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1、TSH荧光酶免疫检测法 相关帮助n n需要相关抗体试剂的可以访问需要相关抗体试剂的可以访问FantibodyFantibody全球抗体搜索全球抗体搜索引擎引擎n nfantibodyfantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与并
2、评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台n n需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网务信息的，可以访问探生网biomeanbiomean进行咨询，期待您进行咨询，期待您的加入的加入 一、先天性甲低的新生儿筛查方法n n1、酶免疫分析法 (enzymelmmunoassay，EIA)n n2、放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA
3、)n n3、免疫放射法 (immunoradiometricassay，IRMA) 一、先天性甲低的新生儿筛查方法n n4、时间分辨荧光免疫分析法 TRFIA me-resolvedfluorescenceimmunoassayn n5、荧光酶免疫分析法FEIA fluoreseenceenzymeimmunoassayn n6、自动新生儿疾病筛查系统(automatednewbornscreeningsystem) TSH荧光酶免疫分析法FEIAFluorescence enzyme immunoassay 1、原 理 1原理n n荧光酶免疫分析法(FEIA)是一种高度灵敏的检测方法，用FE
4、IA测定血hTSH基于一步夹心法一步夹心法原理，采用固相、双位点固相、双位点荧光酶免疫分析法。n n干血斑中洗涤出的hTSH，同时与包被在酶标板上抗hTSH的单克隆抗体分子和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH亚基的第二抗体结合。 被测TSH抗原被测TSH抗原有两个抗原决定簇 故叫双位点位点位点 TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体包被在反应板上的TSH单克隆抗体故叫固相 HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HRP 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶( (HRP)HRP)标记的标记的抗抗hTSHhTSH亚基（亚基（ 位点）的第二抗体）的第二抗体 TSH单克隆抗体被测TSH抗原TSH单克
5、隆抗体TSH单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HRP被测TSH抗原被测TSH抗原HRPHRPHRP打入血斑（打入血斑（TSHTSH）并加入辣根过氧化物酶）并加入辣根过氧化物酶( (HRP)HRP)标记的抗标记的抗hTSHhTSH亚基的第二抗亚基的第二抗体溶液于已包被体溶液于已包被TSHTSH单克隆抗体的酶标反应孔内。（一步法）单克隆抗体的酶标反应孔内。（一步法）PH：6.5 TSH单克隆抗体被测TSH抗原TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体被测TSH抗原被测T
6、SH抗原HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HRP被测TSH抗原被测TSH抗原HRPHRPHRPHPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HRPHRP 干血斑中洗涤出的干血斑中洗涤出的hTSHhTSH，同时与包被在酶标板上抗同时与包被在酶标板上抗hTSHhTSH的单克隆抗的单克隆抗体分子和辣根过氧化物酶体分子和辣根过氧化物酶( (HRP)HRP)标记的抗标记的抗hTSHhTSH亚基的第二抗体结合。亚基的第二抗体结合。 TSH单克隆抗体被测TS
7、H抗原TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HRPHRPHRP 过量的酶结合物和未结合的过量的酶结合物和未结合的hTSHhTSH被洗涤去掉。被洗涤去掉。 只剩下只剩下TSHTSH同时与包被在酶标板上抗同时与包被在酶标板上抗TSHTSH的单克隆抗体和辣根过氧化的单克隆抗体和辣根过氧化物酶物酶( (HRP)HRP)标记的抗标记的抗TSHTSH亚基的第二抗体结合物。亚基的第二抗体结合物。 被检测被检测TSHTSH抗原被夹在中间，故又称夹心法。抗原被夹在中间，故又称夹心法。 TS
