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1、组织化学技术组织化学技术本次课掌握内容本次课掌握内容组织化学技术的定义组织化学技术的定义组织化学技术的发展组织化学技术的发展组织化学技术的原理组织化学技术的原理组织化学技术的基本要求组织化学技术的基本要求调 查 题1、组织学、显微技术中观察的、组织学、显微技术中观察的切片切片是如是如何制作的？何制作的？2、组织学的切片能观察到什么？如何观、组织学的切片能观察到什么？如何观察细胞组织中特定的化学对象？察细胞组织中特定的化学对象？组织化学的定义组织化学的定义组织化学（组织化学（histochemistryhistochemistry）又叫细胞化）又叫细胞化学（学（cytochemistrycyto
2、chemistry）、显微化学）、显微化学即在即在不破坏细胞形态结构不破坏细胞形态结构的状况下，是运的状况下，是运用化学、物理等技术手段对组织与细胞的用化学、物理等技术手段对组织与细胞的化学成分化学成分、化学反应化学反应，及其，及其变化规律变化规律进行进行定位、定性定位、定性和和定量定量研究的科学。研究的科学。组织化学的课程地位组织化学的课程地位 组织化学是介于细胞生物学、组织形组织化学是介于细胞生物学、组织形态学、化学、生物化学和分子生物学等态学、化学、生物化学和分子生物学等学科之间的一门学科之间的一门边缘学科边缘学科。 是医学、生物学科研过程的是医学、生物学科研过程的重要手段重要手段注注
3、意意1 1、组织化学的结果需要用、组织化学的结果需要用显微镜显微镜才能观才能观察到。察到。2 2、组织化学看到的、组织化学看到的不是化学物质本身不是化学物质本身，而是该物质经过化学反应后的产物而是该物质经过化学反应后的产物3 3、该产物的位置和数量可以代表该化学、该产物的位置和数量可以代表该化学物质的位置和数量物质的位置和数量免疫学免疫学与组织化学与组织化学：将抗原、抗体的特异性与：将抗原、抗体的特异性与组织化学的可见性巧妙的结合起来，在细胞、组织化学的可见性巧妙的结合起来，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。亚细胞水平检测各种抗原物质。分子生物学分子生物学与组织化学与组织化学：将碱基配对的分
4、子杂：将碱基配对的分子杂交原理与组织化学相结合，产生了在核酸原有交原理与组织化学相结合，产生了在核酸原有位置上进行的细胞内核酸定性、定位。位置上进行的细胞内核酸定性、定位。以上两学科的发展，以上两学科的发展，推动了组织化学推动了组织化学的进步，的进步，扩展的传统意义上的组织化学内涵，形成了多扩展的传统意义上的组织化学内涵，形成了多个分支。个分支。组织化学的发展简史组织化学的发展简史建立建立从从16641664年，年，Robert HookeRobert Hooke发现细胞起，发现细胞起，细胞学和组织学开始建立和发展。细胞学和组织学开始建立和发展。把化学技术与显微镜结合起来，应归于把化学技术与显
5、微镜结合起来，应归于法国植物学家法国植物学家RaspailRaspail（拉斯帕伊拉斯帕伊, 18261826）组织化学的发展简史组织化学的发展简史建立建立RaspailRaspail：在研究植物的受精作用时，首次发现在研究植物的受精作用时，首次发现碘对淀粉的反应碘对淀粉的反应蛋白质的黄色反应蛋白质的黄色反应硫酸对于蛋白质醛基和糖醛基的显色反应硫酸对于蛋白质醛基和糖醛基的显色反应利用指示剂显色测定细胞原生质的利用指示剂显色测定细胞原生质的pHpH值值18301830年年RaspailRaspail发表了在生理学中使用显微镜观察化学发表了在生理学中使用显微镜观察化学物质的论著，从此物质的论著，从
