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1、微生物学检验第微生物学检验第3 3版版20122012肺肺炎克雷伯与痰液标本检查炎克雷伯与痰液标本检查肺炎克雷伯菌革兰染色器材和试剂器材和试剂v 1 1、标本：痰液标本、标本：痰液标本v 2 2、菌种：、菌种：肺炎克雷伯肺炎克雷伯菌菌v 3 3、培养基：血平板、中国蓝平板、克氏、培养基：血平板、中国蓝平板、克氏双糖斜面培养基、半固体培养基、微量生双糖斜面培养基、半固体培养基、微量生化管等。化管等。9 9v 4 4、试剂：氧化酶纸片、试剂：氧化酶纸片、3%3%过氧化氢、革兰过氧化氢、革兰染色液、无菌生理盐水及生化管配套试剂。染色液、无菌生理盐水及生化管配套试剂。 v 5 5、其它、其它 ：显微镜
2、、培养箱、小试管、载：显微镜、培养箱、小试管、载玻片、接种针、接种环、酒精灯、火柴、非玻片、接种针、接种环、酒精灯、火柴、非发酵菌生化编码表等。发酵菌生化编码表等。器材和试剂器材和试剂10101. 1. 鼻咽拭子鼻咽拭子 采集时，患者用清水漱口，对光而坐，头向采集时，患者用清水漱口，对光而坐，头向上仰张大口，用压舌板轻压舌根，取无菌鼻咽拭子上仰张大口，用压舌板轻压舌根，取无菌鼻咽拭子绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次小心取出，避免接触口腔部其他组织。小心取出，避免接触口腔部其他组织。2咽拭子咽拭子将拭子用无菌生理盐水湿润，用压舌板轻压舌将拭
3、子用无菌生理盐水湿润，用压舌板轻压舌根，暴露整个口咽部。先用拭子轻擦扁桃体表面后根，暴露整个口咽部。先用拭子轻擦扁桃体表面后弃去，再取弃去，再取1支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压出的分泌物，或擦取伪膜等病变部位。出的分泌物，或擦取伪膜等病变部位。标本的采集标本的采集111112123. 3. 痰液标本痰液标本 （1 1）自然咳痰法：受检者用清水溯口数次后，）自然咳痰法：受检者用清水溯口数次后，用力咳嗽自气管深部将痰咳出吐至无菌容器中。用力咳嗽自气管深部将痰咳出吐至无菌容器中。对痰量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸入对痰量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸入4545左右
4、的左右的10%10%氯化钠水溶液，使痰容易排出。对于氯化钠水溶液，使痰容易排出。对于幼儿，可轻轻压迫胸骨上部气管，使其咳嗽而取幼儿，可轻轻压迫胸骨上部气管，使其咳嗽而取之。之。标本的采集标本的采集1313（2 2）气管镜采集法：用气管镜在肺部内病灶处直接）气管镜采集法：用气管镜在肺部内病灶处直接吸取标本，或用气管刷采取标本。吸取标本，或用气管刷采取标本。（3 3）气管或环甲膜穿刺法：主要用于厌氧菌培养。）气管或环甲膜穿刺法：主要用于厌氧菌培养。标本的采集标本的采集1414革兰阳性细菌革兰阳性细菌革兰阴性细菌革兰阴性细菌正常菌群正常菌群 和和链球菌、微球菌、链球菌、微球菌、表皮葡萄球菌、四联球表
5、皮葡萄球菌、四联球菌、白喉以外的棒状杆菌、白喉以外的棒状杆菌、乳杆菌菌、乳杆菌 除脑膜炎和淋病奈瑟除脑膜炎和淋病奈瑟菌外的其他奈瑟菌、菌外的其他奈瑟菌、其他嗜血杆菌其他嗜血杆菌 上呼吸道上呼吸道常见致常见致病菌病菌 化脓性链球菌、金黄色化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、白喉棒状杆葡萄球菌、白喉棒状杆菌、结核分枝杆菌、白菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌色念珠菌 脑膜炎奈瑟菌、流感脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、百日咳鲍嗜血杆菌、百日咳鲍特菌、肺炎克雷伯菌、特菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌大肠埃希菌、铜绿假铜绿假单胞菌单胞菌 下呼吸道下呼吸道常见致常见致病菌病菌 化脓性链球菌化脓性链球菌 、金黄色、金黄色葡萄球
