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1、实验十二实验十二 金黄色葡萄球菌检测金黄色葡萄球菌检测GB4789.10-2010实验十二金黄色葡萄球菌一、实验目的一、实验目的n n学习了解金黄色葡萄球菌的生物学特性学习了解金黄色葡萄球菌的生物学特性n n学习掌握金黄色葡萄球菌的分离、鉴定方学习掌握金黄色葡萄球菌的分离、鉴定方法及原理法及原理实验十二金黄色葡萄球菌二、实验原理二、实验原理n n金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属，金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属，可产生可产生肠毒素肠毒素，人误食了含有毒素的食品，人误食了含有毒素的食品，就会发生食品中毒，因此，由该菌引起的中就会发生食品中毒，因此，由该菌引起的中毒为毒素型食物中毒。毒为毒
2、素型食物中毒。实验十二金黄色葡萄球菌生化特性生化特性n n典型的金葡菌呈球形，大小典型的金葡菌呈球形，大小0.51.0m。致病致病性菌较非致病性菌小性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长，。在液体培养基中生长，常呈双球菌或短链状排列。常呈双球菌或短链状排列。n n本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰革兰氏染色阳性。氏染色阳性。n n金葡菌金葡菌耐盐性强耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为，最适宜生长的盐浓度为5%5%7.5%,7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制杂可利用此特性对金葡菌增菌，抑制杂菌。菌。实验十二金黄色葡萄球菌n n可产生可产生溶血素溶血素，在血平
3、板生生长菌落周围，在血平板生生长菌落周围有有透明溶血环透明溶血环。n n可产生可产生卵磷脂酶卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油，分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱。脂和可溶性磷酸胆碱。n n致病性金葡菌可产生致病性金葡菌可产生血浆凝固酶血浆凝固酶。实验十二金黄色葡萄球菌金葡菌镜下特征实验十二金黄色葡萄球菌操作流程操作流程操作流程操作流程检样检样25g(mL) +稀释液稀释液225mL，均质，均质血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验7.5%氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤）BHI肉汤和营养琼脂斜面肉汤和营养琼脂斜面Baird-Parker平板，血平板平板，血平板涂片
4、染色涂片染色361 ， 18h24h结果报告结果报告361 B-P平板平板18h24h或或45h48h观察溶血观察溶血血平板血平板 18h24h实验十二金黄色葡萄球菌菌落特征菌落特征n nBaird-ParkerBaird-Parker平板平板平板平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色，：呈灰色到黑色，边缘为淡色，：呈灰色到黑色，边缘为淡色，：呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径2mm3mm2mm3mm。n n长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典长
5、期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。燥。燥。燥。n nBPBPBPBP培养基中含有培养基中含有培养基中含有培养基中含有卵黄亚碲酸钾卵黄亚碲酸钾卵黄亚碲酸钾卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细能抑制大多数细能抑制大多数细能抑制大多数细菌繁殖，并能促进金葡生长产生黑色和晕圈。菌繁殖，并能促进金葡生长产生黑色和晕圈。菌繁殖，并能促进金葡生长产生黑色和晕
6、圈。菌繁殖，并能促进金葡生长产生黑色和晕圈。n n丙酮酸钠丙酮酸钠丙酮酸钠丙酮酸钠和和和和甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸也能促进金葡生长也能促进金葡生长也能促进金葡生长也能促进金葡生长实验十二金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板平板实验十二金黄色葡萄球菌典型菌落特征：典型菌落特征：黑色黑色, , 有光泽有光泽, , 突起菌落并突起菌落并伴有透明圈，通常外层有清晰圈伴有透明圈，通常外层有清晰圈实验十二金黄色葡萄球菌n n血平板：菌落较大，圆形、光滑凸起、湿血平板：菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、润、金黄色金黄色（有时为白色），菌落周围可（有时为白色），菌落周围可见见完全透明溶血圈完全透明溶血圈。
7、实验十二金黄色葡萄球菌血平板血平板实验十二金黄色葡萄球菌血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验n n吸取新鲜兔血浆吸取新鲜兔血浆( (冻干血浆配制冻干血浆配制)0.5mL)0.5mL于小试于小试管中管中, , 加入培养加入培养24 h 24 h 的金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌BHIBHI肉汤培养物肉汤培养物0.20.20.3mL, 0.3mL, 震荡摇匀震荡摇匀, , 置置3636温箱或水浴内温箱或水浴内, , 每半小时观察一次每半小时观察一次, ,观察观察6 6小小时时, ,如呈现凝块如呈现凝块 , ,凝固体积大于原体积的一半凝固体积大于原体积的一半, ,为阳性结果为阳性结果. . 同时以已知阳性和
