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1、 第 50 卷 第 18 期 2005 年 9 月 论 文 1972 利用核糖体基因区打靶载体靶向表达 改造型人凝血因子 刘雄昊* 刘慕君* 佘 华 文 路 薛志刚 梁德生 蔡 芳 潘 乾 龙志高 邬玲阡 戴和平 夏 昆 夏家辉 (中南大学医学遗传学国家重点实验室, 长沙 410078. * 同等贡献. 联系人, E-mail: ) 摘要 构建了携带改造型 hF(hF-BDDAK39)的核糖体基因区靶向表达载体 pHrneo-BDDAK39, 并将其转入人纤维肉瘤细胞(HT1080), 检测其定点整合的能力及 hF-BDDAK39 的表达情况. 结果显示, pHrneo-BDDAK39 能够
2、成功地将 hF-BDDAK39 靶入到 HT1080 细胞的核糖体基因区, 定点整合效率达到 2.0105, 并且靶入的 hF-BDDAK39 能有效表达, 表达量为(325)ng106细胞124 h1. 这为利用此靶向表达载体进行血友病 A 的基因治疗提供了重要的实验依据. 关键词 人源基因载体 定点整合 靶向表达 改造型人凝血因子 载体选择是目前基因治疗领域面临的最大难题. 病毒载体因其体内、 外转染效率均较高而成为基因治疗中广泛应用的载体. 目前, 有 70%的临床实验采用病毒载体. 但病毒载体仍然存在安全性的问题, 以及操作复杂和费用太高的问题. 高效、安全的非病毒载体已成为众多研究者
3、追求的目标. 目前, 除转染效率低以外, 非病毒载体的局限性主要是由于不能整合到基因组中而导致的表达时间短. 为了克服非病毒载体以上的缺陷, 我们一直致力于具有定点整合能力的非病毒载体的研究. 本室构建的人源基因载体 核糖体基因区打靶载体(pHrneo)能携带外源基因以较高的效率(104105)定点整合至人核糖体基因区. 因此, 我们选择 pHrneo 作为载体进行血友病 A 基因治疗的研究. 目前, 在血友病A的基因治疗中发现, 重组的hF基因在哺乳动物细胞中的表达量极低1,2. 其主要原因有3,4: () 在FcDNA结构中, 有一段大约1.2 kb的片段对mRNA的积累起抑制作用, 相当
4、于一个转录沉寂子或转录延伸阻遏子的作用, 从而大大降低了F的表达水平; () F分子从内质网向高尔基体转移效率较低; () 合成以后的F分子极其敏感, 极易受到蛋白酶的降解, 需要与vWF因子结合才能稳定存在. 研究表明, 改造hF是提高hF在细胞中的表达量的一个有效途径5,6. 本室已将hF改造成hF-BDDAK39. hF-BDDAK39 有以下特点: () 缺失hF cDNA的大部分B区(B760 1639); () 去除其 5和 3UTR; () 在其 5端融入ApoAI内含子; () 将hF cDNA翻译起始密码子ATG的侧翼序列改为Kozak序列; () 定点突变L303E和F30
5、9S. 本研究将hF-BDDAK39 表达框架装入核糖体基因区打靶载体pHrneo, 构建了核糖体基因区靶向表达载体pHrneo-BDDAK39, 然后将pHrneo-BDDAK39 电转入人纤维肉瘤细胞(HT1080), 研究其定点整合的能力及hF-BDDAK39 的靶向表达情况. 1 材料与方法 () 材料. 所有限制性内切酶均购自 TaKaRa公司, pcD-BDDAK39, PT2, pHrneo 为本室构建, HT- 1080 细胞购自 ATCC, 随机引物标记试剂盒为 Roche公司, -32P-dCTP 购自 Perking-Elmer 公司, Reverse Transcrip
6、tion System 购自 Promega 公司, 小鼠抗人F轻链单克隆抗体购自 CALBIOCHEM 公司, 辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗鼠)购自PIERCE公司, F的 ELISA 检测试剂盒购自 CEDARLANE 公司, hF的凝血活性检测试剂盒购自上海太阳生物技术公司. 高纯度 PCR 产物纯化试剂盒购自 Roche 公司. () 靶向表达载体 pHrneo-BDDAK39 的构建. 用 Nhe/Pme双酶切 pcD-BDDAK39, 将切下的hF-BDDAK39 插入 PT2 的 Xba/Pme酶切位点, 构建成 pT-BDDAK39; 然后, 用 Nhe酶切 pT- BDD