6、菌、肺炎链球菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌、结核分白喉棒状杆菌、结核分枝杆菌、厌氧菌、放线枝杆菌、厌氧菌、放线菌、奴卡菌菌、奴卡菌 脑膜炎奈瑟菌、流感脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、伯菌、大肠埃希菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌、产气、产气肠杆菌、嗜肺军团菌肠杆菌、嗜肺军团菌痰液标本常见的分离菌痰液标本常见的分离菌1515血平板血平板巧克力平板巧克力平板中国蓝平板中国蓝平板 鼻咽拭子鼻咽拭子 直接涂片染色检查直接涂片染色检查革兰染色革兰染色异染颗粒异染颗粒初步报告初步报告 白喉棒状杆菌培养白喉棒状杆菌培养菌落形态、涂片染色菌落形态、涂片染色初步报告初步
7、报告 生化反应、血清学鉴定生化反应、血清学鉴定检验程序检验程序常规培养常规培养 百日咳杆菌培养百日咳杆菌培养 血清斜面培养基血清斜面培养基鸡蛋培养基鸡蛋培养基鲍鲍-金培养基金培养基亚碲酸钾血平板纯培养亚碲酸钾血平板纯培养菌落形态、涂片染色菌落形态、涂片染色1616血平板血平板巧克力平板巧克力平板中国蓝平板中国蓝平板 普通培养普通培养普通培养普通培养普通培养普通培养35、1824h35、1824h35、1824h痰液标本痰液标本 肉眼观察肉眼观察 涂片染色观察涂片染色观察 初步报告初步报告 培养前处理培养前处理 菌落形态和涂片染色菌落形态和涂片染色 生化反应、血清学鉴定生化反应、血清学鉴定报告报
8、告 检验程序检验程序1717 1 1、肉眼观察：下呼吸道标本为痰液，选、肉眼观察：下呼吸道标本为痰液，选取脓血性的痰液用于细菌学检验。异常恶取脓血性的痰液用于细菌学检验。异常恶臭的脓性痰，常见于肺脓疡患者，而且可臭的脓性痰，常见于肺脓疡患者，而且可能与厌氧菌有关。痰液中有颗粒状、菌块能与厌氧菌有关。痰液中有颗粒状、菌块和干酪样物质可能与放线菌病和曲霉菌感和干酪样物质可能与放线菌病和曲霉菌感染有关。染有关。痰液标本检验操作流程痰液标本检验操作流程1818 2 2、涂片检查：挑选痰液中脓、血性部分涂、涂片检查：挑选痰液中脓、血性部分涂片，干燥固定后，进行革兰染色镜检。片，干燥固定后，进行革兰染色镜
9、检。 如发现形态典型、有特殊结构，初步可以如发现形态典型、有特殊结构，初步可以确定所属菌属或种的细菌，可直接报告。确定所属菌属或种的细菌，可直接报告。 如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌，可报如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌，可报告告“痰液涂片查见革兰阳性球菌，形似葡萄痰液涂片查见革兰阳性球菌，形似葡萄状状”；痰液标本检验操作流程痰液标本检验操作流程1919 如查见革兰阳性双球菌、矛头状、有明显如查见革兰阳性双球菌、矛头状、有明显荚膜时，可报告荚膜时，可报告“痰液涂片查见革兰阳性双痰液涂片查见革兰阳性双球菌，形似肺炎球菌球菌，形似肺炎球菌”。 如不能直接确定菌属或种的细菌，可报告如不能直接确定菌属或
10、种的细菌，可报告“痰液涂片查见革兰痰液涂片查见革兰性性菌菌”。如果痰片。如果痰片中均为鳞状上皮细胞，则应视为不合格标本。中均为鳞状上皮细胞，则应视为不合格标本。 痰液标本检验操作流程痰液标本检验操作流程20203 3、分离培养：、分离培养： 1 1）痰液标本的前处理）痰液标本的前处理v A. A. 均质化法：加入等量的均质化法：加入等量的PH 7.6 PH 7.6 的的1% 1% 胰胰酶溶液，放置酶溶液，放置3535、90 min90 min使痰液均质化；使痰液均质化；v 痰液标本检验操作流程痰液标本检验操作流程2121v B. B. 洗涤法：取无菌平皿洗涤法：取无菌平皿4 4个，加入无菌生个
