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1、1. 1. 反相高效液相色谱反相高效液相色谱反相高效液相色谱反相高效液相色谱（RPHPLC）分析方法的建立分析方法的建立分析方法的建立分析方法的建立2. 2. 液相色谱常见问题及处理方法液相色谱常见问题及处理方法液相色谱常见问题及处理方法液相色谱常见问题及处理方法3. 3. 色谱联用技术（色谱联用技术（色谱联用技术（色谱联用技术（LCMS ）4. 4. 制备液相色谱技术制备液相色谱技术制备液相色谱技术制备液相色谱技术反相高效液相色谱反相高效液相色谱（RPHPLC） 分析方法的建立分析方法的建立 什么是色谱？什么是色谱？色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离方色谱是一种建立在一定的科学理论基
2、础上的分离方色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离方色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离方法（工具、手段）。法（工具、手段）。法（工具、手段）。法（工具、手段）。除色谱之外，经典（常见）的分离方法：除色谱之外，经典（常见）的分离方法：除色谱之外，经典（常见）的分离方法：除色谱之外，经典（常见）的分离方法：蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等色谱色谱是一种是一种是一种是一种高效能高效能高效能高效能 的分离方法的分离方法的分离方法的分离方法色谱分析色谱分析以一定的科学理论为
3、基础，在高效能的分离基以一定的科学理论为基础，在高效能的分离基以一定的科学理论为基础，在高效能的分离基以一定的科学理论为基础，在高效能的分离基础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析方法。方法。方法。方法。什么是高效液相色谱法？什么是高效液相色谱法？High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：高效液相色谱法，简称：高效液相色谱法，简称：高效液相色谱
4、法，简称：HPLCHPLC是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法的高效能分析方法：的高效能分析方法：的高效能分析方法：的高效能分析方法：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度、高选择性的检测器及高灵敏度、高选择性的检测器及高灵敏度、高选择性的检测器及高灵敏度、高选择性的检测器广泛应用于各个领域：广泛应用于各个领域：广泛应用于各个领域：广
5、泛应用于各个领域：医药医药医药医药 / / 环保环保环保环保 / / 石化石化石化石化 / / 生命科学生命科学生命科学生命科学 / / 食品及农业食品及农业食品及农业食品及农业在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平，在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平，在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平，在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平，并高速发展。并高速发展。并高速发展。并高速发展。HPLC的基本配置及流程的基本配置及流程溶剂溶剂溶剂溶剂 色谱泵色谱泵手动手动/自动自动 进样器进样器 HPLCHPLC色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱检测器检测器废液废液数据处理系统数据处理系统 HPLC的仪器配
