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1、本章内容本章内容l4.1 常用实验动物选择和处理常用实验动物选择和处理l 常用实验动物特征常用实验动物特征l4.1.2 实验动物的选择和处理实验动物的选择和处理l 实验动物的染毒和处置实验动物的染毒和处置l4.2 食品毒理学试验的设计原则食品毒理学试验的设计原则l4.2.1 体外试验涉及体外试验涉及l 体内毒理学试验涉及体内毒理学试验涉及l4.3 毒理学试验结果处理和分析毒理学试验结果处理和分析l 毒理学试验的数据处理和统计方法毒理学试验的数据处理和统计方法l 统计学意义和生物学意义统计学意义和生物学意义本章学习目的与要求本章学习目的与要求l掌握实验动物的掌握实验动物的选择原则和方法选择原则和
2、方法；l熟悉实验动物的熟悉实验动物的常规处置常规处置、染毒方式染毒方式、采样采样和和处死方法处死方法；l了解常用实验动物外貌、生活习性、生长发育了解常用实验动物外貌、生活习性、生长发育和解剖生理特征。和解剖生理特征。l掌握食品毒理学掌握食品毒理学实验设计基本原则实验设计基本原则；l熟悉毒理学熟悉毒理学试验结果处理和分析方法试验结果处理和分析方法。4.1 常用实验动物选择和处理常用实验动物选择和处理l 常用实验动物特征常用实验动物特征l实验动物实验动物(laboratory animals)：经人工饲育，对：经人工饲育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来其携带的微生物实行控制，遗传背景
3、明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检验以源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检验以及其他科学实验的动物。或者简单说及其他科学实验的动物。或者简单说以科学研究以科学研究为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物。 l实验动物种类实验动物种类：常用的实验动物物种为：常用的实验动物物种为大鼠大鼠、小小鼠鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的实验动物有、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的实验动物有地鼠、猕猴、小型猪、鸡、青蛙等。地鼠、猕猴、小型猪、鸡、青蛙等。实验动物特点：实验动物特点：具有较小的个体差异，较强敏感性，较好的具有较小的个体差异，较强敏感性，较好
4、的重复性与较一致的反应性。重复性与较一致的反应性。一些遗传背景不清楚，携带病原微生物不明一些遗传背景不清楚，携带病原微生物不明确，健康状况及个体差异较大，反应性不一致，确，健康状况及个体差异较大，反应性不一致，一般不作为实验动物，其所取得的数据不被科一般不作为实验动物，其所取得的数据不被科学界所公认。学界所公认。4.1.1 常用实验动物特征常用实验动物特征常用实验动物生物学和生理学参数表常用实验动物生物学和生理学参数表参参参参 数数数数小小小小 鼠鼠鼠鼠大大大大 鼠鼠鼠鼠豚豚豚豚 鼠鼠鼠鼠兔兔兔兔成体体重成体体重成体体重成体体重(kg)(kg)0.0350.0350.450.450.430.4
5、33.73.7平均寿命平均寿命平均寿命平均寿命( ( ( (年年年年) ) ) )1.51.53 345458 8水消耗水消耗水消耗水消耗(ml/d)(ml/d)6 63535145145300300饲料消耗饲料消耗饲料消耗饲料消耗 ( ( ( (成本成本成本成本g/d)g/d)5 510101212180180成体代谢成体代谢成体代谢成体代谢(cal/kg.d)(cal/kg.d)600600130130100100110110体温体温体温体温()()37.437.438.238.238.638.639.439.4呼吸频率呼吸频率呼吸频率呼吸频率( ( ( (次次次次/min)/min)16
6、0 (80160 (80- -240)240)85 (6585 (65- -110)110)90 (7090 (70- -100)100)53 (4053 (40- -65)65)心率心率心率心率( ( ( (次次次次/min)/min)600600328328300300200200血压血压血压血压mmHgmmHg( ( ( (收缩收缩收缩收缩/ / / /舒张舒张舒张舒张) ) ) )120120/ /7575130/90130/9077/5077/50110110/ /8080出生体重出生体重出生体重出生体重(g) (g) 1.51.556567510075100100100断乳时体重断
7、乳时体重断乳时体重断乳时体重(g)(g) 1010- -12124040- -5050250250100100- -15001500 常用实验动物特征常用实验动物特征常用实验动物生物学和生理学参数表（续）常用实验动物生物学和生理学参数表（续）参参参参 数数数数小小 鼠鼠大大 鼠鼠豚豚 鼠鼠兔兔开眼开眼开眼开眼(d)(d)111110101212出生当天出生当天出生当天出生当天1010妊娠妊娠妊娠妊娠(d)(d)2020212167673131性周期性周期性周期性周期(d)(d)4 45 54 45 51616191915151616动情期动情期动情期动情期(d)(d)1 11 11 13030