8、阴性葡萄球同时以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及菌菌株及BHIBHI肉汤作为对照肉汤作为对照. . n n结果可疑结果可疑: :挑取营养琼脂斜面的菌落到挑取营养琼脂斜面的菌落到5mlBHI 5mlBHI 36 36 培养培养181848h48h实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌形态符合，血浆凝固酶阳性的为金黄色葡萄形态符合，血浆凝固酶阳性的为金黄色葡萄球菌球菌结果报告：未检出结果报告：未检出/25g(mL)实验十二金黄色葡萄球菌三、实验器材三、实验器材n n2 2 设备和材料设备和材料设备和材料设备和材料 n n除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设除微生物实验室常规灭菌及培养设备外
9、，其他设除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：备和材料如下：备和材料如下：备和材料如下： n n恒温培养箱、冰箱、恒温培养箱、冰箱、恒温培养箱、冰箱、恒温培养箱、冰箱、 恒温水浴箱、恒温水浴箱、恒温水浴箱、恒温水浴箱、 天平、天平、天平、天平、 均质均质均质均质器、器、器、器、 振荡器、无菌吸管：振荡器、无菌吸管：振荡器、无菌吸管：振荡器、无菌吸管：1 mL1 mL（具（具（具（具 0.01 mL 0.01 mL 刻刻刻刻度）、度）、度）、度）、10 mL10 mL（具（具（具（具 0.1 mL 0.1 mL 刻度）或微量移液器及刻度
10、）或微量移液器及刻度）或微量移液器及刻度）或微量移液器及吸头、吸头、吸头、吸头、 无菌锥形瓶：容量无菌锥形瓶：容量无菌锥形瓶：容量无菌锥形瓶：容量 100 mL100 mL、500 mL500 mL、 无菌培养皿、无菌培养皿、无菌培养皿、无菌培养皿、 注射器：注射器：注射器：注射器：0.5 mL0.5 mL、 pH pH计或计或计或计或 pHpH比比比比色管或精密色管或精密色管或精密色管或精密 pHpH试纸。试纸。试纸。试纸。 实验十二金黄色葡萄球菌n n3 3 培养基和试剂培养基和试剂培养基和试剂培养基和试剂 n n3.1 10 %3.1 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录氯化钠胰酪胨大豆
11、肉汤：见附录氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录 A A中中中中 A.1A.1。 n n3.2 7.5 %3.2 7.5 %氯化钠肉汤：见附录氯化钠肉汤：见附录氯化钠肉汤：见附录氯化钠肉汤：见附录 A A中中中中 A.2A.2。 n n3.3 3.3 血琼脂平板：见附录血琼脂平板：见附录血琼脂平板：见附录血琼脂平板：见附录 A A中中中中 A.3A.3。 n n3.4 Baird-Parker3.4 Baird-Parker琼脂平板：见附录琼脂平板：见附录琼脂平板：见附录琼脂平板：见附录 A A中中中中 A.4A.4。 n n3.5 3.5 脑心浸出液肉汤脑心浸出液肉汤脑心
12、浸出液肉汤脑心浸出液肉汤(BHI) (BHI) ：见附录：见附录：见附录：见附录 A A中中中中 A.5A.5。 n n3.6 3.6 兔血浆：见附录兔血浆：见附录兔血浆：见附录兔血浆：见附录 A A中中中中 A.6A.6。 n n3.7 3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录 A A中中中中 A.7A.7。 n n3.8 3.8 营养琼脂小斜面：见附录营养琼脂小斜面：见附录营养琼脂小斜面：见附录营养琼脂小斜面：见附录 A A中中中中 A.8A.8。 n n3.9 3.9 革兰氏染色液：见附录革兰氏染色液：见附录
13、革兰氏染色液：见附录革兰氏染色液：见附录 A A中中中中 A.9A.9。 n n3.10 3.10 无菌生理盐水：见附录无菌生理盐水：见附录无菌生理盐水：见附录无菌生理盐水：见附录 A A中中中中 A.10A.10。 实验十二金黄色葡萄球菌四、实验内容及操作四、实验内容及操作n n金黄色葡萄球菌定性检验程序见图 实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌5.1 样品的处理样品的处理n n称取称取称取称取 25 g 25 g 样品至盛有样品至盛有样品至盛有样品至盛有 225 mL 225 mL 7.5 %7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %10 %氯化钠胰酪胨大
14、豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，的无菌均质杯内，的无菌均质杯内，的无菌均质杯内，8000 r/min8000 r/min10000 r/min 10000 r/min 均质均质均质均质 1 min1 min2 min2 min，或，或，或，或放入盛有放入盛有放入盛有放入盛有 225 mL 7.5 %225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %10 %氯化氯化氯化氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均钠胰酪胨大豆肉汤的
