、接触污染的内衣、湿毛巾、茶杯、烟斗、哺乳、尿布等传染。 胎儿梅毒（先天 ）：孕妇体内螺
7、旋体，一般在妊娠34月通过胎盘感染婴儿。12 病因：梅毒螺旋体侵入人体后经过23周潜伏期，即发生皮肤损害(典型损害为硬下疳)这是一期梅毒。发生皮肤损害后机体产生抗体，梅毒初期的组织学特征是单核细胞侵润，在感染的第6天，即有淋巴细胞浸润，此时梅毒螺旋体见于硬下疳中的上皮细胞间隙中，以及位于上皮细胞的内陷或吞噬体内，或成纤维细胞、浆细胞、小的毛细血管内皮细胞之间及淋巴管和局部淋巴结中。由于免疫的作用使梅毒螺旋体迅速地从病灶中消除。感染的第24天后，免疫荧光检测未发现梅毒螺旋体的存在，螺旋体大部分被杀死，进入无症状的潜伏期此即一期潜伏梅毒。13梅毒的暗视野显微镜检查（1） 暗视野显微镜检查：是一种检
8、查梅毒螺旋体的方法。暗视野，顾名思义即是显微镜下没有明亮的光线，它便于检查苍白的螺旋体。这是一种病原体检查，对早期梅毒的诊断有十分重要的意义。 早期皮肤粘膜损害（一期、二期）可查到苍白螺旋体。一期梅毒苍白螺旋体多在硬下疳的硬结、溃疡的分泌物和渗出液中存在，肿大的淋巴结穿刺也可检出。二期梅毒苍白螺旋体可在全身血液和组织中检出，但以皮肤检出率最高。早期先天性梅毒，可以通过皮肤或粘膜损害处刮片发现梅毒苍白螺旋体。14基本原理：皮损渗出液、淋巴结穿刺液涂片暗视野显微镜下观察形态，运动方式。暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）：聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本
9、反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4200 nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。标本采集： 皮肤黏膜组织液：带乳胶手套，擦去去污物，钝刀轻刮、挤压，避免出血，取渗出液，预先有生理盐水的载玻片上，加盖玻片。 淋巴液：无菌穿刺，注入生理盐水，反复抽吸，取少量淋巴液，滴加至载玻片上，加盖玻片。Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.暗视野显微镜检查（2）15操作步骤： 加镜油至聚光器上(不要将镜油加载盖玻片上) 聚光 镜检结果判读： 形态：纤细
10、、白色、有折光、螺旋状 运动方式：旋转、蛇行、伸缩结果报告：阳性：见到上述特征的螺旋体阴性：未见到上述特征的螺旋体.暗视野显微镜检查（3）16.暗视野显微镜检查（4） 临床意义： 阳性：确诊梅毒 阴性：复检，血清学检查 注意事项: 避免出血 及时 对废弃物及时处理，梅毒病原体为苍白螺旋体，对外界抵抗力弱，离体后一般1-2小时内死亡，对干燥和热敏感，但对冷抵抗力较强，低效消毒剂也可将其消灭。17镀银染色法（1） 基本原理：梅毒螺旋体亲银性银溶液染色镜下观察。 标本采集（同暗视野显微镜检查）：皮肤黏膜组织液淋巴液18Generated by Foxit PDF Creator Foxit Soft
11、ware For evaluation only.镀银染色法（2） 操作步骤：涂片干燥（空气中自然干燥）固定：罗吉固定液（甲醛，乙酸）23 min洗涤：无水酒精媒染：鞣酸媒染剂，微加热，染30sec，水洗银染：银染液，微加热，染30sec，水洗镜检：油镜19镀银染色法（3） 结果判读：棕褐色梅毒螺旋体 结果报告：阳性：见到棕褐色梅毒螺旋体阴性：未见到棕褐色梅毒螺旋体 临床意义：阳性：确诊梅毒阴性：复检，血清学检查 注意事项:与其它螺旋体的鉴别20.21.梅毒的血清学检测方法 梅毒血清学检查对于诊断二期、三期梅毒，以及判定梅毒的发展和痊愈，判断药物的疗效都有十分重要的意义。梅毒血清学检查包括非梅