8、窝数量窝数量窝数量窝数量1 112126 69 91 15 51 11313断乳年龄断乳年龄断乳年龄断乳年龄( ( ( (周周周周) ) ) )3 33 34 42 28 8生殖年龄生殖年龄生殖年龄生殖年龄( ( ( (月月月月) ) ) )2 22 23 33 36 67 7生殖期生殖期生殖期生殖期( ( ( (年年年年) ) ) )1 11 13 31 13 3生殖季节生殖季节生殖季节生殖季节任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间环境温度环境温度环境温度环境温度()()1919252519192525
9、1919252518182828血容量血容量血容量血容量( ML/Kg)( ML/Kg)8080656575755353凝血时间凝血时间凝血时间凝血时间(s)(s)141460606060300300HCT(HCT(红细胞红细胞红细胞红细胞) ) ) )4141464642424242Hb(gHb(gbl)bl)16.016.014.814.812.412.413.613.64.1.2 实验动物的选择和处理实验动物的选择和处理4.1.2.1 实验动物的选择实验动物的选择l毒理学的动物实验是以实验动物作为研究对象，为获得毒理学的动物实验是以实验动物作为研究对象，为获得可靠的研究结果，可靠的研究结
10、果，先决条件先决条件是正确地选用实验动物。是正确地选用实验动物。 l实验动物选择实验动物选择原因原因：l外源化学物的固有毒性往往在人和不同物种实验动物外源化学物的固有毒性往往在人和不同物种实验动物之间表现不同，之间表现不同，物种差别物种差别可以表现在可以表现在量方面量方面，引起毒，引起毒性的剂量差别，即毒性大小的差别，如有报道，人对性的剂量差别，即毒性大小的差别，如有报道，人对138种化学物的敏感性为大鼠的倍。种化学物的敏感性为大鼠的倍。l物种差别也可以表现在物种差别也可以表现在质方面质方面( (毒性效应的差别毒性效应的差别) )，如，如除草剂百草枯除草剂百草枯对人引起肺损伤，而对狗则未见到。
11、对人引起肺损伤，而对狗则未见到。 4.1.2.1 实验动物的选择实验动物的选择选择原则选择原则l相似性原则相似性原则：选择结构、功能、代谢、群体分布、疾：选择结构、功能、代谢、群体分布、疾病状态方面与人类相似的物种。病状态方面与人类相似的物种。l差异性原则差异性原则：研究过程要求以差异为指标或特殊条件：研究过程要求以差异为指标或特殊条件时，选用不同种系实验动物的某些特殊反应，更适合时，选用不同种系实验动物的某些特殊反应，更适合于不同研究目的的要求。于不同研究目的的要求。例如人类利用不同种属动物例如人类利用不同种属动物对病原微生物的易感性差异来生产弱毒疫苗对病原微生物的易感性差异来生产弱毒疫苗。
12、l易化性原则易化性原则：进化程度高、结构功能复杂的动物有时：进化程度高、结构功能复杂的动物有时会给实验条件控制或实验结果分析带来困难，则应从会给实验条件控制或实验结果分析带来困难，则应从易化角度入手，选择既能满足实验要求，结构功能又易化角度入手，选择既能满足实验要求，结构功能又简单，便于实验分析的动物。如反射弧的研究选择简单，便于实验分析的动物。如反射弧的研究选择两两栖动物栖动物；遗传学研究选择；遗传学研究选择果蝇果蝇。4.1.2.1 实验动物的选择实验动物的选择选择原则选择原则l相容或相匹配原则相容或相匹配原则：设计动物实验时，选用的动物：设计动物实验时，选用的动物质量等级要与实验设计、实验
13、条件、实验者技术、质量等级要与实验设计、实验条件、实验者技术、方法、试剂性能相匹配。方法、试剂性能相匹配。l可获得性原则可获得性原则：在不影响实验质量的前提下，选择：在不影响实验质量的前提下，选择最易获得、最经济、易饲养管理的动物。最易获得、最经济、易饲养管理的动物。l重复性和均一性原则重复性和均一性原则：选用标准化的实验动物。杜：选用标准化的实验动物。杜绝使用随意交配而来的杂种动物和未经任何微生物绝使用随意交配而来的杂种动物和未经任何微生物控制的非标准化动物。控制的非标准化动物。 实验动物的选择实验动物的选择选择方法选择方法l物种选择物种选择l物种选择的物种选择的基本原则基本原则l选择对受试
14、物在代谢、生物化学和毒理学特征与人选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种；最接近的物种；l自然寿命不太长的物种；自然寿命不太长的物种；l易于饲养和实验操作的物种；易于饲养和实验操作的物种；l经济并易于获得的物种。经济并易于获得的物种。l目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是啮齿类啮齿类，另一种是，另一种是非啮齿类非啮齿类。 实验动物的选择实验动物的选择选择方法选择方法l系统毒性研究最常用的啮齿类是系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠大鼠和小鼠，非啮，非啮齿类是狗；齿类是狗；l豚鼠豚鼠常用于皮肤刺激试验和常用于皮肤刺激试验和致