7、AK39, 将切下的带有 CMV 启动子和 BGH poly(A)加尾信号的 hF-BDDAK39 表达框插入核糖体基因区打靶载体 pHrneo 的 Nhe位点, 构建成pHrneo-BDDAK39(图 1). 论 文 第 50 卷 第 18 期 2005 年 9 月 图 1 核糖体基因区靶向表达载体 pHrneo-BDDAK39 的构建 pcD-BDDAK39 为本室构建, 已将 hF-BDDAK39 装入了 pCDNA3.1; PT2 为本室已构建的过渡载体, 其上带有 Xba和 Pme的克隆位点, 在 Pcmv 和 BGHpA 的两端均带有 Nhe的酶切位点. pHrneo 为本室构建的
8、人源基因载体-核糖体基因区打靶载体: LHA(long homologous arm)为长同源臂, SHA(short homologous arm)为短同源臂, 与人核糖体基因部分区域同源; EMCV-IRES 为EMCV 病毒的核糖体内部进入位点; 其上的 NEO 基因没有带启动子, 该载体采用启动子陷阱的筛选策略, 利用原位的核糖体基因本身的启动子来启动 NEO 基因的表达. pHrneo-BDDAK39 的构建过程: 用 Nhe/Pme双酶切 pcD-BDDAK39, 将切下的hF-BDDAK39 装入 PT2 的 Xba/Pme位置, 构建成 pT-BDDAK39; 用 Nhe酶切
9、pT-BDDAK39, 将切下的带有 CMV 启动子 和 BGHpoly(A)加尾信号的 hF-BDDAK39 表达框装入核糖体基因打靶载体 pHrneo 的 Nhe位点, 构建成 pHrneo-BDDAK39 () 细胞转染及筛选. 采用 BIO-RAD Gene Pulser电转仪进行电转, Ahd线性化的质粒 DNA 20 g, 转染 2106的 HT1080 细胞. 电转条件为: 2.0 kV, 50 F. 然后将其平均接种至 6 个直径为 10 cm 的培养皿中, 每皿中加 10 mL DMEM 培养基(含 10% FCS), 37, 5% CO2条件下开放培养. 24 h 后更换
10、10 mL 新的 DMEM 培养基(含 10% FCS), 继续培养 48 h后, 更换 DMEM 培养基(含 10% FCS), 并加 G418 (300 g/mL)进行筛选. 以后每隔 2 d 更换 1 次培养基(含 10% FCS, G418 300 g/mL), 筛选后 14 d 左右出 1973 第 50 卷 第 18 期 2005 年 9 月 论 文 现细胞克隆. 将细胞单克隆挑至 12 孔板中单独扩大培养. () 用 PCR 的方法鉴定出定点整合细胞克隆. 以苯酚/氯仿方法抽提分离培养的单克隆细胞 gDNA. 以抽提细胞 gDNA 为模板, 用位于 CMV 启动子上的引物 scr
11、een-rc(5-AAT GGG CGG GGG TCG TTG GGC GGT CA-3)和位于 hrDNA 区同源臂外引物screen-dn(5-GGC GAT TGA TCG GCA AGC GAC GCT CAG ACA G-3) (图 2)进行扩增. 扩增条件为: 97, 5 min; 97, 30 s, 72, 2.5 min, 10 循环(每次循环减 0.6); 97, 30 s, 66, 30 s , 72, 2 min, 25循环; 72, 10 min. () 测序鉴定 PCR 产物. 0.8%低溶点琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段大小正确的 PCR 产物, 将回收的目的片段与
12、pGEM-T 载体进行连接. 以 primer- T7(5-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3)和primer- SP6(5-CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3)为引物, 在 ABI377 测序仪上对连接片段进行测序鉴定. () Southern blot鉴定定点整合细胞克隆. 以苯酚/氯仿方法抽提用PCR法鉴定为定点整合的单克隆细胞gDNA. Southern blot方法主要参考文献7, 用Pvu进行酶切后转膜. 以pHrneo-BDDAK39 为模板, 用引物primer-1(5-CCC GGA AAC CTG GCC CTG TCT