12、毒螺旋体抗原血清学试验和梅毒螺旋体抗原血清学试验。前者常用于临床筛选及判定治疗的效果，抽血后1小时即可出结果，费用也低廉。后者主要是用于判定试验，但是它不能判定治疗效果，一旦患有梅毒，这一试验将终身阳性。22.梅毒血清学检测方法的分类 非梅毒螺旋体抗原血清试验 VDRL试验 RPR试验 TRUST试验 梅毒螺旋体抗原血清试验 TPPA试验 TPHA试验 FTA-ABS试验 TP-ELISA试验 TP-WB试验23Venereal Disease ResearchLaboratory基本原理：梅毒螺旋体感染宿主产生抗类脂抗原的抗体与心磷脂、卵磷脂、胆固醇混合物（抗原）凝集反应标本采集: 血清：静
13、脉血25ml，及时离心，保存于28，长期保存于-20。 脑脊液：专业人员操作，有血细胞，2000rpm离心。 操作步骤： VDRL抗原配制 VDRL玻片定性实验 灭活 吸样 加抗原 反应,低倍显微镜观察.VDRL试验（1）24弱阳性或可疑（滴度），或阴性但有临床症状时需做定量试验（前带现象） VDRL定量试验加稀释液样本稀释：系列稀释加抗原反应凝集反应强度分级： 3+4+：中到大絮状物，液体清亮 2+：絮状物较小，液体较清亮 1+：小凝集物，均匀分布，液体浑浊 ：抗原抗体复合物颗粒稍粗 -：抗原颗粒均匀、细小VDRL试验（2） 当VDRL定性试验为阳性、 结果判读25VDRL试验（3）灭活：血
14、清是在56oC加热30分钟，除去非特异性抑制剂（如补体）。VDRL用于脑脊液的测定：对脑脊液的测定诊断神经梅毒,首选定量VDRL。测试中有一些变化: 用等量的10盐水稀释样品，脑脊液不能被加热（或灭活），样品体积为0.01毫升，旋转时间为8分钟。其余的程序同血清。26.VDRL试验（4） 结果报告： 定性 阳性：1+4+ 阴性 定量 滴度：最高稀释倍数 临床意义： 脑脊液VDRL阳性对神经梅毒有诊断意义。 患有其它疾病可能产生假阳性结果，包括一些病毒感染（单核细胞增多，肝炎）、药物、怀孕、风湿热、类风湿关节炎、红斑狼疮、麻风。 滴度与病情相关（即滴度下降表明成功的治疗），用于预后判定。27Ra
15、pidPlasmaReagin(RPR)基本原理：VDRL试验的改良。抗原+活性炭颗粒+抗体黑色絮状物（肉眼可见）。反应素：Tp（梅毒病毒）侵入人体破坏组织后，组织中的磷脂粘附于螺旋体表面形成复合抗原。从而使机体产生抗磷脂的自身抗体，这种抗体称为反应素。标本采集: 血清：新鲜分离或冻存 血浆：各种抗凝剂操作步骤： 定性实验 加样 加抗原 反应 RPR试验（1）28RPR试验（2） 定量实验 稀释液准备 加样：系列稀释 加抗原 反应（旋转8min） 结果判读凝集反应强度分级： 3+4+：中到大黑色絮状物，液体清亮 2+：黑色絮状物小到中，液体较清亮 1+：小黑色凝集物，液体浑浊 -：碳颗粒集中于
16、中央一点或均匀分散29RPR试验（3） 结果报告： 定性 阳性：1+4+ 阴性 定量 滴度：最高稀释倍数 临床意义： 比VDRL简便（血清不需灭活，加有氯化胆碱） 适用于筛查、疗效观察、复发或再感染 未经治疗的一期、二期和潜伏梅毒的敏感性：86%、100%和98%30指示物，阳性结果为红色絮状物 标本采集：血清血浆操作步骤：定性：加样（50L)加抗原（一滴）反应（8min)TRUST试验（1） （Tolulizedredunheatedserumtest,TRUST） 基本原理：用甲苯胺红代替RPR试验中的碳颗粒，作为31定量： 稀释液（50L生理盐水) 加样（50L血清/血浆) ，倍比稀释