15、敏致敏试验；试验；l兔兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验；常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验；l遗传毒理学试验多用遗传毒理学试验多用小鼠小鼠；l致癌试验常用大鼠和小鼠；致癌试验常用大鼠和小鼠；l致畸试验常用大鼠、小鼠和兔；致畸试验常用大鼠、小鼠和兔；l迟发性神经毒性试验常用迟发性神经毒性试验常用母鸡母鸡。 l品系选择品系选择l品系品系是实验动物学的专用名词，指用计划交配的方是实验动物学的专用名词，指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。法，获得起源于共同祖先的一群动物。 l实验动物按遗传学控制分类可分为：实验动物按遗传学控制分类可分为：l近交系近交系：指同胞兄妹或亲子之间连续交配：指同胞兄
16、妹或亲子之间连续交配20代以上代以上而培而培育的纯品系动物。群体基因才能达到纯合和基本稳定。育的纯品系动物。群体基因才能达到纯合和基本稳定。l杂交群动物杂交群动物( (杂交杂交1代代) )，指两个不同的近交系之间有目的，指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。进行交配，所产生的第一代动物。l封闭群封闭群：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。 l根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次
17、之、封闭群较低。交群次之、封闭群较低。4.1.2.1 实验动物的选择实验动物的选择选择方法选择方法 实验动物的选择实验动物的选择选择方法选择方法l实验动物微生物控制的选择实验动物微生物控制的选择 对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用级级( (或或级以上级以上) )的动物，以保证实验结果的可靠性。的动物，以保证实验结果的可靠性。级级 别别 要要 求求 I 级级普通动物，应没有传染给人的疾病普通动物，应没有传染给人的疾病 级级清洁动物，除清洁动物，除I I级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病 级级无特定病原体动物无特定
18、病原体动物( (SPF) )，除，除级标准外，动物为剖腹产或子宫级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌丛，没有致病病原体致病细菌丛，没有致病病原体 IV 级级无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫有任何微生物和寄生虫( (包括绝大部分病毒包括绝大部分病毒) ) 实验动物的选择实验动物的选择选择方法选择方法 实验动物对外来化学物的毒性反应还存在个体差异，应注实验动物对外来化学物的毒性反应还存在个
19、体差异，应注意实验动物的个体选择。重点是动物的意实验动物的个体选择。重点是动物的性别、年龄、体重、性别、年龄、体重、生理状态和健康状况生理状态和健康状况。l对于初次试验的受试物，应该采用两种性别。对于初次试验的受试物，应该采用两种性别。l毒理学试验选用实验动物的年龄取决于试验的类型。毒理学试验选用实验动物的年龄取决于试验的类型。l急性试验一般选用成年动物；急性试验一般选用成年动物；l慢性试验因实验周期长，应选用较年幼的或初断乳的动慢性试验因实验周期长，应选用较年幼的或初断乳的动物，以使实验周期能复盖成年期。物，以使实验周期能复盖成年期。l实际工作中常以动物的体重粗略地判断动物的年龄。实际工作中
20、常以动物的体重粗略地判断动物的年龄。l性激素对外源化学物代谢转化有影响，故应选用未产未孕性激素对外源化学物代谢转化有影响，故应选用未产未孕的雌性动物。但在某些试验如显性致死试验、致畸试验及的雌性动物。但在某些试验如显性致死试验、致畸试验及繁殖试验等，则需有计划地合笼交配。繁殖试验等，则需有计划地合笼交配。 l为确保选择健康动物，一般在实验前观察为确保选择健康动物，一般在实验前观察5-7天。天。 实验动物的选择实验动物的选择选择方法选择方法大、小鼠大、小鼠根据形态根据形态鉴定日龄鉴定日龄（大、小（大、小情况基本情况基本一样）一样） 实验动物的处理实验动物的处理l1.健康检疫健康检疫l实验动物在购
21、进之后，应雌雄分开饲养。一般应进行实验动物在购进之后，应雌雄分开饲养。一般应进行5-7天天的检疫，在此期间应多次观察动物，及时剔除不健康的动的检疫，在此期间应多次观察动物，及时剔除不健康的动物。物。 l2.实验动物的抓取和固定方法实验动物的抓取和固定方法l3.性别鉴定性别鉴定l4.实验动物的编号和标记方法实验动物的编号和标记方法l实验动物的标记方法对啮齿动物常用染色法，可用苦味酸实验动物的标记方法对啮齿动物常用染色法，可用苦味酸( (黄色黄色) )、品红、品红( (红色红色) )的酒精饱和溶液在动物被毛上染色。的酒精饱和溶液在动物被毛上染色。l对啮齿动物还可用剪耳法标记。对啮齿动物还可用剪耳法
