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1、 实验四、细胞融合实验四、细胞融合人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。这一技这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。种培育的重要手段。1.1.1.1.正常小鼠脾脏中含有不同的正常小鼠脾脏中含有不同的正常小鼠脾
2、脏中含有不同的正常小鼠脾脏中含有不同的B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞2.2.2.2.一个一个一个一个B B B B淋巴细胞只能分泌一淋巴细胞只能分泌一淋巴细胞只能分泌一淋巴细胞只能分泌一种特异性的抗体种特异性的抗体种特异性的抗体种特异性的抗体3.3.3.3.在体外培养条件下，在体外培养条件下，在体外培养条件下，在体外培养条件下，B B B B淋巴淋巴淋巴淋巴细胞不能无限增殖细胞不能无限增殖细胞不能无限增殖细胞不能无限增殖4.4.4.4.小鼠的骨髓瘤细胞可以无限小鼠的骨髓瘤细胞可以无限小鼠的骨髓瘤细胞可以无限小鼠的骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能分泌抗体增殖，但不能分泌抗体增殖，但
3、不能分泌抗体增殖，但不能分泌抗体单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备目的要求目的要求 1 1、了解细胞融合的原理。、了解细胞融合的原理。2 2、掌握细胞融合的实验方法、掌握细胞融合的实验方法实验用品实验用品 血球计数板、水浴锅、离心机、光学显微镜、载玻片、50%PEG溶液、GKN液、生理盐水、鸡血红细胞（有细胞核）实验原理实验原理实验原理实验原理 在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜为各自存在完整的细胞膜。在某些在某些诱导物（如仙台病诱导物（如仙台病毒、聚乙二醇等毒、聚乙二醇等）的诱导下，使亲本细胞膜发生一定）的诱导下，
4、使亲本细胞膜发生一定的变化，能使两个或多个或更多的细胞融合。细胞融的变化，能使两个或多个或更多的细胞融合。细胞融合过程，首先是在诱导物的作用下出现细胞凝集现象。合过程，首先是在诱导物的作用下出现细胞凝集现象。然后，在细胞粘连处发生融合，而成为多核细胞。最然后，在细胞粘连处发生融合，而成为多核细胞。最后，经有丝分裂，细胞核进行融合，遂形成新的杂种后，经有丝分裂，细胞核进行融合，遂形成新的杂种细胞。细胞。 细胞融合过程两个细胞的细胞膜从接触、重细胞融合过程两个细胞的细胞膜从接触、重排到形成细胞桥的过程示意图排到形成细胞桥的过程示意图诱导细胞融合的主要方法有：诱导细胞融合的主要方法有：诱导细胞融合的
5、主要方法有：诱导细胞融合的主要方法有：1. 1. 病毒诱导融合病毒诱导融合：有许多种类的病毒能：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是介导细胞融合，最常用的是灭活的仙灭活的仙台病毒（台病毒（HVJHVJ），为，为RNARNA病毒。病毒诱病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。交流
6、，最后形成融合细胞。2. 2. 化学融合剂诱导融合化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）。PEGPEG用于细胞融合至少有两方面的作用：用于细胞融合至少有两方面的作用：可促使细胞可促使细胞凝结；凝结；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形
7、成一个双核或多核融合细胞。沟通，形成一个双核或多核融合细胞。3. 3. 电融合电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。实验内容和方法实验内容和方法1 1、鸡红细胞悬液的制备、鸡红细胞悬液的制备: :注射器内先吸入注射器内先吸入2 ml 2 ml AlseverAlsever溶液，从鸡翼下静脉取溶液，从鸡翼下静脉取2ml2ml鸡血，注鸡血，注入离心管，再加入入离心管，再加入6 ml 6 ml AlseverAlsev