13、 T-3)和引物primer-2(5-TGG GGT ACC TTC TGG GCA TCC TTC-3)扩增出 330 bp的EMCV- IRES片段作为探针. 扩增条件为: 97, 5 min, 97, 30 s, 60, 20 s, 72, 30 s, 32 循环; 72, 10 min. 然后, 采用随机引物标记试剂盒和-32P-dCTP 对探针进行标记. 再以高纯度 PCR 产物纯化试剂盒纯化标记产物后进行杂交. ( ) RT-PCR 检 测 定 点 整 合 细 胞 中 hF- BDDAK39 转录的 mRNA. 按 TRIZOL 试剂说明书抽提定点整合细胞的总 RNA. 总 RNA
14、 为模板按Reverse Transcription System(Promega)进行逆转录. 以逆转录产物为模板, 以 primer-3(5-GCT TCA TCC TAC TTT ACC AAT-3)和 primer-4(5-TGC AGT GGC CAC CCT CAG TAG AG-3)进行 PCR 扩增, 扩增片段长度为 450 p. 扩增条件为 95, 5 min; 95, 30 s, 55, 30 s, 72, 30 s, 30 循环, 72, 10 min. () Western blot 检测定点整合细胞克隆中hF-BDDAK39 的表达. 收集定点整合细胞的无血清培养上清
15、, 将待测上清与 5上样缓冲液等混合, 98变性 10 min 后在 8% SDS-PAGE 胶中电泳. 电泳结束后将蛋白电转移至 PVDF 膜上, 以后依次加入封闭液、 一抗(小鼠抗 hF轻链抗体)和辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗鼠). 每次换液, 需 PBS 洗涤 3 次, 最后用 ECL 液显色观察. () 定点整合细胞克隆的 hF-BDDAK39 表达检测. hF-BDDAK39 的抗原含量检测是按照ELISA 的方法进行(CEDARLANE Laboratories Lim-ited). hF-BDDAK39 的凝血活性检测是采用一期法(上海太阳生物技术公司). 图 2 定点整合鉴
16、定示意图 打靶载体: 本室构建的核糖体基因区靶向表达载体. 基因组中靶位置: 人基因组中与打靶载体同源的核糖体基因区. 靶入后位置: 打靶载体定点整合到基因组的核糖体基因区. 引物 screen-rc 位于整合到核糖体基因区的 Pcmv 上, 引物 screen-dn 位于人基因组中核糖体基因同源序列的外侧, 扩增片段长 1.5 kb. 通过对靶入后位置进行酶谱分析, Pvu在同源序列外侧和 NEO 基因上各有一个 酶切位点, 其间的距离为 7.2 kb, 采用 EMCV-IRES 的部分片段作为探针, 就能检测到此特异性片段 1974 论 文 第 50 卷 第 18 期 2005 年 9
17、月 2 结果 2.1 核糖体基因区靶向表达载体的鉴定 用限制性内切酶 Nco进行酶切鉴定, 能被切成9862, 3117, 2580 和 1083 bp 4 个片段(图 3). 载体经测序证实. 图 3 pHrneo-BDDAK39 酶切鉴定 对用限制性内切酶 Nco对 pHrneo-BDDAK39 进行酶切鉴定, 正确的克隆会被切成 9862, 3117, 2580 和 1083 bp 4 个片段. 13 为阳性克隆; M 为 Marker 2.2 定点整合细胞克隆的的鉴定 当靶向表达载体与HT1080细胞的基因组发生同源重组后, 会将载体中两同源序列之间的片段插入到HT1080细胞基因组中
18、同源序列之间(图2). 采用位于 CMV 启动子上的引物 screen-rc 与位于 rDNA 区同源序列外侧的引物 screen-dn 进行扩增, 扩增出长度为 1.5 kb 的特异性片段(图 2). 图 4 显示了扩增的阳 图 4 PCR 鉴定定点整合克隆 抽提分离培养的单克隆细胞 gDNA 采用引物进行扩增, 定点整合克隆会扩增出 1.5 kb 的片段. 1 和 6 为阳性克隆, 25 为阴性对照. M 为DL2000, DNA Marker 性结果, 1.5 kb 的 PCR 产物经测序证实为目的片段. 2.3 Southern blot 鉴定定点整合细胞克隆 通过酶谱分析得知(图 2
19、), 同源重组子有 2 个 Pvu切点, 之间的长度为 7230 bp, 用 EMCV-IRES的部分片段作为探针, 就能杂交到此 7.2 kb 的片段. 我们将 PCR 鉴定出的定点整合细胞进行 Southern blot 鉴定, 结果显示均为阳性(图 5). 图 5 Southern blot 结果 1 为 HT1080 细胞; 25 为 PCR 鉴定出的细胞, 均检测到了 7.2 kb 的 特异性片段 2.4 定点整合效率计算 在本研究中, 电转化 2106细胞后, 筛选出 G418抗性克隆约 260 个细胞单克隆, 用 PCR 鉴定了 25 个细胞单克隆, 鉴定出了 4 个定点整合克隆