8、H单克隆抗体被测TSH抗原TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH亚基单克隆抗体HRPHRPHRPn n加入荧光底物加入荧光底物3-3-P-P-羟基苯丙酸羟基苯丙酸( (HPPA)HPPA)和双和双氧水进行酶反应。氧水进行酶反应。HPPAHPPAH H2 2O O2 2HPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAH H2 2O O2 2H H2 2O O2 2H H2 2O O2 2H H
9、2 2O O2 2H H2 2O O2 2H H2 2O O2 2H H2 2O O2 2H H2 2O O2 2H H2 2O O2 2PH：7.8 2HPPA+H2O2 DPDPA+2H2O无荧光无荧光3-3-P-P-羟基羟基苯丙酸苯丙酸HRPH2O22HPPADPDPA2H2O荧光物质荧光物质作用1小时 原理n n以甘氨酸缓冲液终止酶反应。DPDPA甘氨酸甘氨酸缓冲液缓冲液DPDPAPH：10.3 原理n n用荧光读数仪以320nm为激发光，405nm为发射光测定荧光值。由于荧光强度与酶标反应板上结合的hTSH数量成正比，因此，通过已知浓度的标准血斑荧光值和样本的荧光值，也就可换算出样本
10、血斑中hTSH的含量。n n用TSH荧光酶免疫分析法FEIA检测hTSH的灵敏度达0.037mIUL 特点：n n荧光物质为DPDPA，是由HPPA与双氧水在HRP的作用下脱氢结合而成，它吸收特定波长（320nm）的光能后，发生原子重排，同时发射出更长波长（405nm）的光。DPDPA 激发光波长320nm发射射光波长405nm 特点：n n鉴于HPPA（3-P-羟基苯丙酸）敏感性高、动力学范围广，已被广泛用于替代传统EIA显色剂，作为辣根过氧化物酶的底物。以HPPA作底物的FEIA可检测极低和极高浓度，具有明显优势，由于hTSH样本正常值与非正常值之间差异大，故该法特别适用于hTSH检测。
11、特点：n nHPPAH2O2反应生成的荧光强度的影响因素中，最重要的是底物浓度、反应液和终止液的pH值。酶反应最佳pH值为7.8。加入碱性缓冲液终止酶反应，又可显著增强荧光强度。经测定，使用pH10.3、1.5 molL甘氨酸缓冲液可获得最大荧光强度。在低浓度hTSH下，该缓冲液可使荧光强度增加5倍，当hTSH浓度高于80mIUL时，增强作用依次减弱。 特点：n n荧光产物稳定，可放置过夜后测定。无论在室温(2025)或30孵育用FEIA测定hTSH的敏感性无变化；而在37条件下孵育会增加背景荧光，降低灵敏度。建议底物孵育温度为2030。 特点n nFEIA检测法方法先进，重复性高。n n一般
12、情况下，批内分析变异系数和批间分析变异系数均小于10。 特点n n应用FEIA法进行hTSH检测时，其他垂体激素和人绒毛膜促性腺激素(HCG)对实验的干扰极小。 2、仪器和试剂 以下仪器均由芬兰Labsystems公司提供荧荧 光光读数仪读数仪孵孵 育育振荡仪振荡仪自自 动动洗板仪洗板仪3 3 m mm m打孔器打孔器单单 道道加样器加样器八八 道道加样器加样器电电 脑脑显示屏显示屏 (1)、仪器：n n、荧光读数仪；、孵育振荡仪；、自动洗板仪；、3mm打孔器，或打孔钳；、加样器；八道加样器。以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。、3mm实验血片塑料支架；、电脑、打印机；、冰箱。 材料
13、n n、新生儿筛查滤纸干血斑标本：用S&S903滤纸，按新生儿疾病筛查滤纸干血斑标本采集方法采集； 试剂芬兰LabsystemshTSH-FEIA试剂盒，包含如下物品抗抗hTSHhTSH包被的酶标板（包被的酶标板（1 1）抗hTSHHRP酶结合物（2）酶结合物稀释液（3）HPPA荧光底物（4a）H2O2溶液（4b）终止液（5）洗涤液（6） 试剂n n、抗、抗hTSHhTSH包被的酶标板（包被的酶标板（1 1）：抗）：抗hTSHhTSH抗体抗体IgG(IgG(小鼠单克隆抗体小鼠单克隆抗体) )包被的酶标板，浓度包被的酶标板，浓度1.0g/m11.0g/m1。所有包被酶标板均置于有干燥剂。所有包被
14、酶标板均置于有干燥剂的锡箔密封袋中以防止潮湿。潮湿将破坏酶标的锡箔密封袋中以防止潮湿。潮湿将破坏酶标板的包被，严重缩短试剂盒保存期。试剂盒通板的包被，严重缩短试剂盒保存期。试剂盒通常储存在常储存在2828，为防止打开锡箔密封袋时水，为防止打开锡箔密封袋时水蒸气凝结破坏酶标板性能，试剂盒使用前需置蒸气凝结破坏酶标板性能，试剂盒使用前需置室温半小时后再打开。若锡箔密封袋在使用前室温半小时后再打开。若锡箔密封袋在使用前受损或干燥剂变色，请勿使用；受损或干燥剂变色，请勿使用； n n、抗hTSHHRP酶结合物（2） ：辣根过氧化物酶标记的抗hTSH(小鼠单克隆抗体浓度50ngIgGm1)抗体，加02的