8、er溶液，使之溶液，使之成为成为1 1：4 4的悬液。的悬液。 ( (AlseverAlsever溶液：葡萄糖溶液：葡萄糖2.05g2.05g，柠檬酸钠，柠檬酸钠0.80g0.80g，NaClNaCl 0.42g 0.42g，溶于，溶于100ml100ml双蒸水中。双蒸水中。AlseverAlsever液能起到抗凝作用又能起到保护作液能起到抗凝作用又能起到保护作用用, ,可用来暂时保存细胞可用来暂时保存细胞。) )2 2、取鸡红细胞悬液、取鸡红细胞悬液1ml1ml，加，加5ml5ml生理盐水，生理盐水，1200r/min1200r/min离心离心5min5min，去上清（注意：用吸，去上清（注
9、意：用吸管吸出，如直接倒会损失红细胞），再以上管吸出，如直接倒会损失红细胞），再以上述条件离心洗涤两次。述条件离心洗涤两次。3 3、将沉淀加入、将沉淀加入5ml GKN5ml GKN液，混匀。液，混匀。 （GKNGKN溶溶液液：NaClNaCl 8g8g，KClKCl 0.4g0.4g，Na2HPO4Na2HPO42H2O 2H2O 1.77g1.77g，NaH2PO4NaH2PO4H2O H2O 0.69g0.69g，葡葡萄萄糖糖2g2g，酚酚红红0.01g0.01g，溶溶于于1000ml1000ml水水中中。维维持持pHpH与与渗渗透透压压，保保证证细细胞胞的的正正常常形形态态和和活活性性
10、，使使成成为为细细胞胞悬悬液液，便便于于融融合。合。）4 4、计数，稀释至每毫升、计数，稀释至每毫升1.51.510106 6个。个。( (可选步骤可选步骤) )5 5、悬液、悬液1ml1ml放入放入3737预热。同时将预热。同时将50%PEG50%PEG液液预热预热（注（注意：否则意：否则PEGPEG冷却会有结晶析出，影响浓度）。冷却会有结晶析出，影响浓度）。 （5050PEGPEG溶液溶液：称取一定量的：称取一定量的PEGPEG（WMWM40004000）放）放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至5050时，加入等体积预热至时，加入等体积预热至5
11、050的的GKNGKN溶液，混匀，置溶液，混匀，置37 37 备用。）备用。）6 6、待温度恒定后（约、待温度恒定后（约15-20min15-20min），在），在1ml1ml细胞细胞悬液中慢慢逐滴加入悬液中慢慢逐滴加入0.5ml 50%PEG0.5ml 50%PEG液，边加液，边加边摇匀边摇匀（注意：以免（注意：以免PEGPEG浓度不均匀）浓度不均匀）放入水浴放入水浴放入水浴放入水浴锅中。锅中。锅中。锅中。7 7、细胞融合、细胞融合20-30min20-30min后，加入后，加入GKNGKN液至液至5ml5ml，静止于水浴锅中静止于水浴锅中10min10min左右。左右。8 8、取出离心管，
12、、取出离心管，1200r/min1200r/min离心离心3min3min，使细胞，使细胞完全沉降。去上清，加完全沉降。去上清，加GKNGKN液，液，, , , ,吹匀，再离心吹匀，再离心吹匀，再离心吹匀，再离心一次。一次。一次。一次。9 9 9 9、去上清，加少量、去上清，加少量、去上清，加少量、去上清，加少量GKNGKNGKNGKN液，混匀，取少量悬液于载玻液，混匀，取少量悬液于载玻液，混匀，取少量悬液于载玻液，混匀，取少量悬液于载玻片上，加入片上，加入片上，加入片上，加入Janus greenJanus greenJanus greenJanus green染液，染液，染液，染液，3mi
13、n3min3min3min后盖上盖玻片，后盖上盖玻片，后盖上盖玻片，后盖上盖玻片，观察细胞融合情况。观察细胞融合情况。观察细胞融合情况。观察细胞融合情况。1010、实验绘图：、实验绘图： 思考题思考题一、在进行细胞融合时要注意那些问题？一、在进行细胞融合时要注意那些问题？二、计算细胞融合率二、计算细胞融合率计算。计算。 融合率融合率融合率融合率 随机计数随机计数随机计数随机计数200200个细胞个细胞个细胞个细胞( (包括融合的与未融合的细胞包括融合的与未融合的细胞包括融合的与未融合的细胞包括融合的与未融合的细胞) )，以融合细胞，以融合细胞，以融合细胞，以融合细胞( (含两个或两个以上的细胞核的细胞含两个或两个以上的细胞核的细胞含两个或两个以上的细胞核的细胞含两个或两个以上的细胞核的细胞) )的细胞核的细胞核的细胞核的细胞核数除以总细胞核数数除以总细胞核数数除以总细胞核数数除以总细胞核数( (包括融合与未融合的细胞核包括融合与未融合的细胞核包括融合与未融合的细胞核包括融合与未融合的细胞核) )即得出融合即得出融合即得出融合即得出融合率率率率