11、，加入无菌生理盐水理盐水20ml 20ml ，将痰液标本放入第，将痰液标本放入第1 1个平皿中，个平皿中，用接种环用力震摇，将脓痰分散为小块悬浮用接种环用力震摇，将脓痰分散为小块悬浮于盐水内，将小块脓痰取出依次放入第于盐水内，将小块脓痰取出依次放入第2 2、3 3、4 4个平皿中重复以上操作。最后在第个平皿中重复以上操作。最后在第4 4个平皿个平皿收集脓痰小块，接种于平皿。同时接种未经收集脓痰小块，接种于平皿。同时接种未经洗涤的痰液标本，作为对照。洗涤的痰液标本，作为对照。痰液标本检验操作流程痰液标本检验操作流程2222v 2 2）取经过前处理的痰液标本分别接种血平）取经过前处理的痰液标本分别
12、接种血平板、巧克力平板和中国蓝平板。巧克力平板板、巧克力平板和中国蓝平板。巧克力平板置置5%5%10% CO10% CO2 2 环境培养，其他平板于普通环境培养，其他平板于普通环境环境3535孵育孵育181824h 24h 。根据菌落形态，细。根据菌落形态，细菌染色观察，进一步进行鉴定。菌染色观察，进一步进行鉴定。痰液标本检验操作流程痰液标本检验操作流程2323特殊菌的培养特殊菌的培养v1.1.结核分枝杆菌培养：无菌吸管加前处理标本结核分枝杆菌培养：无菌吸管加前处理标本2-32-3滴于罗滴于罗- -琴培养基琴培养基3535孵育至孵育至8 8周，每周观察一次；周，每周观察一次； v2.2.嗜肺军
13、团菌培养：取气管分泌物接种于活性炭酵嗜肺军团菌培养：取气管分泌物接种于活性炭酵母琼脂母琼脂(CYE)(CYE)或费或费- -高高(F-G)(F-G)平板，平板，3535、2.5%CO2.5%CO2 2培培养，每天用肉眼观察，直至第养，每天用肉眼观察，直至第1414天；天；v3.3.百日咳鲍特菌的培养：将标本直接接种在鲍百日咳鲍特菌的培养：将标本直接接种在鲍- -金金培养基上，置有盖的玻璃缸（缸内加少量的水，并培养基上，置有盖的玻璃缸（缸内加少量的水，并在水中加少许硫酸铜，防止细菌及霉菌生长）中，在水中加少许硫酸铜，防止细菌及霉菌生长）中，3535 孵育孵育3 35 5天。天。 2424v4.
14、4. 白喉棒状杆菌培养：将标本接种于血清斜面或鸡白喉棒状杆菌培养：将标本接种于血清斜面或鸡蛋培养基，蛋培养基，3535 孵育孵育8-10h8-10h观察；观察；v5.5.流感嗜血杆菌培养：将标本接种于血平板和巧克流感嗜血杆菌培养：将标本接种于血平板和巧克力平板，并在平板中央接种一直线金黄色葡萄球菌力平板，并在平板中央接种一直线金黄色葡萄球菌（或四角点种），（或四角点种），3535、5%-10% CO5%-10% CO2 2环境孵育环境孵育18-18-24h24h。 v6.6.脑膜炎奈瑟菌培养：将鼻烟拭子接种于已保温在脑膜炎奈瑟菌培养：将鼻烟拭子接种于已保温在350C350C的卵黄双抗平板上，的
15、卵黄双抗平板上，3535、5%-10% CO25%-10% CO2环境孵环境孵育育181824h24h。特殊菌的培养特殊菌的培养2525结果报告结果报告v1.1.如发现可疑致病菌落，则进行涂片染色观察、如发现可疑致病菌落，则进行涂片染色观察、生化反应及血清学鉴定得出报告生化反应及血清学鉴定得出报告“检出检出x xx x细菌，细菌，并报告该菌在培养基中的大慨比例并报告该菌在培养基中的大慨比例”；v2.2.如无致病菌落生长，则继续培养至如无致病菌落生长，则继续培养至48h48h，平板上，平板上均为咽部正常菌群生长，无可疑致病菌落生长，均为咽部正常菌群生长，无可疑致病菌落生长，则报告则报告“正常菌群