17、加抗原（一滴） 反应（8 min)结果判读 凝集反应强度分级： 3+4+：中到大凝集物，液体清亮 2+：小到中凝集物，液体较清亮 1+：小凝集物，液体浑浊 -：甲苯胺红集中于中央或均匀分散.TRUST试验（2）32结果报告： 定性: 阳性：1+4+; 阴性 定量: 滴度：最高稀释倍数临床意义： 适用于筛查、疗效观察、复发或再感染 用正常牛心肌的心类脂作为抗原，而不是用螺旋体作为抗原，来测定病人血清中的反应素（非特异性抗体-抗心磷脂抗体）。 用来初步筛查梅毒螺旋体感染。反应素在初期梅毒病灶出现后12周就可测出，在二期梅毒滴度最高，三期梅毒较低。 所用抗原不具有特异性，除梅毒病人外，一些非梅毒疾患
18、也可暂时或长期地存在反应素。例如麻风、结核、传染性单核细胞增多症、红斑狼疮、类风湿性关节炎、回归热、以及一些发热性疾病。 此外，在孕妇、老年人和吸毒者有生物学假阳性反应。.TRUST试验（3）33凡确诊为梅毒者，治疗前最好做定量试验。两次定量试验滴度变化相差2个稀释度以上时，才可判定滴度下降。梅毒患者在经过正规治疗以后，头三个月应当每月复查一次滴度，以后可改为每三个月复查一次，第二年每三个月或每半年复查一次，以观察比较当次与前几次的滴度变化的情况。梅毒患者治疗后的随访观察一般在两年的时间。如果每次检测的RPR的滴度呈现不断下降的趋势，说明抗梅治疗是有效的。如果连续三次到四次检测的结果都是阴性，
19、则可以认为该患者的梅毒已经治愈。.梅毒疗效判定34前带现象：一种抗原抗体反应的现象。以定量抗原检测抗体，若抗体过剩，可使所形成的免疫复合物反而减少，而不出现凝集。非梅毒螺旋体抗原血清试验中，有时血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性、不典型或阴性反应的结果，而临床上又表现为二期梅毒，此时将血清稀释后再进行试验，出现了阳性的结果，该现象称为前带现象。耐血清性（血清固定）：晚期耐血清性与梅毒的类型及开始治疗的时间早晚有关。晚期耐血清性病人已经足够量的治疗后，即使再予更多地或无限制地治疗也不能使血清滴度降低。对于这种病人，需经过详细的检查，排除神经、心脏与其他内脏梅毒后，作定期随访。.非梅毒螺旋体抗原
20、血清试验35 treponemapallidumparticleagglutinationassay(TPPA). 基本原理：超声裂解梅毒抗原+明胶粒子+血清抗梅毒抗体，凝集反应 标本采集：血清血浆 操作步骤：试剂准备加稀释液样品稀释加致敏明胶粒子和对照液（4个孔）混合：震荡30秒反应：2小时.TPPA试验（1）36结果判读: 阴性对照：未致敏粒子不出现凝集 凝集反应强度分级： 4+：粒子光滑，覆盖整个孔底 3+：粒子光滑，覆盖大部分孔底 2+：粒子光滑覆盖孔底，周围有一环 1+：粒子光滑覆盖孔底，周围有一明显环 ：粒子沉集孔底，中央形成一个小点 -：粒子紧密沉积孔底中央结果报告： 阳性：第3
21、孔不出现凝集，第4孔出现凝集1+4+ 阴性：第3孔和第4孔均未出现凝集.TPPA试验（2）37.TPPA试验（3） 临床意义：初筛阳性的确证治疗后，TPPA试验仍可为阳性，不能作为疗效观察结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果，区分既往和现症感染 注意事项：“可疑”：其他方法复检非特异性凝集：稀释复检或其他方法复检38 Treponemapallidumhaemagglutinationassay 基本原理：超声裂解梅毒抗原+羊红细胞+血清抗梅毒抗体-凝集反应标本采集： 血清 血浆 操作步骤：试剂准备加稀释液（5个孔）样品稀释（5个孔）加对照液混合：震荡30秒反应：4小时 TPHA试验（1）39结果