15、KathonCGe作为防腐剂；试剂 n n、酶结合物稀释液（3） ：缓冲盐溶液，pH6.5，加0.2的KathonCG作为防腐剂。用于酶结合物的稀释；试剂 n n、HPPA荧光底物（4a） ：3P羟基苯丙酸溶于Tris缓冲液(pH7.8)中，加0.2的KathonCGe作为防腐剂；试剂 n n、H2O2溶液（4b） ：柠檬酸醋酸缓冲液，pH6.0，含过氧化氢。避免与氧化还原剂接触；试剂 n n、终止液：甘氨酸缓冲液（5） ，pH10.3；试剂 n n、洗涤液（6） ：含有吐温20的磷酸盐缓冲液，加入0.05Bronidox作为防腐剂。按1:9比例加入蒸馏水稀释。由于储于4可能形成结晶，稀释前温
16、度需达1830；试剂 n n、hTSH标准品（7） ：TSH存在于干血滤纸片的血斑中，包括一个零空白。存于装有干燥剂的铝箔袋中。加入0.05Bronidox作为防腐剂。标准品由红细胞压积为50一55的人血液制得，所含的hTSH浓度经过WHO2nd IRP(80558)校正；试剂 n n、质控物（、质控物（8 8） ：hTSHhTSH存存在于滤纸上的干血滤纸血斑在于滤纸上的干血滤纸血斑中。加入中。加入0 00505BronidoxBronidox作作为防腐剂。为防腐剂。1 1张滤纸中具有张滤纸中具有5 5套套2 2种浓度质控物种浓度质控物( (品品) )，存于，存于装有干燥剂的铝箔袋中。装有干燥
17、剂的铝箔袋中。n n标准品和质控物标准品和质控物( (品品) )的的TSHTSH浓浓度有批号差异，需参照每一度有批号差异，需参照每一试剂盒中的标准品和质控物试剂盒中的标准品和质控物( (品品) )的记录单。的记录单。试剂n n全血样品中全血样品中TSHTSH含量与血清样品中含量与血清样品中TSHTSH含量的转化公式含量的转化公式 n nTSHmIUTSHmIUL L血清血清TSHmIUTSHmIUL L全血全血 lOOlOO(100HCR)(100HCR) 试剂盒内的TSH标准品和质控物的浓度标准血片标准血片TSHTSH浓度浓度（mIU/LmIU/L）质控物质控物TSHTSH浓度浓度（mIU/
18、LmIU/L）A A1.01.0C1C12 2B B7.57.5C2C22020C C15.015.0D D4040E E6060F F100100 3、实验操作 实验操作步骤n n(1)用编码机给每一张血片按次序盖上卡片号，此卡片号也就是我们的检验编号。n n在检验前，所有的试剂和酶标反应板应放置室温平衡30分钟。 实验操作步骤n n(2)做好实验登记，包括检测日期、检测区间、复查样本号等。n n编写好实验操作卡；把本次实验要做的标准、质控、复查标本、重查标本及常规标本的卡片号在电脑中用不同的颜色的字打印出来，看上去一目了然，严防打孔时张冠李戴。 第一板第一板1 12 23 34 45 56
19、 67 78 89 91010 1111 1212A AA AE E3333333333900019000190009900099001790017900259002590033900339004190041900499004990057900579006590065B BA AE E3333333333C CB BF F6666666666D DB BF F6666666666E EC CC1C18888888888F FC CC1C18888988889G GD DC2C28999389993H HD DC2C289998899989007290072试剂批号：试剂批号：163ZC1 标准
20、浓度：标准浓度：1、9、20、44、66、87。质控批号：质控批号：163ZC1 范范 围：围：高值：高值：14-37，中值，中值26。低值：低值：0-5，中值，中值3.0。佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目检测项目检测项目检测项目: : TSHTSH 检测时间检测时间检测时间检测时间: 2003: 2003年年年年1111月月月月1111日日日日 操作者：操作者：操作者：操作者： 实验操作步骤n n（3 3）对照操作卡在滤纸血斑上）对照操作卡在滤纸血斑上打下直径打下直径3mm3mm