22、标记。l对狗等大动物一般用挂牌法。对狗等大动物一般用挂牌法。 l5.实验动物被毛去除方法实验动物被毛去除方法l剪毛、拔毛、剃毛、脱毛（如硫化钠或硫化钡）剪毛、拔毛、剃毛、脱毛（如硫化钠或硫化钡）l6.实验动物的麻醉实验动物的麻醉实验动物的处理实验动物的处理 2. 实验动物的抓取和固定方法实验动物的抓取和固定方法小鼠小鼠用右手提起小鼠尾部，放在实验用右手提起小鼠尾部，放在实验台上，当其向前爬行时，左手抓台上，当其向前爬行时，左手抓住两耳及头颈部皮肤，再置小鼠住两耳及头颈部皮肤，再置小鼠于左手心，拉直四肢并用手指夹于左手心，拉直四肢并用手指夹住肢体固定。右手可行注射或其住肢体固定。右手可行注射或其
23、它操作。它操作。大鼠大鼠右手轻轻抓住大鼠尾部向后轻拉，左手右手轻轻抓住大鼠尾部向后轻拉，左手抓紧鼠两耳及头颈部皮肤，并将其固定抓紧鼠两耳及头颈部皮肤，并将其固定在左手中，右手可行注射或其它操作。在左手中，右手可行注射或其它操作。实验动物的处理实验动物的处理 2. 实验动物的抓取和固定方法实验动物的抓取和固定方法兔兔1 1、可伤两肾；、可伤两肾；2 2、可造成皮下出血；、可造成皮下出血；3 3、可伤两耳；、可伤两耳；4 4、颈部皮肤厚可抓；、颈部皮肤厚可抓；5 5、用手拖住身体。用手拖住身体。4 4和和5 5为正确的方法。为正确的方法。豚鼠豚鼠先用手掌以稳准的手法迅速扣住豚鼠背先用手掌以稳准的手
24、法迅速扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，将手张开，用手部，抓住其肩胛上方，将手张开，用手指握住颈部，或握住身体的四周，再拿指握住颈部，或握住身体的四周，再拿起来。怀孕或体重较大的豚鼠，应以另起来。怀孕或体重较大的豚鼠，应以另手托其臀部。手托其臀部。4.1.2.2 实验动物的处理实验动物的处理 4. 实验动物的编号和标记方法实验动物的编号和标记方法染染色色法法实验动物的处理实验动物的处理 4. 实验动物的编号和标记方法实验动物的编号和标记方法耳朵标记方法耳朵标记方法实验动物的染毒和处置实验动物的染毒和处置l4.1.3.1 实验动物染毒实验动物染毒l毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能毒理学试验中染毒
25、途径的选择，应尽可能模拟人模拟人在在接触该受试物的方式。接触该受试物的方式。l最常用的染毒途径为经最常用的染毒途径为经口口、经、经呼吸道呼吸道、经、经皮皮及及注射注射途径。途径。l不同途径的吸收速率，一般是：静脉注射吸入不同途径的吸收速率，一般是：静脉注射吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射其他途径其他途径( (如经皮等如经皮等) )。实验动物染毒实验动物染毒1. 经口经口( (胃肠道胃肠道) )染毒染毒l常用有常用有喂饲喂饲、灌胃灌胃和和吞咽胶囊吞咽胶囊等方式。等方式。 (1) 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水
26、中供实验动物自行摄入。物自行摄入。l优点：简单易行，符合人类接触受试物的实际情况。优点：简单易行，符合人类接触受试物的实际情况。l缺点：如适口性差的受试物，动物拒食，摄入量达不缺点：如适口性差的受试物，动物拒食，摄入量达不到设计剂量；易挥发或易水解的受试物不适用。到设计剂量；易挥发或易水解的受试物不适用。l实验动物应单笼喂饲，以食物消耗量计算其实际染毒实验动物应单笼喂饲，以食物消耗量计算其实际染毒剂量。剂量。 4.1.3.1 实验动物染毒实验动物染毒经口经口( (胃肠道胃肠道) )染毒染毒(2) 灌胃灌胃：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃
27、内。导管注入胃内。l大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小时小时( (因小鼠消化吸收和代谢因小鼠消化吸收和代谢速度较快速度较快) )，均不停饮水。灌胃后，均不停饮水。灌胃后24小时提供饲料。小时提供饲料。l经口多次染毒，一般不禁食，但应每日定时染毒。经口多次染毒，一般不禁食，但应每日定时染毒。l灌胃法优点是剂量准确，缺点是工作量大，并有伤及食道灌胃法优点是剂量准确，缺点是工作量大，并有伤及食道或误入气管的可能。或误入气管的可能。 (3) 吞咽胶囊吞咽胶囊：将一定剂量的受试物装入胶囊中，放至：将一定剂量的受试物装入胶囊中，放至动物的舌后部，迫使动物咽下，此法剂量准确，适动物的舌后部
28、，迫使动物咽下，此法剂量准确，适用于易挥发、易水解和有异味的受试物。缺点是动用于易挥发、易水解和有异味的受试物。缺点是动物有咬伤人的危险。物有咬伤人的危险。4.1.3.1 实验动物染毒实验动物染毒2. 经呼吸道染毒经呼吸道染毒经呼吸道染毒可分为吸入经呼吸道染毒可分为吸入染毒染毒和和气管内注入气管内注入。 (1) 静式吸入染毒：将一定数量的啮齿类动物放在密静式吸入染毒：将一定数量的啮齿类动物放在密闭的染毒柜中，加入易挥发的液态受试物或气态受闭的染毒柜中，加入易挥发的液态受试物或气态受试物使成一定浓度。试物使成一定浓度。l染毒简易；染毒简易；l但缺点较多，主要是随试验进行氧分压降低但缺点较多，主要