20、. 根据定点整合率计算方法(定点整合率=(总克隆数定点整合克隆数/鉴定克隆数)/细胞数), 计算出实验中的定点整合效率为 2.0105. 2.5 RT-PCR 检测 以 TRIZOL 试剂抽提定点整合细胞单克隆总RNA. 用此总 RNA 为模板, 以 oligo(T)为引物进行RT-PCR 反应. 用 RT-PCR 产物为模板, 以 primer-3/ primer-4 为引物进行 PCR 扩增. 扩增产物跨越 hF基因 2 个内含子(内含子 24 和内含子 25), 结果显示(图 6), 在定点整合细胞中均扩增出了 450 bp 的目的片段, 表明在定点整合细胞克隆中有足量的 hF- BDD
21、AK39mRNA. 图 6 RT-PCR 结果 1 为 HT-1080; 25 为定点整合细胞; M 为 DL2000, DNA Marker 1975 第 50 卷 第 18 期 2005 年 9 月 论 文 2.6 用 Western blot 检测定点整合细胞表达分泌的hF-BDDAK39 蛋白 hF在成熟过程中大部分被剪切为 90200 kD大小不等的重链和 80 kD 的轻链. 同样, 我们改造的hF-BDDAK39 在成熟过程中绝大部分也被剪切为90 kD 的重链和 80 kD 的轻链, 只有极少数保持 170 kD 的单链状态. 本研究使用的 hF抗体为抗其 80 kD 轻链抗
22、体. 结果显示, 定点整合克隆细胞的培养上清中均可检测到一条约 80 kD 的目的条带, 而在未转基因的 HT1080 细胞的培养上清中则未检测到(图7). 图 7 Western blot 结果 1, HT1080 细胞; 25, 定点整合细胞 2.7 定点整合细胞表达分泌的hF-BDDAK39蛋白的定量检测 经 检 测 , 定 点 整 合 细 胞 培 养 上 清 中 hF- BDDAK39 抗原含量为(325)ng106 细胞124 h1, hF-BDDAK39 的凝血活性为(14315)mU106 细 胞124 h1. 3 讨论 许多基因打靶实验已经证实在哺乳动物细胞中同源重组的效率比在
23、原核生物或低等真核生物中的同源重组效率要低得多, 一般在106108之间. 而在哺乳动物体细胞中打靶又要比在其胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)中打靶更困难, 因为体细胞中同源重组的效率比ES细胞中同源重组的效率大约低 2 个数量级810. 从实验结果来看, 我们的同源重组效率达到 2.0105, 可以认为这较高的同源重组效率与以下几个方面的因素有关: () rDNA区可能是一个同源重组热点; () 我们采用了启动子陷阱的筛选策略. rDNA区作为外源基因整合的靶位点已被应用于一些低等真核生物包括酵母11,12和锥虫13的研究领域. 在酵母中, 其目的是利用rDNA区
24、的多拷贝性质插入多个拷贝的外源基因, 以获得高表达; 在锥虫中, 其目的是利用rDNA启动子的高转录特点获得外源基因的高表达. 哺乳动物细胞的rDNA区基因打靶的报道很少. 在哺乳动物细胞基因打靶技术成熟之前, Steele等人14曾做过一次尝试, 但没有检测到同源重组子. 最近, Stewart等人15利用rDNA同源序列将含LoxP位点的红色荧光蛋白(RFP)基因靶向含rDNA序列的小染色体上, 目的是构建哺乳动物细胞人工染色体. 但他们仅仅通过流式细胞仪富集了红色荧光细胞而并没有对同源重组事件进行药物筛选和富集, 便鉴定到同源重组子, 也说明rDNA区具有高的同源重组率. 目前, 在哺乳
25、动物细胞中进行基因打靶时主要应用两种筛选策略16: () 正负筛选策略(positive- negative selection, PNS), 这种筛选策略往往因为负筛选效率低, 通常只能实现 210 倍的富集效率; () 启动子陷阱(promoter-trap, PT)筛选策略, 它可达到10005000 倍的富集效率, 因为应用PT筛选策略时筛选基因自身不带启动子, 只有当其恰好整合到内源性基因启动子的下游时才可能启动自身表达, 而这种几率是很低的, 因此使用这种策略时, 可以大大降低随机整合细胞克隆数. 所以, 在ES细胞中打靶时一般应用PNS筛选策略, 而在体细胞中打靶时一般应用PT筛