6、此标志着组织化学技术的开端标志着组织化学技术的开端，RaspailRaspail也因此被认为是组织化学技术的创始者也因此被认为是组织化学技术的创始者 Vogel(1845Vogel(1845年年) )和和Perls(1867Perls(1867年年) )分别用硫化物分别用硫化物和普鲁士蓝法显示和普鲁士蓝法显示铁铁；MillonMillon的米伦法显示的米伦法显示蛋白质蛋白质(1849(1849年年) )；Bencke(1862Bencke(1862年年) )将将甲苯胺蓝甲苯胺蓝等苯胺染料用于组等苯胺染料用于组织学研究（苯胺染料技术发展到高峰的织学研究（苯胺染料技术发展到高峰的2020世纪世纪4
7、040年代才活跃起来）年代才活跃起来）HeidenhainHeidenhain发现细胞的嗜铬反应发现细胞的嗜铬反应(1870(1870年年) )；MiescherMiescher用用甲基绿甲基绿显示细胞核的显示细胞核的染色质染色质(1873(1873年年) )；Weigert(1884Weigert(1884年年) )和和Marchi(1892Marchi(1892年年) )提提出出髓鞘染色法髓鞘染色法；Daddi(1896Daddi(1896年年) )首次应用苏丹首次应用苏丹(sudan (sudan m)m)进行离体进行离体脂肪染色脂肪染色；Klebs(1868Klebs(1868年年)
8、)和和Stuve(1872Stuve(1872年年) )的的过氧过氧化物酶显示法化物酶显示法：Ehrlich(1885Ehrlich(1885年年) )发现发现细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶。MannMann自自19021902年起，逐渐建立了完善的年起，逐渐建立了完善的组组织冷冻切片技术织冷冻切片技术。弥补了一般化学固定及石蜡包埋的缺点，弥补了一般化学固定及石蜡包埋的缺点，可防止酶活性丧失。脂类、多糖类和无可防止酶活性丧失。脂类、多糖类和无机盐的丢失等，推动了脂类、黏多糖及机盐的丢失等，推动了脂类、黏多糖及酶组织化学研究的发展。酶组织化学研究的发展。这些都有力的支持了化学染色理论。这些都有力的
9、支持了化学染色理论。但是由于但是由于化学知识的贫乏和显微镜技术的停滞化学知识的贫乏和显微镜技术的停滞在在一定时期限制了组织化学作为一个学科的发展。一定时期限制了组织化学作为一个学科的发展。 直到直到2020世纪世纪3030年代组织化学才复兴年代组织化学才复兴19081908年年MacallumMacallum的组织化学的方法和结果的组织化学的方法和结果19291929年年HertwigHertwig的组织化学方法的组织化学方法19491949年年GlickGlick的组织化学和细胞化学技术的组织化学和细胞化学技术19541954年年PearsePearse的组织化学的组织化学理论与应用理论与应
10、用组织化学的发展组织化学的发展蛋白质和氨基酸：蛋白质和氨基酸：四氮盐反应、精氨酸显四氮盐反应、精氨酸显色法、巯基反应，银浸法等色法、巯基反应，银浸法等核酸：核酸：Feulgen-Schiff反应、甲基绿反应、甲基绿-派若派若宁反应宁反应糖类：糖类：PAS反应等反应等脂类：脂类：苏丹系列、油红等苏丹系列、油红等组织化学的发展组织化学的发展19391939年是年是酶组织化学酶组织化学划时代的一年划时代的一年高松英雄和高松英雄和GomoriGomori于于19391939年同时发表证明年同时发表证明了了碱性磷酸酶碱性磷酸酶的组织化学方法。的组织化学方法。继而证明了磷酰胺酶、继而证明了磷酰胺酶、ATP
11、ATP酶、酸性磷酸酶、酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学法。酶、脂酶、酯酶等组织化学法。随即创立了金属盐法、偶氮色素法随即创立了金属盐法、偶氮色素法19551955年年H. ScheldonH. Scheldon和和D. BrandesD. Brandes等人把电等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和碱性磷酸酶，奠定了察了酸性磷酸酶和碱性磷酸酶，奠定了电镜电镜酶组织化学基础酶组织化学基础。后来后来Seligman(1967)Seligman(1967)提出提出锇黑化法锇黑化法进一步阐进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。述了电