15、无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打质器拍打质器拍打质器拍打 1 min1 min2 min2 min。n n若样品为液态，吸取若样品为液态，吸取若样品为液态，吸取若样品为液态，吸取 25 mL 25 mL 样品至盛有样品至盛有样品至盛有样品至盛有225 mL 225 mL 7.5 %7.5 %氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或 10 %10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶的无菌锥形瓶的无菌锥形瓶的无菌锥形瓶( (瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内可预置适当数量
16、的无菌玻璃珠) )中，振荡混匀。中，振荡混匀。中，振荡混匀。中，振荡混匀。 实验十二金黄色葡萄球菌5.2 增菌和分离培养增菌和分离培养n n5.2.1 将上述样品匀液于将上述样品匀液于 36 1 培养培养 18 h24 h。金黄色葡萄球菌在。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 n n5.2.2 将上述培养物，将上述培养物， 分别划线接种到分别划线接种到 Baird-Parker平板和血平板平板和血平板， 血平板血平板 36 1 培培养养 18 h24 h。
17、Baird-Parker平板平板 36 1 培养培养 18 h24 h 或或45 h48 h。 实验十二金黄色葡萄球菌n n5.2.3 金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上，平板上，菌落直径为菌落直径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻
18、或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。浆凝固酶试验。 实验十二金黄色葡萄球菌5.3 鉴定鉴定n n5.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无阳性球菌
19、，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为荚膜，直径约为0.5 m1 m。 n n5.3.2 血浆凝固酶试验：血浆凝固酶试验： 挑取、挑取、 Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落1个或以上，个或以上， 分别接种到分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面和营养琼脂小斜面，36 1 培养培养18 h24 h。 实验十二金黄色葡萄球菌n n取新鲜配置兔血浆取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，放入小试管中，再加入再加入 BHI培养物培养物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇，振荡摇匀，置匀，置 36 1 温箱或水浴箱内，每半小时温箱或水浴箱内，每半小时观察一次
20、，观察观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。书操作，进行血浆凝固酶试验。 n n结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 1 培养培养 18 h48 h，重复，重复
21、试验。试验。 实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌计数金黄色葡萄球菌计数n n第二法第二法 BPBP平板计数平板计数(AOAC ISO) (AOAC ISO) 金葡含量金葡含量较高的食品较高的食品n n第三法第三法 MPNMPN计数计数 金葡含量较低而杂菌含量较金葡含量较低而杂菌含量较高高n n 实验十二金黄色葡萄球菌BPBP平板计数方法平板计数方法 样品稀释及样品接种样品稀释及样品接种n n根据对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择2 23 3个个适宜稀释度的样品匀液，在进行适宜稀释度的样品匀液，在进行1010倍递增倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取稀释
22、时，每个稀释度分别吸取1mL1mL样品匀液样品匀液以以0.3mL0.3mL、0.3mL0.3mL、0.4mL0.4mL接种量分别加入三接种量分别加入三块块BairdBairdParkerParker平板，然后用无菌平板，然后用无菌L L棒涂棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。布整个平板，注意不要触及平板边缘。 n nBairdBairdParkerParker平板表面有水珠，可放在平板表面有水珠，可放在25255050的培养箱里干燥，直到平板表的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。面的水珠消失。实验十二金黄色葡萄球菌BPBP平板计数方法平板计数方法培养培养n n涂布后，将平板静置涂布后，将