29、是随试验进行氧分压降低( (因此，实验因此，实验动物数量有限制动物数量有限制) )，柜内受试物浓度也逐渐下降，柜内受试物浓度也逐渐下降( (由于动物由于动物吸入消耗、为被毛及染毒柜壁吸附所致吸入消耗、为被毛及染毒柜壁吸附所致) )，而且实验动物，而且实验动物有经皮吸收的可能。有经皮吸收的可能。4.1.3.1 实验动物染毒实验动物染毒经呼吸道染毒经呼吸道染毒(2) 动式吸入染毒：由染毒柜、机械通风系统和配气动式吸入染毒：由染毒柜、机械通风系统和配气系统三部分构成。系统三部分构成。l优点是在染毒过程中染毒柜内氧分压及受试物浓度较优点是在染毒过程中染毒柜内氧分压及受试物浓度较稳定；稳定；l缺点是消耗
30、受试物的量大，并易于污染环境。缺点是消耗受试物的量大，并易于污染环境。l动式吸入染毒又分为整体接触和口鼻接触两种。动式吸入染毒又分为整体接触和口鼻接触两种。l动式吸入染毒柜中受试物的浓度应实际监测。动式吸入染毒柜中受试物的浓度应实际监测。(3) 气管内注入：实验动物在麻醉后，将受试物注入气管内注入：实验动物在麻醉后，将受试物注入气管，使之分布至两肺。此法用于建立急性中毒模气管，使之分布至两肺。此法用于建立急性中毒模型及尘肺研究。型及尘肺研究。实验动物染毒实验动物染毒3. 经皮肤染毒经皮肤染毒l将受试动物皮肤表面涂抹一定量的受试物，再用纱将受试动物皮肤表面涂抹一定量的受试物，再用纱布和塑料薄膜盖
31、上，用胶布固定，接触规定的时间。布和塑料薄膜盖上，用胶布固定，接触规定的时间。l经皮肤染毒的目的有两种：经皮肤染毒的目的有两种： 一种是一种是经皮染毒毒性试验经皮染毒毒性试验，如经，如经皮皮LD50测定常用大测定常用大鼠，鼠，皮肤致癌试验常用小鼠皮肤致癌试验常用小鼠。 另一种是另一种是皮肤刺激和致敏试验皮肤刺激和致敏试验，皮肤刺激试验常用，皮肤刺激试验常用兔和豚鼠，皮肤致敏试验用豚鼠。兔和豚鼠，皮肤致敏试验用豚鼠。 实验动物染毒实验动物染毒4. 注射染毒注射染毒l分为皮内注射、皮下注射、腹腔注射、肌内注射和静脉分为皮内注射、皮下注射、腹腔注射、肌内注射和静脉注射。对注射。对大小鼠可用静脉注射大
32、小鼠可用静脉注射，非啮齿类可模拟临床用，非啮齿类可模拟临床用药途径，如狗可用后肢隐静脉注射，而啮齿类的尾静脉药途径，如狗可用后肢隐静脉注射，而啮齿类的尾静脉和肌肉注射难以多次染毒，必要时可改为和肌肉注射难以多次染毒，必要时可改为皮下注射皮下注射。l静脉注射应控制速度，大鼠尾静脉注射最好控制在静脉注射应控制速度，大鼠尾静脉注射最好控制在10秒秒以上。以上。l注射染毒应调整受试物的注射染毒应调整受试物的pH及渗透压，及渗透压，pH应应5-8，最好，最好是等渗溶液，是等渗溶液，动物对高渗的耐受力比低渗强动物对高渗的耐受力比低渗强。l腹腔注射腹腔注射在遗传毒理学实验中有时也用，但在致畸试验、在遗传毒理
33、学实验中有时也用，但在致畸试验、肝肝UDS研究不应该用腹腔注射，以避免可能的损伤和局研究不应该用腹腔注射，以避免可能的损伤和局部高浓度对靶器官的影响。部高浓度对靶器官的影响。实验动物处置实验动物处置(1)生物标本采集生物标本采集l在实验过程中常需要对生物样品如在实验过程中常需要对生物样品如血液、尿液、胆血液、尿液、胆汁、粪便汁、粪便等进行检测或检查，它们是反映受试物的等进行检测或检查，它们是反映受试物的生物学效应和物质在体内代谢情况的最重要途径。生物学效应和物质在体内代谢情况的最重要途径。l血液采集血液采集l大小鼠如需血量小可用大小鼠如需血量小可用鼠尾采血鼠尾采血，如需血量较多可，如需血量较多
34、可用用眼眶静脉丛采血眼眶静脉丛采血或处死时或处死时股动脉放血采血股动脉放血采血。l狗可用狗可用后肢隐静脉抽血后肢隐静脉抽血。l不影响动物生理功能的最大取血量为其总血量不影响动物生理功能的最大取血量为其总血量( (50ml/kg体重体重) )的的10。 实验动物处置实验动物处置(1)生物标本采集生物标本采集 l尿液采集尿液采集 l对大小鼠可用对大小鼠可用代谢笼法代谢笼法，下部有粪尿分离器。，下部有粪尿分离器。l对狗可用对狗可用接尿法接尿法或或导尿法导尿法。 l胆汁采集胆汁采集l直接插管至胆总管采集直接插管至胆总管采集l粪便采集粪便采集l对大小鼠可用对大小鼠可用代谢笼法代谢笼法，下部有粪尿分离器，
35、分析，下部有粪尿分离器，分析前剔去表层。前剔去表层。实验动物处置实验动物处置(2) 安死术及其操作方法安死术及其操作方法l安死术是指用公众认可的、以人道主义的方法处死动物安死术是指用公众认可的、以人道主义的方法处死动物的过程，即达到没有惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死的过程，即达到没有惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死亡。安死方法最重要的标准是应具有保证动物中枢神经亡。安死方法最重要的标准是应具有保证动物中枢神经系统立即大道失去痛觉的早期抑制作用。应尽量采用适系统立即大道失去痛觉的早期抑制作用。应尽量采用适当的处死方法，减少实验动物的痛苦。当的处死方法，减少实验动物的痛苦。 l大小鼠可用颈椎脱臼法（
