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1、高通量测序技术高通量测序技术2017年年3月月21号号主要内容n一、高通量测序简介n二、 Solexa和Semiconductor测序原理n三、高通量测序部分应用n高通量测序（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序（“Next-generation”sequencing），可一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序；n可以对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致和全貌的分析，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。 一、高通量测序简介高通量测序的发展1992年Lynx Therapeutics MPSS2003年Polony Sequenc
2、ing(哈佛）2005年454 Pyrosequencing2006年Solexa Sequencing-By-Synthesis2007年ABI SOLID2008年Helicos tSMS Sequencing2009年Ion Torrent Semiconductor Sequencing2011年Picfic Biosciences SMRT Sequencing高通量测序的主要代表平台有:p罗氏的(Roche)的454测序仪（Roche GS FLX sequencer）;pIllumina的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）;pABI的SO
3、LiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）;pThermo Fisher的离子半导体测序仪（Ion Semiconductor sequencer).ILLUMINA SOLEXA文库制备二、Solexa和Semiconductor测序原理Lane 1Lane 2Lane 8.TileEach lane contains 2 columnsEach column contains 60 tilesEach tile is imaged 4 times per cycleFLOWCELL簇生成，模板变性OHOHflowcelldiol P7 P5 dioldiolTemplate h
4、ybridizationdioldiol Initial extensiondioldiol Denaturation桥式扩增dioldiol1st cycle denaturation1st cycle annealingdioldioln=301st cycle extensiondioldioldioldiol2nd cycle denaturation2nd cycle annealingdioldioldioldioldioldiol2nd cycle extensionclusters并行合成测序法(SBS, SEQUENCING-BY-SYNTHESIS)和可逆性末端终止技术（R
5、EVERSIBLE TERMINATOR CHEMISTRY）CAGTCATCACCTAGCGTA5GTCAGTCAGTCAGT35First base incorporatedCycle 1: Add sequencing reagentsDetect SignalCleave Terminator and DyeCycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat信号收集读取碱基序列在测序过程中，每种碱基被激发后都会发出特殊波长的荧光在每个循环过程中每一个簇只对应一张图像测序通量读 长测序时长数据量2150bp29h100-200GB275 bp18h
6、50-80GB175 bp11h25-30GB适用范围全基因组测序、全外显子测序、转录组测序特 点高通量、灵活性、简便NextSeq 500测序通量读 长测序时长数据量275bp24h3.3-3.8GB2150bp24h4.5-5.1GB2250bp39h7.8-8.5GB2300bp55h13.2-15GB适用范围靶向测序、小基因组测序、靶向基因表达分析特 点唯一一台在单次运行产生2x300 bp双端reads的测序仪。MiSeqIllumina 测序平台展示测序通量读 长测序时长数据量2150bp1-3.5d1300-1500GB175 bp650-750GB150 bp215-250GB
7、适用范围全基因组测序、全外显子测序、转录组测序特 点最高的通量，每个样品的最低价格测序通量读 长测序时长数据量2150bp3d单流动槽 双流动槽8-9TB 16-18TB适用范围全基因组测序特 点超高的通量，有望突破人类全基因组测序的$1000大关Hiseq 4000HiSeq X TenNovaSeq 6000流动槽类型 S1 S2S3S4数据量a150bp167GB280-333GBN/AbN/Ab19h175 bp333GB560-667GBN/AbN/Ab29h2150 bp500GB850-1000GB2000GB3000GB40h适用范围全基因组测序、靶向重测序、转录组测序特 点对
8、几乎任何基因组、任何测序方法和规模的项目，都有可扩展的通量，灵活简便。a.所有产出和read数量规格都基于单个流动槽计算，NovaSeq 6000系统可同时运行1个或2个流动槽。b. N/A: 不适用。 Ion Semiconductor测序流程PCR产物纯化文库制备接头连接片段筛选样本混池克隆扩增不理想的扩增情况ISP富集（Ion Sphere Partical Enrichment）扩增引物的5端标记了生物素,通过链霉亲和素标记的磁珠与标记了生物素的DNA结合.测序自然情况下，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个H+，导致局部可检验的PH值发生变化，被离子传感器检测到，
9、从而转换为数字信号。碱基识别依次掺入4中碱基连续两个相同碱基结合Ion Torrent PGMIon Torrent仪器展示Chip类型PGM314PGM316PGM318传感器数1.3M6.3M11M数 据 量100MB1GB2GB运行时间2.3/4.7h3.0/4.9h4.4/7.3h读 长200/400bp200/400bp200/400bp应用范围扩增子测序、靶向重测序、小基因组测序特 点基于半导体技术测序原理，快速“读”出碱DNA序列高通量测序DNA全基因组测序人基因组重测序动植物基因组测序微生物基因组测序外显子组测序全外显子组测序靶向捕获测序（panel）甲基化测序扩增子测序RNA
10、mRNA测序Lnc RNA测序Small RNA测序Circular RNA测序三、高通量测序部分应用全基因组测序u全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel）、结构变异位点（SV）位点和拷贝数变异位点（CNV)。u全基因组de novo测序是指对未知基因组序列的物种进行从头测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。基因组测序策略外显子组测序外显子组外显子组一个物种基因组中全部外显子区域的总和；人外显子组只占基因组的1%，约30 Mb； 约85%的人类致病突变
11、都位于这1%的蛋白质编码序列上。文库构建Nimblegen、 Agilent IlluminamRNA测序(mRNA seq)是指利用高通量测序技术对cDNA进行测序从而得到一个样品中基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。mRNA测序文库构建扩增文库通过带oligoT的磁珠分离出mRNALncRNA是一类长度超过200nt的长链非编码RNA，通过与DNA、RNA或蛋白质结合，在表观遗传、转录及转录后等水平调控基因表达。lncRNA测序是研究已有参考基因组物种的特定组织或细胞在某个特定时期转录出的所有lncRNA和mRNA。Lnc
12、RNA（long noncoding RNA)测序文库构建Small RNA 是长度约20-30nt的非编码RNA分子，主要包括miRNA、siRNA、piRNA等，是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Small RNA测序文库构建Circ RNA是mRNA在剪接的过程中，上游exon的5端与下游exon的3端剪接到一起，从而形成的首尾相接的环状RNA分子。近年的研究表明，circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。Circular RNA测序文库构建存在问题测序速度及通量提高了，但是后续海量的数据分析却成为一大难题；不适合小规模测序；新一代测序仪价格昂贵。谢谢！ &问题？