26、选策略. 虽然, 有研究证明, rDNA基因启动子能够成功地驱动筛选基因NEO在rDNA基因区表达; 但外源目的基因是以类启动子还是以类启动子驱动才更适合于基因治疗仍是未知的. 本研究选择以CMV启动子驱动hF-BDDAK39 的表达. CMV启动子是目前已知的最强的类基因启动子之一, 并且它是一种广谱性的强劲启动子, 在许多类型的细胞中都能高效表达目的基因, 表明激活CMV启动子的核反式作用因子在一般情况下都大量存在. 虽然有报道显示, 在真核生物中pol和pol之间的转录干扰可能普遍存在, 但单拷贝整合于酵母rDNA基因区的以类启动子驱动的蛋白编码基因LEU2, URA3 以及ADE2 均
27、能有效表达17, 表明在真核细胞的rDNA区域并不缺乏激活类基因启动子的转录因子. Lopes等人11甚至报道多拷贝整合在酵母rDNA基因区的以GAPDH 启 动 子 驱 动 的 蛋 白 编 码 基 因 PGK (phosphoglycerate kinase)和SOD(Mn2+-dependent su-peroxide dismutase)可以表达高达细胞内总蛋白量50%的可溶蛋白. 所以本研究选择CMV启动子驱动1976 论 文 第 50 卷 第 18 期 2005 年 9 月 1977 hF的表达. 本研究发现, 定点整合细胞克隆能有效地表达有凝血活性的hF-BDDAK39, 表达
28、量达到(325) ng106 细胞124 h1. 这是首次实验证实在人rDNA基因区类基因启动子能驱动改造型hF基因表达. 有人认为, 由于CMV启动子在细胞中的甲基化会使转基因的的mRNA水平下降而导致表达时间不长18. 但同时也有大量的实验表明, CMV启动子能够驱动外源基因的稳定表达1921. Jenke等人22认为, CMV启动子不会因甲基化而沉默. 总之, 本研究构建的核糖体基因区靶向表达载体成功地将我们改造的 hF靶入到核糖体基因区, 同时得到了有效表达. 尽管在实验中我们采用的细胞是肿瘤细胞, 但我们相信, 通过进一步对原代人类细胞以及动物模型进行研究, 该载体将有可能实际应用于
29、人类血友病 A 的基因治疗中. 致谢 本工作为国家重点基础研究发展规划(批准号: 2004CB518800)、 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 (批 准 号 : 2002BA711A07-08, 2002BA711A07-03, 2002AA227011)和国家自然科学基金(批准号: 31830200)资助项目. 参 考 文 献 1 Chen C, Fang X D, Zhu J, et al. The gene expression of coagula-tion factor in mammalian cell lines. Thrombosis Research, 1999,
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40、48(2): 106112DOI 20 Fleury S, Simeoni E, Zuppinger C. Multiply attenuated, self- inac-tivating lentiviral vectors efficiently deliver and express genes for extended periods of time in adult rat cardiomyocytes in vivo. Cir-culation, 2003, 107(18): 23752382DOI 21 陈立, 邹蓓艳, 陈浩明, 等. HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/ hFIX及其安全性检测. 科学通报, 2003, 48(10): 10541058摘要 22 Jenke A C, Scinteie M F, Stehle I M. Expression of a transgene encoded on a non-viral episomal vector is not subject to epigenetic silencing by cytosine methylation. Mol Biol Rep, 2004, 31(2): 8590DOI (2005-06-21 收稿, 2005-07-25 收修改稿)
