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1、HIV感染的实验诊断1 一、一、HIV感染后的免疫和病毒学感染后的免疫和病毒学2HIV的基因组结构和蛋白的基因组结构和蛋白基质基质 衣壳衣壳 核衣壳核衣壳 表面糖蛋白表面糖蛋白 跨膜糖蛋白跨膜糖蛋白蛋白酶蛋白酶 反转录酶反转录酶 整合酶整合酶HIV结构基因,有3个env(核苷酸5781-8360)编码包膜蛋白p160、120、41等。 gag(核苷酸310-1860)编码病毒核心/衣壳蛋白p55、24、15、17；pol(核苷酸1629-4673)编码逆转录酶(RT)、p66、51、32、11等；HIV调节基因,有6个tat:上调mRNA,促病毒复制-启动rev:调节病毒mRNA-开关vif:
2、增强出芽,释放新病毒颗粒-感染因子nef:下调mRNA,抑病毒复制-制动vpu:仅见于HIV-1,功能不详；vpx:仅见于HIV-2,功能不详。345days5脑部：巨嗜细胞和胶质细胞脑部：巨嗜细胞和胶质细胞淋巴系统淋巴系统:胸腺胸腺淋巴结淋巴结脾脏脾脏肠道：嗜铬细胞肠道：嗜铬细胞前列腺精液前列腺精液阴道黏液阴道黏液骨髓骨髓肺胞巨嗜细胞肺胞巨嗜细胞血液血液细胞积存细胞积存细胞积存细胞积存: :CD4CD4+ +T T 淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞巨嗜细胞巨嗜细胞巨嗜细胞巨嗜细胞胶质细胞胶质细胞胶质细胞胶质细胞嗜铬细胞嗜铬细胞嗜铬细胞嗜铬细胞 Image from: Kahn and Wal
3、ker, M.D. NEJM 1998, Volume 339:33-39 July 2 6感染HIV后的血清学变化HIV RNA浓度浓度p24Agp24AgP24 AgP24 AgAnti-gp41,120,160Anti-gp41,120,160Anti-p24,55Anti-p24,55感染感染感染感染1 1 1 1周周周周 2 2 2 2周周周周 6 6 6 6周周周周 12121212周周周周 8 8 8 810 10 10 10 年年年年急性期潜伏期艾滋病期检出线7HIV-1早期感染病毒标志物的动态观察早期感染病毒标志物的动态观察HIV RNAHIV p24 antigenHIV
4、antibodies窗口期血浆RNAP24前病毒DNAHIV抗体:ELISAHIV抗体:WB8HIV感染者的三种临床转归感染者的三种临床转归VirusCD4CD8 a aHIVCD4CD4CD8CD8 a aHIVVirusVirus典型典型 810 y快速快速 : 4-5 y : (2%)缓慢缓慢/长期不进展长期不进展 : 10 y : (2%)9二、HIV酶联筛查检测方法和试剂感染急性期感染急性期 ， 窗口期窗口期 检测试剂以检测试剂以ELISAELISA为主，还有为主，还有PAPA，斑点免疫胶体金和免疫，斑点免疫胶体金和免疫层析。层析。ELISAELISA试剂为试剂为HIV1/2HIV1
5、/2型，包括型，包括MM和和O O组，组，N N组不包组不包括但很少。括但很少。 三四五代酶联试剂的差异和使用策略：三四五代酶联试剂的差异和使用策略：三代成熟质量稳定，窗口期三代成熟质量稳定，窗口期20d;20d;四代提前四代提前4 49d9d，质量不，质量不稳定，用于血站急性感染的检测。稳定，用于血站急性感染的检测。 筛查试验和确认试验的差异：筛查试验和确认试验的差异：酶联试验敏感性高于确认试验，四代试剂敏感性更高，酶联试验敏感性高于确认试验，四代试剂敏感性更高，确认阴性的不一定是真阴性。确认阴性的不一定是真阴性。 10（一）HIV抗体ELISA检测试剂（血液）第三代：双抗原夹心法，可检测所
6、有类型抗体，由于能检出IgM抗体，缩短了窗口期，有报道说较第二代产品平均可提前5天作出诊断。第四代：双抗原（抗体）夹心法，将HIV P24抗体和HIV抗原同时包被，再加入待检血清，最后加入酶标记的HIV抗原和HIV P24单克隆抗体，同时检测血清中的HIV P24抗原和HIV抗体。第五代：HIV抗体和P24抗原实现分别检测，真正实现早期诊断。11FourthGenerationThirdGenerationSecondGenerationIgMIgG12各种HIV检测方法平均窗口期方法平均天数第2代EIA45第3代EIA22P24抗原16HIVRNA1113（二）、检测试剂的质量指标灵敏度诊断