22、判读: 阴性对照：未致敏血球不出现凝集 凝集反应强度分级： 4+：凝集物光滑，覆盖整个孔底 3+：凝集物光滑，覆盖大部分孔底 2+：凝集物光滑覆盖孔底，周围有一细胞环 1+：凝集物光滑覆盖孔底，周围有一明显细胞环 ：凝集物沉集孔底，中央形成一个小点 -：凝集物紧密沉积孔底中央 TPHA试验（2）40结果报告： 阳性：第三孔不出现凝集，第4孔出现凝集1+4+ 阴性：第3孔和第4孔均未出现凝集临床意义： 初筛阳性的确证 治疗后，TPHA试验仍可为阳性，不能作为疗效观察 结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果，区分既往和现症感染注意事项： “可疑”：其他方法复检 非特异性凝集：稀释复检或其他方法复检 TP
23、HA试验（3）41.FTA-ABS试验（1） Fluorescenttreponemalantibodyabsorptiontest 基本原理：血清+稀释剂（Reiter株螺旋体制备而成）-吸收-完整梅毒抗原+第二抗体（FITC标记)，荧光显微镜下观察-苹果绿色荧光 标本采集：血清脑脊液42操作步骤： 血清灭活：56，30min 血清稀释：血清用吸收剂稀释，阳性血清用PBS稀释 加样：设置6种对照(PBS,吸收剂，PBS+阳性对照，PBS+阴性对照，吸收剂+阳性对照，吸收剂+阴性对照；样品血清10ul（稀释后） 洗涤： 加荧光抗体：37，30min 洗涤： 封片、读片 FTA-ABS试验（2）
24、43.FTA-ABS试验（3） 结果判读:阳性对照：绿色荧光的螺旋体阴性对照和空白对照：不产生荧光 结果报告：阳性：绿色荧光的螺旋体阴性：无荧光或淡绿色螺旋体44.FTA-ABS试验（4） 临床意义： FTA-ABS:梅毒螺旋体抗原血清学试验的“金标准” 初筛阳性的确证 治疗后， FTA-ABS 仍可为阳性，不能作为疗效观察 结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果，区分既往和现症感染 用于神经梅毒的诊断 注意事项： 洗涤：干净，除去杂质，以免影响结果判读 高质量荧光显微镜，技术熟练45.TP-ELISA试验（1） 基本原理：包被抗原+血清抗体+第二抗体（酶标记)-底物显色 标本采集：血清血浆46.T
25、P-ELISA试验（2） 操作步骤：加稀释液：加样：阳性、阴性对照，待检血清孵育： 37，60min，洗板加酶结合物： 37，60min，洗板加显色剂： 37，15min，终止反应：终止，比色47TP-ELISA试验（3） 结果判读:阈值：公式阳性对照：阴性对照和空白对照 结果报告：阳性阴性48TP-ELISA试验（4） 临床意义：适用于流行病学调查和大量样品的检查治疗后，TP-ELISA仍可为阳性，不能作为疗效观察结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果，区分既往和现症感染用于筛查 注意事项：不同批号试剂不能混用温度和时间必须严格控制49TP-WB试验（1） 基本原理：抗原印迹（硝酸纤维膜）+酶联反