12、镜组织化学的基本原理和反应过程。使组织化学的定位进入到了亚细胞水平。使组织化学的定位进入到了亚细胞水平。CoonsCoons等（等（19501950）为了在荧光显微镜下能）为了在荧光显微镜下能够对酶进行观察，提出了够对酶进行观察，提出了荧光抗体法，荧光抗体法，从而把免疫学引入组织化学实验中。从而把免疫学引入组织化学实验中。NakaneNakane等以辣根过氧化物酶为标记物的等以辣根过氧化物酶为标记物的酶标抗体法酶标抗体法为组织化学开辟了新的途径为组织化学开辟了新的途径酶标法酶标法。 19691969年人们把年人们把分子杂交技术应用到组织切片和细胞分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本标本上，开始
13、探索上，开始探索原位杂交技术原位杂交技术 近近2020年来，多种亲和物质的发现，如：植物凝集素年来，多种亲和物质的发现，如：植物凝集素糖结合物，生物素糖结合物，生物素卵白素（亲和素），不但与卵白素（亲和素），不但与亲和物质之间有高度的亲和力，而且可以和标记物，如亲和物质之间有高度的亲和力，而且可以和标记物，如荧光、酶、放射性物质等结合，荧光、酶、放射性物质等结合，19761976年，开创了年，开创了亲和细亲和细胞化学技术。胞化学技术。 发展比较快的是发展比较快的是定量细胞化学及定量组定量细胞化学及定量组织化学织化学。其目的是对细胞、细胞的组分。其目的是对细胞、细胞的组分和细胞外的产物，在其原位
14、上和活的情和细胞外的产物，在其原位上和活的情况下进行定量化学分析况下进行定量化学分析如：吸收量度法、荧光测定法、干涉量如：吸收量度法、荧光测定法、干涉量度法、反射量度法、原位定量测定、放度法、反射量度法、原位定量测定、放射自显影射自显影GomoriGomori（19521952）认为组织化学是个混合学）认为组织化学是个混合学科，即组织学、细胞学、生物化学、免疫科，即组织学、细胞学、生物化学、免疫学等之间的边缘领域学等之间的边缘领域故定义为故定义为：在组织和细胞中，以化学或物在组织和细胞中，以化学或物理实验法，对其某些特殊物质、反应基团理实验法，对其某些特殊物质、反应基团和酶促活性进行识别、定位
15、和定量。和酶促活性进行识别、定位和定量。组织化学的研究内容组织化学的研究内容1 1、无机物质：各种金属元素和微量元素以及盐、无机物质：各种金属元素和微量元素以及盐类类2 2、有机物质：糖类、脂类、氨基酸、核酸、蛋、有机物质：糖类、脂类、氨基酸、核酸、蛋白质、色素、维生素等。白质、色素、维生素等。3 3、各种酶类：目前能显示的、各种酶类：目前能显示的200200多种多种4 4、各种抗原和抗体、各种抗原和抗体5 5、内源性或外源性基因片段、内源性或外源性基因片段组织化学分支组织化学分支无机组织化学无机组织化学糖组织化学糖组织化学酶组织化学酶组织化学电镜组织化学电镜组织化学荧光组织化学、荧光组织化学
16、、免疫组织化学免疫组织化学同工酶组织化学同工酶组织化学定量组织化学定量组织化学原位杂交组织化学等原位杂交组织化学等我国组织化学发展概况我国组织化学发展概况开始于开始于2020世纪世纪5050年代年代领军人物领军人物: :李肇特、张作干、汪李肇特、张作干、汪堃堃仁仁李肇特：李肇特：1913191320062006，北京大学医学部，北京大学医学部组织学与胚胎学教授，组织学与胚胎学教授，6060年代建立组织年代建立组织化学实验室，率先在全国推广组织化学化学实验室，率先在全国推广组织化学技术。技术。我国组织化学发展概况我国组织化学发展概况张作干张作干: :1906-1969,1906-1969,浙江人