21、的标准品的标准品( (双孔双孔) )、质控物质控物( (品品)( )(双孔双孔) )和标本，并依次和标本，并依次放置到抗放置到抗hTSHhTSH包被的酶标板孔包被的酶标板孔内。注意：为避免层析效应，应内。注意：为避免层析效应，应围绕血样点中央对称地打孔。围绕血样点中央对称地打孔。 血斑打孔的位置打孔时要选择合格的血斑，同时要选择合适的地方，两面都要看一下。由于层析效应中心位比周边位的浓度要高10%左右。正确太靠边太中心 实验操作步骤n n(4)加入200l抗hTSHHRP酶结合物。然后用胶膜覆盖密封。n n配制抗hTSHHRP酶结合物溶液：一个酶标反应板需配量，200l酶结合物（2号溶液）加2
22、0ml酶结合物稀释液（3号溶液）。 实验操作步骤n n(5)选择以下步骤进行孵育：过程A：室温(1830)振荡孵育3小时，振荡速率650转分。过程B：室温(1830)振荡15分钟，4过夜孵育。备注：室温超过30，最好选择过程B孵育，以避免高本底干扰。 实验操作步骤n n(6)(6)洗板洗板n n手工洗涤：去掉溶液和滤纸片，手工洗涤：去掉溶液和滤纸片， 每孔加入每孔加入300l300l的洗涤液，倒去孔内液体并拍打，使孔内的洗涤液，倒去孔内液体并拍打，使孔内无残液，重复操作无残液，重复操作4 4次，倒置于纸巾上；次，倒置于纸巾上；n n洗板仪洗涤：洗涤液每孔洗板仪洗涤：洗涤液每孔400l400l，
23、先洗涤一次，先洗涤一次，甩掉溶液和滤纸片，再重复洗涤甩掉溶液和滤纸片，再重复洗涤4 4次。次。n n使用电动打孔去纸片系统可简化实验操作。使用电动打孔去纸片系统可简化实验操作。如如LabsystemsLabsystems公司的电动打孔器可将样品固定公司的电动打孔器可将样品固定在一次性塑料支架上，将带有样品纸片的支架在一次性塑料支架上，将带有样品纸片的支架插入酶标板反应孔内进行反应。孵育结束后，插入酶标板反应孔内进行反应。孵育结束后，样品纸片和支架一同去除。样品纸片和支架一同去除。 实验操作步骤n n(7)(7)每孔加入每孔加入200l200l底物溶液。底物溶液的配制：底物溶液。底物溶液的配制：
24、每个每个3 3酶标反应板配酶标反应板配60ml60ml，即，即50mlHPPA50mlHPPA溶液溶液（4a4a溶液）加溶液）加10ml10ml双氧水溶液（双氧水溶液（4b4b溶液）。溶液）。n n(8)(8)室温室温18301830振荡孵育振荡孵育l l小时。小时。n n(9)(9)每孔加入每孔加入100l100l终止液，即甘氨酸缓冲液（终止液，即甘氨酸缓冲液（5 5号溶液）号溶液） 。n n(10)(10)在在6060分钟内，用荧光读数仪测定各孔的荧分钟内，用荧光读数仪测定各孔的荧光值。光值。 实验操作步骤打孔洗板加酶标液加底物液加终止液检测 4、结果计算 结果计算n n测量结束后，可利用
25、电脑工作软进行自动处理绘制标准曲线，推荐使用线性坐标，选择光滑曲线。也可使用手工计算。从标准曲线上读取质控物和标本的TSH浓度。在试剂盒中均应有质控物(品)和其期望值，只有当质控物(品)测定值在其范围内，该次实验才能视为合格。 结果计算n n发出实验报告。n n做好结果的登记。n n保存好结果的原始资料。 5注意事项 注意事项n n(1)(1)所用试剂需正确储存，不恰当的保存方式可所用试剂需正确储存，不恰当的保存方式可能造成荧光背景增加，标准曲线斜率降低，进能造成荧光背景增加，标准曲线斜率降低，进而影响实验精确度。试剂一般储存在而影响实验精确度。试剂一般储存在2828。 n n(2)(2)勿使
26、用过期试剂。勿使用过期试剂。n n(3)(3)不同批次试剂不可混合或互换。不同批次试剂不可混合或互换。n n(4)(4)开始检测前，把试剂盒内所用的试剂和酶标开始检测前，把试剂盒内所用的试剂和酶标板放置室温平衡板放置室温平衡3030分钟。分钟。n n(5)(5)建议每块酶标板都使用标准品和质控物建议每块酶标板都使用标准品和质控物( (品品) )，并作双孔。，并作双孔。n n(6)(6)勿互换试剂瓶盖。勿互换试剂瓶盖。 注意事项n n(7)(7)从试剂瓶中转移液体时，使用无菌的移液管从试剂瓶中转移液体时，使用无菌的移液管以避免污染，否则由于试剂污染可能产生不正以避免污染，否则由于试剂污染可能产生
27、不正确的结果。确的结果。n n(8)(8)检测一旦开始，随后的步骤应连续地进行下检测一旦开始，随后的步骤应连续地进行下去，不要中断。去，不要中断。n n(9)(9)加样时勿接触孔壁，以避免孔间交叉污染。加样时勿接触孔壁，以避免孔间交叉污染。(10)(10)孵育时间的轻微变化是允许的，首次孵育孵育时间的轻微变化是允许的，首次孵育和二次孵育许可时间分别为：和二次孵育许可时间分别为：3 3小时土小时土1010分钟分钟和和1 1小时土小时土5 5分钟。分钟。n n(11)(11)使用过夜孵育过程，实验结果可获得较高使用过夜孵育过程，实验结果可获得较高的重复性。的重复性。n n(12)(12)空气的洁净度可能影响实验结果。空气的洁净度可能影响实验结果。 谢谢！