23、平板静置1010分钟，如样液不易分钟，如样液不易吸收，可将平板放在吸收，可将平板放在361361孵育孵育 1 h1 h；等样液吸收后反转平皿，倒置于培养箱，；等样液吸收后反转平皿，倒置于培养箱，361361培养，培养，45 h45 h48 h48 h。实验十二金黄色葡萄球菌典型菌落计数和确认典型菌落计数和确认n n金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在BairdBairdBairdBairdParkerParkerParkerParker平板上，菌落平板上，菌落平板上，菌落平板上，菌落直径为直径为直径为直径为2mm2mm2mm2mm3mm3mm3mm3mm，颜色呈灰色
24、到黑色，边缘为，颜色呈灰色到黑色，边缘为，颜色呈灰色到黑色，边缘为，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度n n偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。带及透明圈
25、。带及透明圈。带及透明圈。n n长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。并干燥。并干燥。并干燥。实验十二金黄色葡萄球菌典型菌落计数和确认典型菌落计数和确认选择菌落数在选择菌落数在20 cfu20 cfu200 cfu200 cfu之间平板上的典之间平板上的典型菌落计数型菌落计数 n n最低稀释度平板的菌落小于最
26、低稀释度平板的菌落小于20 cfu20 cfu，计数该，计数该稀释度平板上的典型菌落稀释度平板上的典型菌落 n n某一倍稀释度平板的菌落大于某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu200 cfu且有典且有典型菌落，但上一倍稀释度平板上没有典型菌型菌落，但上一倍稀释度平板上没有典型菌落，计数该级稀释度平板上的典型菌落；落，计数该级稀释度平板上的典型菌落；实验十二金黄色葡萄球菌典型菌落计数和确认典型菌落计数和确认n n某一倍稀释度平板的菌落大于某一倍稀释度平板的菌落大于某一倍稀释度平板的菌落大于某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu200 cfu200 cfu200 cfu且有典型菌且有典型菌且
27、有典型菌且有典型菌落，且上一倍稀释度平板上有典型菌落，其平板上落，且上一倍稀释度平板上有典型菌落，其平板上落，且上一倍稀释度平板上有典型菌落，其平板上落，且上一倍稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在的菌落数不在的菌落数不在的菌落数不在20 cfu20 cfu20 cfu20 cfu200 cfu200 cfu200 cfu200 cfu之间，计数该级稀之间，计数该级稀之间，计数该级稀之间，计数该级稀释度平板上的典型菌落；以上按公式一计算。释度平板上的典型菌落；以上按公式一计算。释度平板上的典型菌落；以上按公式一计算。释度平板上的典型菌落；以上按公式一计算。n n平板菌落数均在平板菌落数
28、均在平板菌落数均在平板菌落数均在20 cfu20 cfu20 cfu20 cfu200 cfu200 cfu200 cfu200 cfu之间，按公式二之间，按公式二之间，按公式二之间，按公式二计算。计算。计算。计算。n n从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分别接种到别接种到别接种到别接种到5mLBHI5mLBHI5mLBHI5mLBHI和营养琼脂小斜面，和营养琼脂小斜面，和营养琼脂小斜面，和营养琼脂小斜面，361361361361培培培培养养养养18181
29、81824h24h24h24h。实验十二金黄色葡萄球菌典型菌落计数和确认典型菌落计数和确认n n公式一：公式一：T=AB/CdT=AB/Cdn nT-T-样品中金黄色葡萄球菌落数样品中金黄色葡萄球菌落数n nA A 某一稀释度典型菌落的总数某一稀释度典型菌落的总数n nB B 某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数n nd d 某一稀释度某一稀释度n nC C 某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数数实验十二金黄色葡萄球菌样品稀释度样品稀释度 10-1-110-2典型菌落数典型菌落数66，646，6用于做血浆凝固酶用于做血浆凝固酶的菌落
30、数的菌落数55血浆凝固酶阳性菌血浆凝固酶阳性菌落数落数44实验十二金黄色葡萄球菌n nT=AB/CdT=AB/Cdn nT=65450.1=520T=65450.1=520实验十二金黄色葡萄球菌典型菌落计数和确认典型菌落计数和确认公式二公式二 N=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1dN=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1dn nN N样品中金黄色葡萄球菌落数样品中金黄色葡萄球菌落数n n A1- A1-第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落总数第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落总数n nA2-A2-第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落总数第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落总数n nB1-B1-第一稀