17、。协和医科大学和中浙江人。协和医科大学和中国医学科学院实验医学研究所形态学教授。利用国医学科学院实验医学研究所形态学教授。利用组织化学方法及电镜，观察小白鼠胚胎发生过程组织化学方法及电镜，观察小白鼠胚胎发生过程中各器官组织的组织化学及超微结构变化中各器官组织的组织化学及超微结构变化从从19531953年起进行组织化学研究工作，培养了一大年起进行组织化学研究工作，培养了一大批研究生，并设计出了我国第一台批研究生，并设计出了我国第一台恒冷箱切片机恒冷箱切片机，对普及组织化学新技术作出了卓越贡献对普及组织化学新技术作出了卓越贡献我国组织化学发展概况我国组织化学发展概况汪汪堃堃仁仁: :1912191
18、21993,1993,安徽人。中国科学院院安徽人。中国科学院院士，北京师范大学生理学、细胞学教授。著士，北京师范大学生理学、细胞学教授。著有酶的组织化学，把生化、组织化学和有酶的组织化学，把生化、组织化学和生理功能结合起来进行研究，对生理学和细生理功能结合起来进行研究，对生理学和细胞学的研究有重要的推动作用。胞学的研究有重要的推动作用。在消化生理、组织化学和肿瘤细胞生物学研在消化生理、组织化学和肿瘤细胞生物学研究方面作出了显著的成绩究方面作出了显著的成绩我国组织化学发展概况我国组织化学发展概况19881988年年3 3月，中国解剖学会下成立了月，中国解剖学会下成立了“组组织化学与细胞化学学组织
19、化学与细胞化学学组”，发行了，发行了中国中国组织化学与细胞化学杂志组织化学与细胞化学杂志国际组织化学与细胞化学学会联合会，国际组织化学与细胞化学学会联合会，19601960年成立，我国在年成立，我国在19801980年首次参会。年首次参会。张保真、王启民、马仲魁、艾民康等张保真、王启民、马仲魁、艾民康等组织化学基本原理组织化学基本原理应用已知的物理、化学反应过程使组织细应用已知的物理、化学反应过程使组织细胞内的各种化学物质在原位形成可见的有胞内的各种化学物质在原位形成可见的有色反应终产物。色反应终产物。组织化学基本原理组织化学基本原理1、化学反应、化学反应通过已知的化学反应，在切片上生成有色通
20、过已知的化学反应，在切片上生成有色沉淀以显示其化学成分及其定位。沉淀以显示其化学成分及其定位。大多数组织化学方法属于此类，如酶组织大多数组织化学方法属于此类，如酶组织化学化学组织化学基本原理组织化学基本原理2、类化学反应、类化学反应少数组织化学方法的染色结果有特异性，少数组织化学方法的染色结果有特异性，但其机制不明但其机制不明如卡红显示糖原、如卡红显示糖原、 BestBest胭脂红显示糖原；胭脂红显示糖原；MayerMayer胭脂红显示糖蛋白胭脂红显示糖蛋白组织化学基本原理组织化学基本原理3、物理学原理、物理学原理运用物质的运用物质的物理学特性物理学特性来显示其存在来显示其存在如如苏丹苏丹脂类
21、脂类；单胺类经甲醛诱发可产；单胺类经甲醛诱发可产生荧光；组织生荧光；组织X射线显微分析法，放射自射线显微分析法，放射自显影，显微烧灰法等。显影，显微烧灰法等。组织化学基本原理组织化学基本原理4、生物学特性、生物学特性利用生物大分子物质有抗原性的特性，用利用生物大分子物质有抗原性的特性，用荧光色素、酶、胶体金等标记荧光色素、酶、胶体金等标记免疫组化、亲和组化免疫组化、亲和组化组织化学基本原理组织化学基本原理5、核苷酸互补原理、核苷酸互补原理两条互补的核苷酸链可聚合形成稳定的杂两条互补的核苷酸链可聚合形成稳定的杂交体交体原位杂交技术原位杂交技术要求的基础要求的基础组织学、细胞学组织学、细胞学显微技