36、脊髓与脑髓拉断），然后股动大小鼠可用颈椎脱臼法（脊髓与脑髓拉断），然后股动脉放血，动物立即死亡。脉放血，动物立即死亡。l兔、豚鼠、狗等一般用兔、豚鼠、狗等一般用股动脉放血处死股动脉放血处死，或向，或向静脉内注静脉内注射一定量的空气射一定量的空气使之发生严重的血液循环障碍的空气栓使之发生严重的血液循环障碍的空气栓塞法。塞法。l化学药物致死法均适合。化学药物致死法均适合。4.1.3.2 实验动物处置实验动物处置(3) 病理解剖和标本留取病理解剖和标本留取l毒性病理学检查包括大体解剖和组织病理学检查毒性病理学检查包括大体解剖和组织病理学检查两部分。两部分。急性毒性试验中在试验期中死亡或试验急性毒性试
37、验中在试验期中死亡或试验结束处死的动物都应进行尸体解剖结束处死的动物都应进行尸体解剖，因为急性毒，因为急性毒性试验的目的是得到有关可能的性试验的目的是得到有关可能的靶器官信息靶器官信息以及以及进行重复染毒试验剂量设计的信息。进行重复染毒试验剂量设计的信息。4.2 食品毒理学试验的设计原则食品毒理学试验的设计原则l试验设计试验设计(experimental design)是指为试验研究制定出一个通是指为试验研究制定出一个通盘的、周密的、安排合理的、科学性强的设计方案，将试验盘的、周密的、安排合理的、科学性强的设计方案，将试验对象随机分配到两个或多个组中，对试验对象施加某种干预对象随机分配到两个或
38、多个组中，对试验对象施加某种干预或处理因素，观察比较不同处理的效应。或处理因素，观察比较不同处理的效应。l食品毒理学试验包括食品毒理学试验包括体内试验和体外试验两种体内试验和体外试验两种。l体内试验是以实验动物为模型，通过外源化学物对实验动物的毒性反体内试验是以实验动物为模型，通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人（原型）外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。应，向人（原型）外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。l体外试验则主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究。体外试验则主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究。l毒理学实验能否获得预期结果，试验前的试验设计至关重要。毒理学实验能否获
39、得预期结果，试验前的试验设计至关重要。l科研设计遵循的三原则：科研设计遵循的三原则：随机、重复、对照随机、重复、对照。 体外试验设计体外试验设计l1 溶剂溶剂/ /赋形剂赋形剂l所用溶剂所用溶剂/ /赋形剂不应与受试物发生化学反应。推荐使用赋形剂不应与受试物发生化学反应。推荐使用溶剂溶剂/ /赋形剂。赋形剂。l2 受试物受试物l了解受试物各方面性质，测定受试物在试验介质中的溶解了解受试物各方面性质，测定受试物在试验介质中的溶解性。溶解性限度就是出现沉淀的最低浓度。性。溶解性限度就是出现沉淀的最低浓度。l3 受试对象受试对象l4 剂量设置剂量设置l5 代谢活化代谢活化l代谢活化系统的选择和条件依
40、赖于受试物的类别。代谢活化系统的选择和条件依赖于受试物的类别。l6 对照对照l未处理（空白）对照、阳性对照、阴性对照未处理（空白）对照、阳性对照、阴性对照l7 重复重复l由质控良好的实验得到明确的阴性结果和阳性结果，不强由质控良好的实验得到明确的阴性结果和阳性结果，不强调要求重复。可疑结果则应重复实验。调要求重复。可疑结果则应重复实验。 体内毒理学试验设计体内毒理学试验设计l1 实验动物实验动物l动物选择，首选实验动物是其对受试物的代谢过程、动物选择，首选实验动物是其对受试物的代谢过程、生理反应和生化特性基本上与人接近的。生理反应和生化特性基本上与人接近的。l动物数量，各组各组动物数的设计应考
41、虑到统计学动物数量，各组各组动物数的设计应考虑到统计学的要求。的要求。l2 受试物受试物l资料、处置、给予方式资料、处置、给予方式体内毒理学试验设计体内毒理学试验设计l3 对照对照l对照条件对照条件l对照类型对照类型未处理（空白）对照（必要时设）未处理（空白）对照（必要时设）：对照组不施加任何处理：对照组不施加任何处理因素，不给受试物也不给以相应的操作。因素，不给受试物也不给以相应的操作。 l阳性对照（必须设）阳性对照（必须设）：用已知的阳性物：用已知的阳性物( (如致突变物如致突变物) )检测检测试验体系的有效性。如在遗传毒理学试验、致畸试验和致试验体系的有效性。如在遗传毒理学试验、致畸试验
42、和致癌试验中用已知的致突变物、致畸物或致癌物染毒，应该癌试验中用已知的致突变物、致畸物或致癌物染毒，应该得到肯定的阳性结果得到肯定的阳性结果( (即致突变性、致畸性或致癌性即致突变性、致畸性或致癌性) )。 l阴性对照（尽可能设）阴性对照（尽可能设）：不给处理因素但给以必须的实验：不给处理因素但给以必须的实验因素因素( (溶剂赋形剂溶剂赋形剂) )，以排除此实验因素，以排除此实验因素( (溶剂赋形剂溶剂赋形剂) )的影响。没有阴性对照组就不能说明受试物染毒与有害作的影响。没有阴性对照组就不能说明受试物染毒与有害作用之间的关系。用之间的关系。 l历史性对照历史性对照：由本实验室过去多次实验的对照