7、试验的灵敏度有两个不同意义：1代表一个试验能检测最少量被分析物（如抗体）的能力。通常可对阳性血清进行稀释以确认哪个试验更敏感。2指某试验检出阳性的能力（无假阴性）。一个试验有可能检出很少量的某抗体，但也可因试验中缺少适当的抗原而漏掉一些阳性样品。142特异性指某试验正确鉴定所有阴性的能力（无假阳性）。大部分HIV筛查试验不是100%特异，可用公式计算真阴性特异度=100%真阴性+假阳性注：公式中真阴性指试验中所能检测的真阴性数。如100份血清，5份真阳性，95份真阴性，与参考试验比较，某试验检出6份阳性（一份假阳性），则特异性=94/(94+1)100%=98.9%153试验效率指某试验正确鉴
8、定所有阳性和阴性的总体能力（无假阳性或假阴性），是灵敏度和特异性的综合指标，反映了该试验的总的效率。真阳性+真阴性试验效率=100%真阳性+假阳性+真阴性+假阴性注:公式中真阳性和真阴性指试验数目。在以上例子中，检测100份血清，5份真阳性，95份真阴性，1份假阳性，1份假阴性，因此4+94试验效率=100%=98%4+1+94+1164预测值预测值与以上的参数不同，它描述的是考虑了被检人群中感染的流行因素后的试验评价。阳性预测值（PPV）：定义为在所有阳性结果人群中感染个体所占比例。阴性预测值（NPV）：定义为在所有阴性结果人群中未感染个体所占比例。真阳性阳性预测值=100%真阳性+假阳性真
9、阴性阴性预测值=100%真阴性+假阴性注：公式中真阳性和真阴性指试验数目。17在感染流行率较高（5%）的人群中1000人受检：50份真阳性（已感染），950份真阴性（未感染），5份假阳性（试验结果），5份假阴性（试验结果），计算PPV=45/(45+5)100%=90%NPV=945/(945+5)100%=99.5%在另一人群有相同的结果（即相同数量的假阳性和假阴性）在感染流行率较低的人群（0.7%）中1000人受检：7份真阳性（已感染），993份真阴性（未感染），5份假阳性（试验结果），5份假阴性（试验结果），计算PPV=2/2+5=28.6%NPV=988/988+5=99.5%185艾
10、滋病病原诊断中的几个问题明确不同实验方法的意义和适应范围：HIV血清学检测方法可分初筛和确证两类。HIV初筛试验特异性不够强，有时会造成一些假阳性结果，故在初筛试验出现阳性结果时，应再重复试验，若仍为阳性再用确证试验（WestBlot）去证实。但一些非感染者的血液也会对某些抗原显示反应（出现的条带不够判为阳性的标准），在正常的非感染者人群中发生比例15%，所以如果用WB来测ELISA阴性者的血清，有些标本被视为不确定。出现不确定结果时，可能是HIV早期感染或是非特异反应，应在1-6个月后复查，并结合个体的临床表现、感染因素、WB带型等综合分析后做出结论。19针对HIV感染不同时期选用不同的检测
11、手段：HIV感染后两周内，无法查到抗体。两周后出现病毒血症，可用P24抗原检测方法或测逆转录酶活性。6-8周后抗体产生时，进行抗体检测。诊断HIV感染在早期可检测抗原，而在感染后的大多数时间，可用血清学方法诊断。20 HIV HIV抗体测定的预测值：试剂的敏感性和特异抗体测定的预测值：试剂的敏感性和特异性可衡量优劣，但不能完全决定一个测定结果正确性可衡量优劣，但不能完全决定一个测定结果正确与否的可能性大小，与预测值关系更大。与否的可能性大小，与预测值关系更大。 預測值除与试剂好坏有关外，还取决于测定对預測值除与试剂好坏有关外，还取决于测定对象本身患病率的高低。由表象本身患病率的高低。由表1 1
12、可以看出：在用可以看出：在用ELISAELISA法对高危人群检测时，其阳性预测值为法对高危人群检测时，其阳性预测值为99.98%99.98%，而，而在非高危人群中，阳性预测值仅为在非高危人群中，阳性预测值仅为18.94%18.94%（即查出（即查出阳性结果是真阳性的机率只有阳性结果是真阳性的机率只有18.94%18.94%），反之阴性），反之阴性结果的机率为结果的机率为99.997%99.997%。21表1ELISA法HIV1抗体测定的预示值人群人群预示值预示值 (%)(%)阳性阳性阴性阴性旧金山同旧金山同性恋人群性恋人群99.9880.0699.9880.06美国非高美国非高危人群危人群18
