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1、181实验一实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸纸层析法分离鉴定氨基酸通过实验，掌握纸层析的基本操作技能。通过实验，掌握纸层析的基本操作技能。加深对分配层析原理的理解。加深对分配层析原理的理解。【一、实验目的一、实验目的】182 【二、实验二、实验原理原理】 层析技术层析技术层析技术层析技术 是利用混合物中各组分的物理化学性质是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为一相为固定相固定相固定相固定相，另一相流过此相称作，另一相流过此相称作流动相流动相流动相流动相，并使，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。各
2、组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质可分离物质可分离物质可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷等糖类、有机酸、氨基酸、核苷等183固定相固定相 在层析中在层析中起分离作用而不随层析过程移起分离作用而不随层析过程移起分离作用而不随层析过程移起分离作用而不随层析过程移动动动动的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。水。固定相被看成是样品移动的阻力。流动相流动相 在层析过程因其本身流动而在层析过程因其本身流动而推动样品移推动样品移推动样品移推动样品移动动动动的物质。的物质。184名称名称操作方式操作方式固定
3、相固定相流动相流动相分离依据分离依据 分配层析分配层析 纸层析纸层析 薄层层析薄层层析液体液体液体液体 溶解度溶解度 离子交换层析离子交换层析 离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体 带电性带电性 静电引力静电引力 吸附层析吸附层析 吸附薄层层析吸附薄层层析 气体吸附层析气体吸附层析固体固体液体液体气体气体 吸附力吸附力 亲和层析亲和层析 酶与底物酶与底物 抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体 配体专一性配体专一性 凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体 分子大小分子大小层析的分类层析的分类185分配层析分配层析分配层析分配层析：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中：是利用不同
4、物质在两种不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离的一种技术。的分配系数不同而达到分离的一种技术。分配系数分配系数 = =溶质在固定相的溶解度溶质在固定相的溶解度溶质在流动相的溶解度溶质在流动相的溶解度186 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配分配层析层析：纸纤维上的：纸纤维上的 OHOH 基具有亲水性，所基具有亲水性，所以能以能吸附吸附一层一层水水作为作为固定相固定相，而通常把而通常把有机有机溶剂溶剂作为作为流动相流动相。流动相流经支持物时与固。流动相流经支持物时与固定相间连续抽提，使物质在两相间不断地分定相间连续抽提，使物质在两相间不断地分配而得到分离。配而得到
5、分离。187溶质在滤纸上的移动速率用溶质在滤纸上的移动速率用f（比移）值来（比移）值来表示：表示： 展层层斑点中心与原点间的距离 Rf = - 溶剂前沿与原点之间的距离188189 影响影响Rf值的因素值的因素（多种）（多种）（多种）（多种） 物质结构与极性物质结构与极性物质结构与极性物质结构与极性 物质的极性大小决定了物质在水物质的极性大小决定了物质在水 和有机溶剂之间的分配情况。和有机溶剂之间的分配情况。pHpHpHpH值值值值展层剂的展层剂的pHpH影响被分离物质的极性基团的影响被分离物质的极性基团的解离形式。解离形式。 层析滤纸的质量层析滤纸的质量层析滤纸的质量层析滤纸的质量 层析用滤
6、纸要质地均匀，紧密，层析用滤纸要质地均匀，紧密， 有一定的机械强度，并含杂质少。国产新华滤纸可有一定的机械强度，并含杂质少。国产新华滤纸可 用于一般的纸层析。用于一般的纸层析。1810 【三、器材与试剂三、器材与试剂】 器材：器材：器材：器材： 1 1、层析缸、层析缸、层析缸、层析缸 2 2、毛细管、毛细管、毛细管、毛细管 3 3、喷雾器、喷雾器、喷雾器、喷雾器 4 4、培养皿、培养皿、培养皿、培养皿 5 5、层析滤纸、层析滤纸、层析滤纸、层析滤纸( (新华一号新华一号新华一号新华一号) ) 试剂：试剂：试剂：试剂：1 1、扩展剂、扩展剂、扩展剂、扩展剂 （正丁醇（正丁醇（正丁醇（正丁醇：水水