16、生长正常菌群生长”；v3.3.如虽在平板上未发现特定的致病菌，但某种常如虽在平板上未发现特定的致病菌，但某种常居菌比正常情况明显增多或近似纯培养，考虑可居菌比正常情况明显增多或近似纯培养，考虑可能菌群失调或菌群交替症，也可进行鉴定后报告能菌群失调或菌群交替症，也可进行鉴定后报告“x xx x菌纯培养菌纯培养”或或“x xx x菌生长旺盛菌生长旺盛”。 2626注意事项注意事项v1.1.上呼吸道标本要及时送检，防止干燥。采上呼吸道标本要及时送检，防止干燥。采集时尽量避免正常菌群的污染。集时尽量避免正常菌群的污染。v2.2.痰液标本最好采取晨痰。痰液标本最好采取晨痰。v3.3.上呼吸道有大量的正常
17、菌群，正常情况下上呼吸道有大量的正常菌群，正常情况下这些细菌并不致病，但在机体抵抗力下降或这些细菌并不致病，但在机体抵抗力下降或某些因素作用下，可以侵入下呼吸道致病。某些因素作用下，可以侵入下呼吸道致病。特别是在抗生素作用下或在大量正常菌群掩特别是在抗生素作用下或在大量正常菌群掩盖下，致病菌难以检出。盖下，致病菌难以检出。2727v一、痰液标本一、痰液标本 分区画线接种到血平板、中国蓝平板分区画线接种到血平板、中国蓝平板v二、提供的菌落二、提供的菌落v1 1、进行涂片、进行涂片G G染色观察细菌形态；染色观察细菌形态；v2 2、触酶试验、氧化酶试验；、触酶试验、氧化酶试验；v3 3、接种于半固
18、体、克式双糖培养基；、接种于半固体、克式双糖培养基；v4 4、接种到各种肠杆菌科生化鉴定培养基中；、接种到各种肠杆菌科生化鉴定培养基中；v三、放入三、放入3535恒温培养箱进行培养恒温培养箱进行培养具体实验操作具体实验操作第一天的主要操作：第一天的主要操作：2828肠杆菌科细菌生化鉴定编码表肠杆菌科细菌生化鉴定编码表1234葡萄糖葡萄糖赖赖氨氨酸酸鸟鸟氨氨酸酸氨氨基基酸酸对对照照硫硫化化氢氢靛靛基基质质乳乳糖糖卫卫茅茅醇醇苯苯丙丙氨氨酸酸尿尿素素枸枸橼橼酸酸盐盐产酸产酸产气产气产气产气产气产气琥珀琥珀琥珀琥珀琥珀琥珀无色无色紫色紫色黑色黑色黄色黄色紫色紫色无无色色紫紫色色紫紫色色红红色色黄黄色
19、色黄黄色色无无色色绿绿色色无无色色红红色色淡淡绿绿蓝蓝色色原来原来颜色颜色阳性阳性颜色颜色标记为红色的加石腊油标记为红色的加石腊油v1. 1. 取出标本分离培养的血平板、中国蓝平板取出标本分离培养的血平板、中国蓝平板观察平板上的菌落形态、颜色；观察平板上的菌落形态、颜色；具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：3030v2. 2. 观察半固体培养基观察半固体培养基具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：3131v3. 3. 观察观察克式双糖培养基克式双糖培养基具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：3232v4. 4. 观察生化反应，
20、查表鉴定观察生化反应，查表鉴定具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：3333肠杆菌科细菌生化鉴定编码表肠杆菌科细菌生化鉴定编码表1234葡萄糖葡萄糖赖赖氨氨酸酸鸟鸟氨氨酸酸氨氨基基酸酸对对照照硫硫化化氢氢靛靛基基质质乳乳糖糖卫卫茅茅醇醇苯苯丙丙氨氨酸酸尿尿素素枸枸橼橼酸酸盐盐产酸产酸产气产气产气产气产气产气琥珀琥珀琥珀琥珀琥珀琥珀无色无色紫色紫色黑色黑色黄色黄色紫色紫色无无色色紫紫色色紫紫色色红红色色黄黄色色黄黄色色无无色色绿绿色色无无色色红红色色淡淡绿绿蓝蓝色色原来原来颜色颜色阳性阳性颜色颜色标记为红色的加石腊油标记为红色的加石腊油v5. 5. 根据以上的鉴定，报告出鉴定结果根据以上的鉴定，报告出鉴定结果具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：3535结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！36