6、置的仪器配置泵系统泵系统泵系统泵系统自动进样器自动进样器自动进样器自动进样器色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱检测器检测器检测器检测器数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统溶剂溶剂溶剂溶剂色谱的发明人色谱的发明人茨维特茨维特（M. S. TswettM. S. Tswett） 俄国科学家茨维特俄国科学家茨维特俄国科学家茨维特俄国科学家茨维特19031903年利用物质的吸附原理，年利用物质的吸附原理，年利用物质的吸附原理，年利用物质的吸附原理，开创了应用吸附原理分离开创了应用吸附原理分离开创了应用吸附原理分离开创了应用吸附原理分离植物色素植物色素植物色素植物色素
7、的新方法。的新方法。的新方法。的新方法。1906年正式命名年正式命名 色谱法；色谱法；色谱法；色谱法；ChromatographyChromatography30年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱主要是气相色谱及薄层色谱主要是气相色谱及薄层色谱主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于70年代年代色谱的发明人色谱的发明人俄国科学家俄国科学家俄国科学家俄国科学家 M. S. TswettM. S. Tswett正式命名正式命名“色谱色谱”的文献中的一段话的文献中的一段话一般情况下一般情况下一般情况下一般情况下HPLCHPLC不是分析方法的首选不
8、是分析方法的首选不是分析方法的首选不是分析方法的首选 分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）：分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）：分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）：分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）： 滴定分析（原料药、制剂定量分析）滴定分析（原料药、制剂定量分析）滴定分析（原料药、制剂定量分析）滴定分析（原料药、制剂定量分析） 紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析）紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析）紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析）紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析） 薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析）薄层色谱（鉴别、有关物质
9、检查等；半定量分析）薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析）薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析） HPLCHPLC（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的检查；复杂样品定量分析等）检查；复杂样品定量分析等）检查；复杂样品定量分析等）检查；复杂样品定量分析等）什么情况下使用什么情况下使用HPLC？什么情况下使用什么情况下使用HPLC？1 1、对分析结果、测定速度和效率的要求、对分析结果、测定速度和效率的要求、对分析结果、测定速度和效率的要求、对分析结果、测定速度和效率的要求
10、准确度要求：准确定量（准确度要求：准确定量（准确度要求：准确定量（准确度要求：准确定量（RSD5RSD1.5, R增增加加不不大大) 。 改改变变 的的方方法法有有：降降低低柱柱温温、改改变变流流动动相相及及固固定相的性质和组成。定相的性质和组成。 (3)分离度分离度R 与容量因子与容量因子 k 的关系的关系 k 增增加加，分分离离度度R增增加加，但但分分析析时时间间也也将将增增加加。当当k10，则则R的的增增加加不不明明显显。通通常常k控控制制在在110之之间间。最好最好15。 改改变变 k 的的方方法法有有：适适当当增增加加柱柱温温、改改变变流流动动相相性质以及固定液膜厚度。性质以及固定液