13、.9499.99718.9499.99722HIV抗体检测反应强度与HIV感染的概率：ELISA法可根据光密度（OD）值的强度直接确定。反应越强的血清，含有HIV抗体的可能性就越大。表2中正常献血员（感染率30/10万），中等强度反应时，HIV抗体阳性概率仅为1%，高强度反应时，则为86.1%。见表2。不仅要看阴阳结果，还要看反应强度或S/CO比值。23表2HIV感染机率与ELISA反应强度的关系人群人群HIVHIV感染感染率（率（/10/10万）万）ELISAELISA反应强度（反应强度（%）低度低度中度中度高度高度 非高危献非高危献血员血员 30300.00070.00071.131.13
14、86.186.1高危献血高危献血员员 95950.00220.00223.483.4895.295.2军人军人 1501500.00360.00365.395.3996.996.9吸毒者吸毒者 45000450001.911.9196.696.699.999.924注：1、数字表示相应强度反应的血清中含有HIV抗体的概率2、低度为S/CO1,中度为1S/CO6。25三、确认试验n nWB为主，还有：线性免疫试验（LIA）,放射免疫沉淀试验（RIPA）和免疫荧光试验（IFA）。n nWB存有培养病毒的宿主细胞成分，容易出现非特异性反应造成不确定结果，LIA使用重组蛋白（多肽），非特异性大大减少，
15、试剂盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。26（一）、HIV抗体强度与抗体带型的关系抗体带型抗体带型 11515全带型全带型8 8条带型条带型6 6条带型条带型5 5条带型条带型4 4条带型条带型3 3条带型条带型2 2条带型条带型1 1条带型条带型1 11 11 15 51 16 64 42 2 1061067 72 21 12 22 246461 12 2 合计合计1 12 21818120120494927（二）、HIV病毒载量与抗体带型的关系 载量载量带型带型 5 510105 510102 2 5 510102 210103 3 10103 310104 4 1
16、0104 410105 5 10105 5全带型全带型8 8条带型条带型6 6条带型条带型5 5条带型条带型4 4条带型条带型3 3条带型条带型2 2条带型条带型1 1条带型条带型4 41 11 18 81 171714 41 12 21 166663 33 31 12 21 11 11 18 83 33 32 22 2合计合计6 69 979797878181828（三）、造成WB假阳性或不确定的原因n1.实验室操作中，阴性样本被污染或洗涤不彻底。实验室操作中，阴性样本被污染或洗涤不彻底。n2.HIV感染急性期，窗口期附近，仅显示gp160或120，或P24，P31，P55带；此时ELISA
17、往往已显示阳性反应 n3.晚期AIDS病人，部分抗体如P24，P31丢失n4.其他病毒感染的交叉反应，如风疹，麻疹，腮腺炎等n5.自身免疫病，高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮）高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮）n6.肾衰竭和血透析 n7.遗传性胰腺囊肿 n8.多次怀孕或输血 n9. 肝病 n10.乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。 11.11.线粒体核酸和线粒体核酸和T T细胞白细胞抗原引起的抗体细胞白细胞抗原引起的抗体29n在无高危行为的献血和孕妇人群中，WBWB不确定率不确定率10-15%10-15%，甚至，甚至高达32.Gag蛋白抗体条带最常见。条带最常见。n nELISAELISA筛查
18、阳性结果中，筛查阳性结果中，WBWB不确定占不确定占4-20%,4-20%,俄罗斯报告占俄罗斯报告占12.7%12.7%。n n我国，我国，125125份确认为份确认为HIV-1HIV-1抗体阳性抗体阳性; ;条带出现百分率为：条带出现百分率为：gp160gp160、p24p24为为100%,100%, gp120gp120、gp41gp41、p66p66、p51p51和和p31p31在在96%96%以上以上, ,p17p17、p55p55分别为分别为86.4%86.4%和和85.6%.85.6%. n n上海，上海，3636例例WBWB试验试验 gp120gp120和和 p24p24双阳性者