43、组数据组成。：由本实验室过去多次实验的对照组数据组成。体内毒理学试验设计体内毒理学试验设计l4 剂量分组剂量分组l一般至少要设一般至少要设3个剂量组个剂量组( (即高剂量组、中剂量组、即高剂量组、中剂量组、低剂量组低剂量组) )。l一般要求，一般要求，高剂量组应出现明确的有害作用高剂量组应出现明确的有害作用，或者，或者高剂量组剂量已达到染毒的极限剂量高剂量组剂量已达到染毒的极限剂量( (如大鼠或小鼠如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量灌胃或注射的最大容量) )。l低剂量组应不出现任何可观察到的有害作用低剂量组应不出现任何可观察到的有害作用( (即相当即相当于于NOAEL) )，但低剂量组剂量应当高
44、于人可能的接触，但低剂量组剂量应当高于人可能的接触剂量，至少等于人可能的接触剂量。剂量，至少等于人可能的接触剂量。l中剂量组的剂量介于高剂量组和低剂量组之间中剂量组的剂量介于高剂量组和低剂量组之间，应，应出现轻微的毒性效应出现轻微的毒性效应( (即相当于即相当于LOAEL) )。 l5 观察指标观察指标l指标的有效性、客观性、准确度和精密度、灵敏度、指标的有效性、客观性、准确度和精密度、灵敏度、特异性、选择指标的数目、指标的标准化特异性、选择指标的数目、指标的标准化 体内毒理学试验设计体内毒理学试验设计l6 试验期限试验期限l某些试验某些试验( (如致畸试验和多代生殖试验如致畸试验和多代生殖试
45、验) )的试验期限是由的试验期限是由受试实验动物物种或品系而决定的。而其他毒性试验的受试实验动物物种或品系而决定的。而其他毒性试验的期限在某种程度上由定义所决定。期限在某种程度上由定义所决定。l7 试验设计常用方法试验设计常用方法l完全随机设计完全随机设计l配对设计配对设计l随机区组设计随机区组设计l析因设计析因设计l拉丁方设计拉丁方设计4.3 毒理学实验结果处理和分析毒理学实验结果处理和分析l在评价毒理学试验的结果时，应综合考虑生物在评价毒理学试验的结果时，应综合考虑生物学意义和统计学意义。学意义和统计学意义。统计检验统计检验的假设是关于的假设是关于总体特征的假设，检验方法是以统计量的抽样总
46、体特征的假设，检验方法是以统计量的抽样分布为根据的，得到的结论是概率性的，不是分布为根据的，得到的结论是概率性的，不是绝对的肯定或否定，不等同于有或无生物学意绝对的肯定或否定，不等同于有或无生物学意义。对实验结果作出科学的判断和解释，应该义。对实验结果作出科学的判断和解释，应该根据统计学分析的结果、生物学知识和经验。根据统计学分析的结果、生物学知识和经验。4.3.1 毒理学试验的数据处理和统计方法毒理学试验的数据处理和统计方法4.3.1.1 毒理学研究的数据类型毒理学研究的数据类型l计量资料计量资料l通过对观察单位用定量的办法测量某项指标数量大通过对观察单位用定量的办法测量某项指标数量大小所得
47、到的资料。如动物身长、体重、血红蛋白量、小所得到的资料。如动物身长、体重、血红蛋白量、进食量等。进食量等。l分类资料分类资料l将观察单位按某物种性别或类别分组，然后庆典各将观察单位按某物种性别或类别分组，然后庆典各组的观察单位数目所得到的资料，如实验动物的性组的观察单位数目所得到的资料，如实验动物的性别分雌雄，实验结果分阳性、阴性等别分雌雄，实验结果分阳性、阴性等。毒理学试验的数据处理和统计方法毒理学试验的数据处理和统计方法4.3.1.1 毒理学研究的数据类型毒理学研究的数据类型l等级资料等级资料l将观察单位按某种属性的不同程度分组，统计各组将观察单位按某种属性的不同程度分组，统计各组的观察单
48、位数目所得到的资料。如效果判定为显效、的观察单位数目所得到的资料。如效果判定为显效、有效、无效；程度分轻、中、重；实验室检测结果有效、无效；程度分轻、中、重；实验室检测结果分、分、 、 等。等。l数据类型转换数据类型转换l如将血红蛋白按正常与异常分组，资料便转换为计如将血红蛋白按正常与异常分组，资料便转换为计数资料。数资料。l数据转换数据转换l稳定方差、直线化、使分布正态化或接近正态。稳定方差、直线化、使分布正态化或接近正态。4.3.1 毒理学试验的数据处理和统计方法毒理学试验的数据处理和统计方法4.3.1.2 假设检验的一般考虑假设检验的一般考虑l实验和观察的单位实验和观察的单位l处理组间进
49、行比较的形式处理组间进行比较的形式l假设检验和概率值假设检验和概率值4.3.1.3 数据处理和统计方法数据处理和统计方法l(1) 处理组与阴性对照组比较处理组与阴性对照组比较l(2) 剂量剂量- -效应关系和剂量效应关系和剂量- -反应关系反应关系l(3) IPCS推荐的统计学分析方法推荐的统计学分析方法l(4) 常规毒理学试验资料推荐的统计学方法常规毒理学试验资料推荐的统计学方法 统计学意义和生物学意义统计学意义和生物学意义l在评价毒理学试验结果时，要综合评价实验结果在评价毒理学试验结果时，要综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义。的统计学意义和生物学意义。l一般来说，具有统计学意义是具有