11、膜厚度。 容量因子（容量因子（k）、柱效（）、柱效（H）及分配系数比（）及分配系数比（）对分离度）对分离度（R）的影响）的影响HH3 分离条件选择的基本依据分离条件选择的基本依据 在分离多组分复杂混合物时，分子量相近、沸点差小及极在分离多组分复杂混合物时，分子量相近、沸点差小及极性相似的组分，保留值相差小，分离较难。性相似的组分，保留值相差小，分离较难。 有必要设立一个指标，表征这种难分离的物质对。有必要设立一个指标，表征这种难分离的物质对。 根据热力学参数对分离的影响，设立根据热力学参数对分离的影响，设立Sd值作为难分离物质值作为难分离物质对的量度。在一定的色谱条件下，规定：对的量度。在一定
12、的色谱条件下，规定：k1、k2为容量因子，为容量因子，*为动力学系数为动力学系数(1) 难分离物质对的预测难分离物质对的预测 k2/k1比值越小，比值越小，*越大，越大，Sd值就越小，分离越难。值就越小，分离越难。k2/k1属于热力学参数，属于热力学参数，*属于动力学参数。属于动力学参数。如温度如温度如流速如流速(2) 分离度的确定分离度的确定 分离度的确定，应根据样品的复杂程度、分离的难易程度、分离度的确定，应根据样品的复杂程度、分离的难易程度、误差要求等作出选择。对一个分离来说，并不是分离度越高越误差要求等作出选择。对一个分离来说，并不是分离度越高越好，换句话：够用、且误差符合要求即可。好
13、，换句话：够用、且误差符合要求即可。分离度较低，但可用逢高定量，误差符合要求。分离度较低，但可用逢高定量，误差符合要求。分离度适中，有误差，但是误差分离度适中，有误差，但是误差5%。(3) 流动相线速度的选择流动相线速度的选择 根据根据Van deemter方程式方程式有一个最佳流速，也就是有一个最佳流速，也就是 H 值最小值最小时的流动相流速。但是由于这个流速一般较小，考虑到分析效时的流动相流速。但是由于这个流速一般较小，考虑到分析效率，有时会牺牲柱效而提高流速。率，有时会牺牲柱效而提高流速。(4) 色谱柱温度的选择（主要适用于气相色谱）色谱柱温度的选择（主要适用于气相色谱） 在保证最难分离
14、的物质对达到预期的分离前提下，柱温越在保证最难分离的物质对达到预期的分离前提下，柱温越高越好，可以缩短组分流出色谱柱的时间，提高工作效率，但高越好，可以缩短组分流出色谱柱的时间，提高工作效率，但是应特别注意仪器和固定相所能承受的温度最高限度。是应特别注意仪器和固定相所能承受的温度最高限度。(5) 进样量选择进样量选择 考虑到色谱柱的容量、组分在流动相中的溶解度以及检测考虑到色谱柱的容量、组分在流动相中的溶解度以及检测器的灵敏度及线性范围，所以，在保证达到检测器灵敏度的前器的灵敏度及线性范围，所以，在保证达到检测器灵敏度的前提条件下，采用尽可能小的进样量。提条件下，采用尽可能小的进样量。(6)
15、其他分离的选择其他分离的选择 如柱长、流动相种类和组成、固定相、梯度洗脱、程序升温如柱长、流动相种类和组成、固定相、梯度洗脱、程序升温等等，参见后续课具体章节。等等，参见后续课具体章节。 色谱柱种类的选择色谱柱种类的选择 首选首选首选首选C C1818柱，可解决约柱，可解决约柱，可解决约柱，可解决约8080的分离问题。的分离问题。的分离问题。的分离问题。 其次其次其次其次C C8 8、C C2 2等。等。等。等。色谱柱规格的选择色谱柱规格的选择 常用常用常用常用150mm 4.6mm150mm 4.6mm、 250mm 4.6mm250mm 4.6mm、 柱长小于柱长小于柱长小于柱长小于100
16、mm100mm、柱内径小于、柱内径小于、柱内径小于、柱内径小于4.6mm4.6mm的色谱的色谱的色谱的色谱柱常用于柱常用于柱常用于柱常用于MSMS检测器（流动相流速检测器（流动相流速检测器（流动相流速检测器（流动相流速1.0mm1.0mm）。）。）。）。 四、选择四、选择HPLC方法；尝试性分离；建立方法；尝试性分离；建立分离条件分离条件流动相种类的选择流动相种类的选择流动相种类的选择流动相种类的选择 反相反相反相反相HPLCHPLC常用的流动相种类一般为甲醇、乙腈、常用的流动相种类一般为甲醇、乙腈、常用的流动相种类一般为甲醇、乙腈、常用的流动相种类一般为甲醇、乙腈、四氢呋喃、水或一定浓度的酸