19、的跟踪随访和核酸辅助诊双阳性者的跟踪随访和核酸辅助诊断发现，至少断发现，至少2424例可判定为例可判定为HIV-1HIV-1感染。感染。5 5例样本的核酸测定结果与例样本的核酸测定结果与血清学随访检测结果的符合率达到血清学随访检测结果的符合率达到100%100%。2525例随访到的对象中，例随访到的对象中，1818例样本平均例样本平均1717天后条带有明显进展，可以判定为天后条带有明显进展，可以判定为HIVHIV抗体阳转抗体阳转 。 （四）WB不确定结果的有关数据30（五）假阴性结果n n指EIA+WB的假阴性n n原因急性感染后的抗体迟反应急性感染后的抗体迟反应不同不同HIVHIV毒株型毒株
20、型发病晚期抗体消失发病晚期抗体消失窗口期：几周到窗口期：几周到6 6个月，与当地个月，与当地HIVHIV流行率有关流行率有关HIVHIV亚型，亚型，M/N/OM/N/O组间差异组间差异31（六）、确认试验不确定标本的常规处理n按照全国艾滋病检测技术规范（2004年版）的要求，只能作“3个月后复检”的处理，三个月后复检1次，连续2次，共6个月。n其转归有两种可能：仍呈现不确定或阴性，则诊断为HIV抗体阴性；带型发生进展，符合HIV抗体阳性判断标准，则诊断为HIV抗体阳性。后者是真正的窗口期感染者（一般为2-3个月，最长6个月） ，只占很小的比例；大多数为非感染者，但由于WB反应的敏感性而出现条带
21、。n如有必要，可用辅助诊断方法对不确定样本进行实验诊断。32确认结果不确定标本的辅助诊断1 1、病毒载量：、病毒载量：RT-PCR,NASBA,b-DNART-PCR,NASBA,b-DNA，高拷贝的结果提，高拷贝的结果提示感染。小于示感染。小于1818个月婴儿在个月婴儿在1000010000拷贝拷贝/ /毫升应做毫升应做HIVHIV感感染处理。注意不同方法间结果的差异，阴性不排除感染处理。注意不同方法间结果的差异，阴性不排除感染。染。2 2、免疫标志物：、免疫标志物：CD4/CD8,CTL,CD4/CD8,CTL,微球蛋白和微球蛋白和NeopterinNeopterin等。等。CD4CD4计
22、数常用，计数常用，CD4/CD8CD4/CD8小于小于1 1提示感染。提示感染。3 3、核酸定性：、核酸定性：DNADNAPCRPCR或或 RT-PCRRT-PCR，阳性不能单独用，阳性不能单独用于感染的诊断，阴性不排除感染。于感染的诊断，阴性不排除感染。4 4、P24P24抗原检测：阳性结果需经中和实验确认，才提示抗原检测：阳性结果需经中和实验确认，才提示HIVHIV感染。阴性不排除感染，因敏感性低：感染。阴性不排除感染，因敏感性低：30308080。5 5、病毒分离：特异性好，但敏感性不高，潜伏期难分离、病毒分离：特异性好，但敏感性不高，潜伏期难分离6 6、流行病学调查和临床症状：近期是否
23、有、流行病学调查和临床症状：近期是否有HIVHIV高危行为，高危行为，是否有急性期的相关症状。是否有急性期的相关症状。33四、HIV感染的早期（窗口期）诊断1 1、 早期诊断的意义早期诊断的意义 通常窗口期急性感染时出现病毒血症，此期通常窗口期急性感染时出现病毒血症，此期间病毒载量，间病毒载量，P24P24抗原均很高，是抗原均很高，是HIVHIV快速复制阶快速复制阶段，具有高感染力；以下情况下，非常有必要尽段，具有高感染力；以下情况下，非常有必要尽快开展快开展HIVHIV感染早期诊断：感染早期诊断： （1 1）安全用血）安全用血- -窗口期血液筛查；窗口期血液筛查； （2 2）个体需求）个体需
24、求- -暴露后诊断，包括通过输血、暴露后诊断，包括通过输血、静脉吸毒、针刺等的血液暴露，以及同性恋、异静脉吸毒、针刺等的血液暴露，以及同性恋、异性恋等性途径暴露；性恋等性途径暴露； （3 3）各种职业暴露后的风险评估，医生警察。）各种职业暴露后的风险评估，医生警察。 342、早期感染的诊断方法抗原检测抗原检测 P24P24抗原抗原EIAEIA试剂试剂盒在血清抗体阳转前试剂试剂盒在血清抗体阳转前2-182-18天即可以检测到。第四代天即可以检测到。第四代HIVELISAHIVELISA试剂试剂敏感性和特异性均有了很大提高，可以作为血敏感性和特异性均有了很大提高，可以作为血源筛查；源筛查； 病毒病毒RNARNA定性与定量检测定性与定量检测 第一次病毒血症高峰时间大约在感染后第一次病毒血症高峰时间大约在感染后4-4-1111天，可以用核酸检测进行辅助诊断。天，可以用核酸检测进行辅助诊断。应用辅助诊断时方法时，应综合考虑流行病史、应用辅助诊断时方法时，应综合考虑流行病史、核酸检测值、临床表现、其他检测（病毒分离，核酸检测值、临床表现、其他检测（病毒分离，CD4CD4细胞，抗原）等。细胞，抗原）等。 35