22、术显微技术生物化学生物化学分子生物学分子生物学物理学物理学组织化学技术的基本要求组织化学技术的基本要求 1 1具有高度的特异性具有高度的特异性 才能鉴别所显示物质的类属，正确才能鉴别所显示物质的类属，正确分析实验分析实验2 2具有一定的敏感性具有一定的敏感性 显示含量极微的物质，并弥补组织显示含量极微的物质，并弥补组织制备过程中化学物质及酶活性的丢失。制备过程中化学物质及酶活性的丢失。3 3尽可能地保持组织和细胞生前的形态尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。结构、化学成分和酶的活性。 为此必须选择适当的固定液和恰当为此必须选择适当的固定液和恰当的处理方法，如冷冻干燥、冰冻
23、替代、的处理方法，如冷冻干燥、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。恒冷箱切片、振动切片等。4 4化学反应要求在细胞或组织内进行，化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性须有定位的准确性。 为此必须控制反应的时间和条件，为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不易位、不弥散。使反应的产物不易位、不弥散。5 5反应产物须有显色性和定量的可能性反应产物须有显色性和定量的可能性 即必须是有颜色的沉淀或结晶或具有一定即必须是有颜色的沉淀或结晶或具有一定的电子密度。的电子密度。沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，稳定，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，稳定，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含并能保留在原位
24、上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。量或酶的活性具有一定的比例关系。6 6反应要有反应要有对照对照，以利于判断其结，以利于判断其结果的可靠性。阴性对照和阳性对照。果的可靠性。阴性对照和阳性对照。7 7、要具有、要具有重复性。重复性。1 1、必须掌握被检测物质的物理性质和化、必须掌握被检测物质的物理性质和化学特性：水溶性、脂溶性、溶解度、特学特性：水溶性、脂溶性、溶解度、特异反应等异反应等2 2、掌握该物质在组织细胞内的分布、定、掌握该物质在组织细胞内的分布、定位位3 3、使用试剂为分析纯，所用器皿清洁、使用试剂为分析纯，所用器皿清洁、无污染，使用的水为双蒸水。无污染，使用的水
25、为双蒸水。注意事项注意事项 本学期的主要内容本学期的主要内容1 1理论知识主要内容：理论知识主要内容：3030学时学时组织化学概述组织化学概述组织化学标本的制备组织化学标本的制备光镜组织化学光镜组织化学电镜组织化学电镜组织化学酶组织化学酶组织化学免疫组织化学免疫组织化学原位杂交组织化学原位杂交组织化学定量组织化学定量组织化学实验方案设计和讨论实验方案设计和讨论2 2实验内容（实验内容（3030学时）学时）光镜组织化学样品的制备方法光镜组织化学样品的制备方法组织切片技术组织切片技术常规组织学染色技术（常规组织学染色技术（HEHE）多糖光镜组织化学技术（多糖光镜组织化学技术（PASPAS）核酸光镜
26、组织化学技术（核酸光镜组织化学技术（FeulgenFeulgen；AOAO）酶光镜组织化学技术酶光镜组织化学技术免疫组织化学技术免疫组织化学技术实验安排实验安排1 1、分组：、分组：6 6个组，确定组长个组，确定组长2 2、设计实验方案、设计实验方案3 3、讨论实验方案（分组讲述）、讨论实验方案（分组讲述）4 4、试剂的配制、试剂的配制以上步骤在实验开始前进行以上步骤在实验开始前进行5 5、实验操作的进行、实验操作的进行课程考核课程考核校考课校考课实验：实验：40%（实验操作（实验操作20%+实验报告实验报告20%）理论：理论：60%（笔试）（笔试）预习：光镜组织化学标本的制备预习：光镜组织化学标本的制备思考：思考：组织学组织学标本制备和标本制备和组织化组织化学学标本制备有什么区别？标本制备有什么区别？