17、性水溶液（四氢呋喃、水或一定浓度的酸性水溶液（四氢呋喃、水或一定浓度的酸性水溶液（四氢呋喃、水或一定浓度的酸性水溶液（pH17pH17，甲酸、，甲酸、，甲酸、，甲酸、乙酸、磷酸、磷酸盐、柠檬酸、乙酸、磷酸、磷酸盐、柠檬酸、乙酸、磷酸、磷酸盐、柠檬酸、乙酸、磷酸、磷酸盐、柠檬酸、TFATFA等）。等）。等）。等）。流动相配比的选择流动相配比的选择流动相配比的选择流动相配比的选择 初步实验：甲醇水或乙腈初步实验：甲醇水或乙腈初步实验：甲醇水或乙腈初步实验：甲醇水或乙腈水水水水 (80:20)(80:20)或或或或(90:10)(90:10) 根据峰形及分离情况，逐步调整配比，必要时改根据峰形及分离
18、情况，逐步调整配比，必要时改根据峰形及分离情况，逐步调整配比，必要时改根据峰形及分离情况，逐步调整配比，必要时改变溶剂的种类和溶剂的变溶剂的种类和溶剂的变溶剂的种类和溶剂的变溶剂的种类和溶剂的“ “元元元元” ”数，数，数，数， 并适当改变流动相并适当改变流动相并适当改变流动相并适当改变流动相的酸度以及加入适当的的酸度以及加入适当的的酸度以及加入适当的的酸度以及加入适当的“ “防拖剂防拖剂防拖剂防拖剂” ”、“ “改性剂改性剂改性剂改性剂” ”等。等。等。等。洗脱方式的选择洗脱方式的选择洗脱方式的选择洗脱方式的选择 等度洗脱？在满足分离要求的情况下，首选。等度洗脱？在满足分离要求的情况下，首选
19、。等度洗脱？在满足分离要求的情况下，首选。等度洗脱？在满足分离要求的情况下，首选。 梯度洗脱？梯度洗脱？梯度洗脱？梯度洗脱？梯度洗脱描述方式：梯度洗脱描述方式：以甲醇水二元梯度洗脱为例：以甲醇水二元梯度洗脱为例：以甲醇水二元梯度洗脱为例：以甲醇水二元梯度洗脱为例： 1 1、文字法（文献表达方法）：、文字法（文献表达方法）：、文字法（文献表达方法）：、文字法（文献表达方法）： 0-6.5min0-6.5min（3030：7070），），），），8.5-13min8.5-13min（5050：5050） 2 2、表格法：、表格法：、表格法：、表格法： （也可用于正式论文中）（也可用于正式论文中）（
20、也可用于正式论文中）（也可用于正式论文中）时间时间时间时间甲醇甲醇甲醇甲醇水水水水0 0303070706.56.5303070708.58.55050505013.013.0505050503 3、图示法、图示法、图示法、图示法 以时间作为横坐标，以某一元的溶剂比例作以时间作为横坐标，以某一元的溶剂比例作以时间作为横坐标，以某一元的溶剂比例作以时间作为横坐标，以某一元的溶剂比例作为纵坐标作图。为纵坐标作图。为纵坐标作图。为纵坐标作图。甲醇甲醇min305006.5 8.513.0甲醇水甲醇水甲醇水甲醇水: :0-6.5min0-6.5min（30:7030:70），），），），8.5-13m
21、in8.5-13min（50:5050:50）甲醇乙腈水甲醇乙腈水甲醇乙腈水甲醇乙腈水: :0-6.5min0-6.5min（20:10:7020:10:70），），），），8.5-13min8.5-13min（30:20:5030:20:50）甲醇甲醇203006.5 8.513.010min 图示法的特点是直观、明晰，常用于色谱条件图示法的特点是直观、明晰，常用于色谱条件图示法的特点是直观、明晰，常用于色谱条件图示法的特点是直观、明晰，常用于色谱条件选择实验中的快速记录。选择实验中的快速记录。选择实验中的快速记录。选择实验中的快速记录。 一般不用于论文中。一般不用于论文中。一般不用于论文中
22、。一般不用于论文中。 流动相流速流动相流速流动相流速流动相流速 一般为一般为一般为一般为0.81.5mL0.81.5mL（分析型，紫外检测）（分析型，紫外检测）（分析型，紫外检测）（分析型，紫外检测） 0.8mL0.9990.999。精密度试验（日内、日间）精密度试验（日内、日间）精密度试验（日内、日间）精密度试验（日内、日间） 对照品混合液，重复对照品混合液，重复对照品混合液，重复对照品混合液，重复5 59 9次进样，测定目标测定次进样，测定目标测定次进样，测定目标测定次进样，测定目标测定物峰面积并计算物峰面积并计算物峰面积并计算物峰面积并计算RSDRSD。（一般要求。（一般要求。（一般要求