50、生物学意义的一般来说，具有统计学意义是具有生物学意义的必要条件之一。正确地利用统计学假设检验的结必要条件之一。正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。正确地利果有助于确定实验结果的生物学关联。正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。生物学关联。统计学意义和生物学意义统计学意义和生物学意义 处理相关反应的确定处理相关反应的确定l剂量相关趋势剂量相关趋势l反应重现性反应重现性l相关发现相关发现l组间差异的大小与类型组间差异的大小与类型l性别差异性别差异l差异出现的时间性差异出现的时间性4.3.2.2 参考范围参考
51、范围l识别异常的阴性对照值识别异常的阴性对照值l可以更好地理解低发生率的发现可以更好地理解低发生率的发现l可以更好地理解高发生率的发现可以更好地理解高发生率的发现4.3.2 统计学意义和生物学意义统计学意义和生物学意义4.3.2.3 生物学意义（即生物学重要性）的判断生物学意义（即生物学重要性）的判断l在判断生物学意义在判断生物学意义( (即生物学重要性即生物学重要性) )时，可考虑以下步骤。时，可考虑以下步骤。l(1) 纵向比较：此参数的改变有无剂量纵向比较：此参数的改变有无剂量- -反应关系。化学物毒作反应关系。化学物毒作用的剂量用的剂量- -反应关系是毒理学研究的基本假设。当某参数的改变
52、反应关系是毒理学研究的基本假设。当某参数的改变存在阳性剂量存在阳性剂量- -反应关系，就可认为此参数的改变与受试物染毒反应关系，就可认为此参数的改变与受试物染毒有关，具有生物学意义。有关，具有生物学意义。 l(2) 横向比较：此参数的改变是否伴有其他相关参数的改变。如横向比较：此参数的改变是否伴有其他相关参数的改变。如没有骨髓或脾组织学改变或没有高铁血红蛋白生成，则单有红没有骨髓或脾组织学改变或没有高铁血红蛋白生成，则单有红细胞计数的改变是没有生物学意义的。同样，在免疫毒理学中，细胞计数的改变是没有生物学意义的。同样，在免疫毒理学中，单有淋巴细胞计数的改变不伴有淋巴结组织学改变也可能是没单有淋
53、巴细胞计数的改变不伴有淋巴结组织学改变也可能是没有生物学意义的。有生物学意义的。l(3) 与历史性对照比较：目前尚无公认的实验动物参考与历史性对照比较：目前尚无公认的实验动物参考“正常正常”值，应由本实验室利用相同品系的实验动物和相同的溶剂，进值，应由本实验室利用相同品系的实验动物和相同的溶剂，进行至少行至少10次独立实验的阴性次独立实验的阴性( (溶剂溶剂) )对照的资料构成。对照的资料构成。4.3.2 统计学意义和生物学意义统计学意义和生物学意义l在分析和综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义时，在分析和综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义时，可能遇到四种情况。见下表所示。在此表中，
54、第可能遇到四种情况。见下表所示。在此表中，第和第和第种情况最为常见，第种情况最为常见，第种情况是无统计学意义也无生物学种情况是无统计学意义也无生物学意义，第意义，第种情况是有统计学意义也有生物学意义。但是种情况是有统计学意义也有生物学意义。但是有时在实验结果中会出现第有时在实验结果中会出现第和和第第种情况。种情况。毒理学试验结果的统计学意义和生物学意义毒理学试验结果的统计学意义和生物学意义生物学意义生物学意义统计学意义统计学意义无无有有无无有有4.3.2 统计学意义和生物学意义统计学意义和生物学意义l第第种情况是具有生物学意义但无统计学意义种情况是具有生物学意义但无统计学意义，这可能是因为该，
55、这可能是因为该事件的发生是极端罕见的，例如在哺乳动物致癌试验中，在染毒事件的发生是极端罕见的，例如在哺乳动物致癌试验中，在染毒组中出现对照组中没有的肿瘤类型，尽管从统计学上此种肿瘤的组中出现对照组中没有的肿瘤类型，尽管从统计学上此种肿瘤的发生率很低，与对照组比较差别无显著性发生率很低，与对照组比较差别无显著性( (P 0.05) )，但还应该认，但还应该认为是有生物学意义的。为是有生物学意义的。l第第种情况是有统计学意义但无生物学意义种情况是有统计学意义但无生物学意义，例如在某个亚慢性，例如在某个亚慢性毒性试验中，中剂量组动物血液白细胞计数低于阴性对照组，差毒性试验中，中剂量组动物血液白细胞计数低于阴性对照组，差别有显著性别有显著性( (P 0.05) )。由于在此实验结果中。由于在此实验结果中未出现剂量未出现剂量- -反应关系，因此中剂量组血液白细胞计数降低可能是反应关系，因此中剂量组血液白细胞计数降低可能是由于偶然因素造成的，没有生物学意义。在判断实验结果的生物由于偶然因素造成的，没有生物学意义。在判断实验结果的生物学意义时，有无剂量学意义时，有无剂量- -反应关系是关键。有统计学意义但无生物学反应关系是关键。有统计学意义但无生物学意义的情况，更常见的是因为实验设计和实施不良所致。意义的情况，更常见的是因为实验设计和实施不良所致。