7、水水：冰醋酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸=4=4：3 3：1 1）2 2、显色剂、显色剂、显色剂、显色剂 0.10.1茚三酮正丁醇溶液。茚三酮正丁醇溶液。茚三酮正丁醇溶液。茚三酮正丁醇溶液。3 3、氨基酸溶液、氨基酸溶液、氨基酸溶液、氨基酸溶液0.50.5的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液 及它们的混合液及它们的混合液及它们的混合液及它们的混合液 1811 1 1、层析滤纸准备：、层析滤纸准备：、层析滤纸准备：、层析滤纸准备：取层析滤纸取层析滤纸取层析滤纸取层析滤纸( (长长长长20cm20cm
8、、宽、宽、宽、宽15cm)15cm)一张。一张。一张。一张。在纸的一端距边缘在纸的一端距边缘在纸的一端距边缘在纸的一端距边缘2 23cm3cm处用铅笔划一条直线，在此直线处用铅笔划一条直线，在此直线处用铅笔划一条直线，在此直线处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔上每间隔上每间隔上每间隔2cm2cm作一记号。作一记号。作一记号。作一记号。2 2、点样：、点样：、点样：、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这用毛细管将各氨基酸样品分别点在这用毛细管将各氨基酸样品分别点在这用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5 5个位置上，个位置上，个位置上，个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过干后
9、再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm3mm。【四、实验步骤四、实验步骤】181233、扩展、扩展、扩展、扩展 ：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点
10、样线样线样线样线1cm1cm）。待溶剂上升约）。待溶剂上升约）。待溶剂上升约）。待溶剂上升约15cm15cm时即取出滤纸，铅笔描出溶时即取出滤纸，铅笔描出溶时即取出滤纸，铅笔描出溶时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。4 4、显色：、显色：、显色：、显色： 用喷雾器均匀喷上用喷雾器均匀喷上用喷雾器均匀喷上用喷雾器均匀喷上0 0。1 1茚三酮正丁醇溶液，然茚三酮正丁醇溶液，然茚三酮正丁醇溶液，然茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤后置烘箱中烘烤后置烘箱中
11、烘烤后置烘箱中烘烤5 5分钟分钟分钟分钟(100)(100)或用热风吹干即可显出各层析斑或用热风吹干即可显出各层析斑或用热风吹干即可显出各层析斑或用热风吹干即可显出各层析斑点。点。点。点。 5 5、计算、计算、计算、计算R Rf f值值值值1813【五、实验结果与分析五、实验结果与分析】【六、注意事项六、注意事项】【七、思考题七、思考题】1 1、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？2 2、R Rf f值的含义、影响因素？值的含义、影响因素？值的含义、影响因素
12、？值的含义、影响因素？ 下次实验下次实验：实验二实验二蛋白质和氨基酸的颜色反应蛋白质和氨基酸的颜色反应值值值值 日日日日 生生生生 值值值值 日日日日1814小实验小实验当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。看看接下来会发生什么事情1815可以看出可以看出1 1号氨基酸上升的最号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。高，在滤纸上跑得最快。而而4 4号氨基酸与滤纸的结合最号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。基酸慢。12341816这就是纸色谱法。这就是纸色谱法。对照上图，可知道对照上图，可知道1-41-4号的各号的各代表什么氨基酸。代表什么氨基酸。纸色谱法是分离鉴定蛋白质的纸色谱法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。氨基酸组成的重要工具。 1234甘氨酸甘氨酸半胱氨酸半胱氨酸组氨酸组氨酸缬氨酸缬氨酸1817纸色谱小实验动画演示纸色谱小实验动画演示1818