26、应，检测多种成分的抗体 标本采集：血清血浆50TP-WB试验（2） 操作步骤：反应：工作缓冲液，样品，摇45min洗涤：工作缓冲液，洗涤3次加酶结合物：30min洗涤显色： 37，15min终止：51.TP-WB试验（3） 结果判读:阳性参比图观察45kD, 17kD, 15.5kD显色带 结果报告：阳性： 45kD, 17kD, 15.5kD均出现显色带阴性： 45kD, 17kD, 15.5kD无显色带52535455TP-WB试验（4） 临床意义：初筛阳性的确证治疗后，TP-WB试验仍可为阳性，不能作为疗效观察结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果，区分既往和现症感染 注意事项：洗涤要充分，否
27、则背景偏深对照条带应显示当45kD, 17kD, 15.5kD出现12个显色带，其他方法复检56.快速免疫色谱法（1） 基本原理：免疫色谱原理，采用吸附有显色标记的梅毒螺旋体重组抗原的试剂条，快速监测标本中的梅毒螺旋体抗体。 标本采集：血清血浆全血57操作步骤： 加样： 加缓冲液： 观察结果：结果判读: 质控条带 标本条带结果报告： 阳性：质控条带+标本条带 阴性： 质控条带 快速免疫色谱法（1）58快速免疫色谱法（1） 临床意义：用于标本的快速筛查结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果，区分既往和现症感染 注意事项：试剂平衡至室温假阳性和假阴性59梅毒IgM抗体的检测（1） 特异性IgM类抗体的产
28、生是感染梅毒和其他细菌或病毒后机体首先出现的体液免疫应答，一般在感染的早期呈阳性，随着疾病发展而增加，IgG抗体随后才慢慢上升。 经有效治疗后IgM抗体消失，IgG抗体则持续存在，TP-IgM阳性的一期梅毒病人经过青霉素治疗后，约24周TP-IgM消失。 二期梅毒TP-IgM阳性病人经过青霉素治疗后，28个月之内IgM消失。60梅毒IgM抗体的检测（2） 此外，TP-IgM的检测对诊断新生儿的先天性梅毒意义很大，因为IgM抗体分子较大，其母体IgM抗体不能通过胎盘，如果TP-IgM阳性则表示婴儿已被感染。 早期梅毒出现IgM抗体 产前感染:新生儿体内出现梅毒IgM 活动性神经梅毒:（脑脊液出现
29、梅毒IgM)6162胎传梅毒的实验诊断 胎传梅毒又称先天梅毒。系母体的梅毒螺旋体经血流透过胎盘而进入胎儿体内引起胎儿的各种病变，因此不发生一期梅毒损害。患者的母亲必须是梅毒患者。根据发病年龄不同分为早期先天梅毒及晚期先天梅毒。 早期先天梅毒：生后两岁以内发病，症状类似二期梅毒。晚期先天梅毒：生后两岁以上发病。其损害性质与后天梅毒的三期损害相似。 暗视野显微镜阳性 患儿非梅毒螺旋体血清抗体持续升高 患儿非梅毒螺旋体血清学定量试验结果比母亲高4倍（低于或等于该值并不能排除胎传梅毒） 患儿检出19S-IgM6364神经梅毒的实验诊断（1） 神经梅毒（neurosyphilis）：苍白密螺旋体侵害神经
30、系统所造成的疾病。一般发生在感染梅毒后的几年或几十年后，但在梅毒早期有的患者的脑脊髓液已有不正常的改变。一般可分为无症状型、脑膜血管型和实质型（如脊髓痨、麻痹性痴呆），各型可合并存在。神经梅毒也可与其他系统梅毒并发，例如心血管梅毒等。诊断除根据症状、体征、血清学试验等外，还要作脑脊髓液检查。青霉素仍将是治疗梅毒的最佳药物，但有青霉素过敏史者，可给予四环素或红霉素。6566神经梅毒的实验诊断（2） 诊断标准梅毒血清学试验阳性脑脊液细胞计数或蛋白结果异常脑脊液VDRL试验结果阳性脑脊液监测到梅毒IgM 脑脊液VDRL存在假阴性 FTA-ABS阴性排除神经梅毒，有假阳性 脑脊液细胞计数：白细胞大于107/L 脑脊液蛋白质量测定：大于0.4g/L67