23、。（一般要求2% 2% ）稳定性试验稳定性试验稳定性试验稳定性试验 对照品混合液，每隔一定时间进样，测定目标测对照品混合液，每隔一定时间进样，测定目标测对照品混合液，每隔一定时间进样，测定目标测对照品混合液，每隔一定时间进样，测定目标测定物的峰面积并计算定物的峰面积并计算定物的峰面积并计算定物的峰面积并计算RSDRSD（一般要求（一般要求（一般要求（一般要求2% 2% ）。（）。（）。（）。（8 8小小小小时以上）。时以上）。时以上）。时以上）。 注：待测成分不稳定的因素应排除。注：待测成分不稳定的因素应排除。注：待测成分不稳定的因素应排除。注：待测成分不稳定的因素应排除。 重复性试验重复性试
24、验重复性试验重复性试验 取取取取同同同同一一一一批批批批样样样样品品品品共共共共5 59 9份份份份，按按按按含含含含量量量量测测测测定定定定方方方方法法法法重重重重复复复复测测测测定，求算待测成分含量的定，求算待测成分含量的定，求算待测成分含量的定，求算待测成分含量的RSD RSD （一般要求（一般要求（一般要求（一般要求2% 2% ） 。 加样回收率试验加样回收率试验加样回收率试验加样回收率试验 取取取取已已已已知知知知待待待待测测测测成成成成分分分分含含含含量量量量的的的的样样样样品品品品适适适适量量量量，精精精精密密密密加加加加入入入入对对对对照照照照品品品品储储储储备备备备液液液液适
25、适适适量量量量（必必必必要要要要时时时时分分分分高高高高、中中中中、低低低低三三三三个个个个量量量量），按按按按照照照照样样样样品品品品的的的的制制制制备备备备方方方方法法法法制制制制备备备备溶溶溶溶液液液液，按按按按选选选选定定定定的的的的色色色色谱谱谱谱条条条条件件件件测测测测定定定定，求算回收率。求算回收率。求算回收率。求算回收率。 检测限、定量限的确定检测限、定量限的确定检测限、定量限的确定检测限、定量限的确定 对对对对照照照照品品品品溶溶溶溶液液液液逐逐逐逐级级级级稀稀稀稀释释释释至至至至适适适适当当当当浓浓浓浓度度度度，注注注注入入入入HPLCHPLC，测测测测定定定定峰峰峰峰高高
26、高高，当当当当该该该该峰峰峰峰高高高高达达达达到到到到3 3倍倍倍倍噪噪噪噪声声声声时时时时，为为为为检检检检测测测测限限限限，1010倍倍倍倍峰高时即为定量限。峰高时即为定量限。峰高时即为定量限。峰高时即为定量限。 实际样品的测定实际样品的测定实际样品的测定实际样品的测定（日常使用的确认）（日常使用的确认）（日常使用的确认）（日常使用的确认） 不不不不同同同同产产产产地地地地、或或或或不不不不同同同同批批批批号号号号样样样样品品品品的的的的按按按按照照照照选选选选定定定定的的的的分分分分析析析析方方方方法进行测定，将结果列表。法进行测定，将结果列表。法进行测定，将结果列表。法进行测定，将结果
27、列表。系统适用性考察和方法可靠性考察、确认，系统适用性考察和方法可靠性考察、确认，一般可统称为一般可统称为HPLC方法学研究方法学研究HPLC方法建立的过程方法建立的过程1. 1. 了解样品信息，确定分离目标了解样品信息，确定分离目标了解样品信息，确定分离目标了解样品信息，确定分离目标2. 2. 确定样品预处理方案确定样品预处理方案确定样品预处理方案确定样品预处理方案3. 3. 选择检测器、确定使用条件选择检测器、确定使用条件选择检测器、确定使用条件选择检测器、确定使用条件4. 4. 选择选择选择选择HPLCHPLC方法；初步分离；建立分离条件方法；初步分离；建立分离条件方法；初步分离；建立分离条件方法；初步分离；建立分离条件5. 5. 优化分离条件优化分离条件优化分离条件优化分离条件6. 6. 方法可靠性考察、确认方法可靠性考察、确认方法可靠性考察、确认方法可靠性考察、确认7.7.日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认总结概括：总结概括：