31、释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数性的菌落数n nB2-B2-第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数性的菌落数n n 实验十二金黄色葡萄球菌n nC1-C1-第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数凝固酶试验的菌落数n nC2-C2-第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数凝固酶试验的菌落数n nd d 稀释因子（第一稀释度）稀释因子（第一稀释度）n n1.11.1计算系数计算系数实验十二金黄色葡萄球菌样品稀释度样品稀释度 1
32、0-1-110-2典型菌落数典型菌落数150，16018，16用于做血浆凝固酶用于做血浆凝固酶的菌落数的菌落数55血浆凝固酶阳性菌血浆凝固酶阳性菌落数落数34实验十二金黄色葡萄球菌n n公式二公式二 N=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1dN=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1dn nA1B1/C1=15535=93A1B1/C1=15535=93n nA2B2/C2=1745=14A2B2/C2=1745=14n nT=(93+14)/1.1d=1271.10.1=970T=(93+14)/1.1d=1271.10.1=970实验十二金黄色葡萄球菌结果报告结果报告n n单位单位:cf
33、u/g:cfu/g或或cfu/mL cfu/mL n n如如T T值为值为0 0，报告，报告 1 d cfu/mL1 d cfu/mL（g g）。）。n n实验十二金黄色葡萄球菌检样检样25g(mL)+ 225ml灭菌菌生理生理盐水，均水，均质。10倍系列稀倍系列稀释选择3个个连续的适宜的适宜浓度的度的样品匀液，接种品匀液，接种BP平板平板计数及血数及血浆凝固凝固酶酶试验报告告 361 1824h 实验十二金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌MPNMPN计数计数n n样品稀释样品稀释样品稀释样品稀释 n n 接种和培养接种和培养接种和培养接种和培养n n根据对样品污染状况的估计，选择根据
34、对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择3 3 3 3个适宜稀释度个适宜稀释度个适宜稀释度个适宜稀释度 的的的的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行样品匀液（液体样品可包括原液），在进行样品匀液（液体样品可包括原液），在进行样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10101010倍递增倍递增倍递增倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取稀释时，每个稀释度分别吸取稀释时，每个稀释度分别吸取稀释时，每个稀释度分别吸取1mL1mL1mL1mL样品匀液接种到样品匀液接种到样品匀液接种到样品匀液接种到10%NaCl 10%NaCl 10%NaCl 10%NaCl 胰
35、蛋白胨大豆肉汤管，每个稀释度接种胰蛋白胨大豆肉汤管，每个稀释度接种胰蛋白胨大豆肉汤管，每个稀释度接种胰蛋白胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3 3 3 3管，管，管，管，将上述接种物将上述接种物将上述接种物将上述接种物361361361361培养，培养，培养，培养，45h45h45h45h48h48h48h48h。 n n用用用用3mm3mm3mm3mm接种环，从有细菌生长的各管中，移取接种环，从有细菌生长的各管中，移取接种环，从有细菌生长的各管中，移取接种环，从有细菌生长的各管中，移取1 1 1 1环，分环，分环，分环，分别接种别接种别接种别接种BairdBairdBairdBairdParker
36、ParkerParkerParker平板，平板，平板，平板，361361361361培养，培养，培养，培养，4545454548h48h48h48h。实验十二金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌MPNMPN计数计数典型菌落确认典型菌落确认典型菌落确认典型菌落确认n n从典型菌落中至少挑取从典型菌落中至少挑取从典型菌落中至少挑取从典型菌落中至少挑取1 1 1 1个可疑金黄色葡萄球菌菌个可疑金黄色葡萄球菌菌个可疑金黄色葡萄球菌菌个可疑金黄色葡萄球菌菌落接种到落接种到落接种到落接种到BHIBHIBHIBHI肉汤和营养琼脂小斜面，肉汤和营养琼脂小斜面，肉汤和营养琼脂小斜面，肉汤和营养琼脂小斜面，
37、361361361361培培培培养养养养1818181824h24h24h24h。进行血浆凝固酶试验。进行血浆凝固酶试验。进行血浆凝固酶试验。进行血浆凝固酶试验 结果计算：结果计算：结果计算：结果计算：n n计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPNMPNMPNMPN检索表检索表检索表检索表 结果报告结果报告结果报告结果报告n n根据检索表的数值，报告样品中金黄色葡萄球菌的根据检索表的数值，报告样品中金黄色葡萄球菌的根据检索表的数值，报告样品中金黄色葡萄球菌的根据检索表的数值，报告样品中金黄色葡萄球菌的含量，单位含量，单位含量，单位含量，单位:MPN/g:MPN/g:MPN/g:MPN/g或或或或MPN /mLMPN /mLMPN /mLMPN /mL。实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌
