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1、专题25微生物的利用生物（浙江选考专用）考点微生物的培养和利用考点微生物的培养和利用基础知识基础知识一、微生物的实验室培养一、微生物的实验室培养1.培养基培养基(1)概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)成分:一般都含有碳源、氮源、水和无机盐,还需要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。考点清单2.无菌技术无菌技术3.实验操作实验操作牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备:计算称量溶化灭菌倒平板。二、细菌的分离方法二、细菌的分离方法:划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法1.划线分离法划线分离法(1)方法:用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的平
2、板上划线,使聚集的菌种分散到培养基的表面。每个菌落就是一个细菌产生的后代。(2)应用:用于基因工程的大肠杆菌等工程菌,可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因),如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素,由于非工程菌和其他杂菌都没有抗性基因,所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。2.涂布分离法:先将培养的菌液稀释,通常稀释10-710-5倍,然后取0.1mL稀释度不同的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落。3.二者比较:划线分离法,方法简单;涂布分离法,单菌落更易分开
3、,但操作复杂。三、大肠杆菌的培养和分离三、大肠杆菌的培养和分离1.大肠杆菌大肠杆菌:革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。2.细菌的繁殖细菌的繁殖:以分裂的方式繁殖,分裂速度很快。3.细菌的扩大培养细菌的扩大培养:用LB液体培养基,划线分离用LB固体平面培养基。4.大肠杆菌的分离操作技术大肠杆菌的分离操作技术最常用的方法是划线分离法,其操作步骤是:a.培养基灭菌:将刚配制好的50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基分别装入两个250mL的三角瓶中,加上封口膜,用高压锅进行灭菌。b.倒平板:在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中,使培养基铺满培养皿底部,待凝,使之形成平面。c.接种扩大培
4、养:靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的液体培养基中,三角瓶在37,每分钟200转的摇床中振荡培养12h。d.划线分离:将摇床上培养12h的菌液在固体培养基的平板上连续划线,然后将盖好的培养皿倒置,放在37恒温培养箱中进行培养,1224h后,可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。e.菌种保存:在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在空白斜面上,在37下培养24h后,置于4冰箱中保存。四、分离以尿素为氮源的微生物四、分离以尿素为氮源的微生物1.实验原理实验原理:不同微生物利用氮源种类不同。有一些细菌含有脲酶,通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素在脲酶的降解下产生NH3
5、,使培养基的pH由原来的中性变为碱性,于是培养基中的酚红由红黄色变成红色。2.实验步骤实验步骤:(1)制备培养基:在60左右时,将两个三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基,在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中,摇匀后平放至凝固。(2)制备细菌悬液:在无菌条件下,将1g土样加到有99mL无菌水的三角瓶中,振荡10min,即成10-2土壤稀释液,依此方法制备10-3、10-4和10-5的土壤稀释液。(3)涂布法分离:取10-4和10-5的土壤稀释液各0.1mL,分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中,用通过灼烧法灭菌的玻璃刮刀将菌液涂布到整个平面上。(4)培养和观察:在37恒温箱中培养24
6、48h,观察菌落数。3.预测本实验的结果:LB全营养固体培养基上的菌落多而杂;尿素固体培养基上的菌落少而纯,一定时间内,菌落周围出现红色区域。用浓度为10-4和10-5的土壤稀释液接种,更容易形成单菌落的是10-5土壤稀释液。重点难点重点难点一、无菌技术的知识归纳一、无菌技术的知识归纳1.灭菌原因灭菌原因:为了获得纯净的培养物,关键是防止外来杂菌的污染。2.无菌操作的条件无菌操作的条件:(1)各种器皿必须是无菌的;(2)各种培养基必须是无菌的;(3)细菌转移操作的过程必须是无菌的。灭菌方法适用材料或用具灭菌条件灭菌时间灼烧灭菌接种环、接种针或其他金属用具在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧直至烧红干热
7、灭菌玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等干热灭菌箱内,160170加热1h2h高压蒸汽灭菌培养基等100kPa,12115min30min3.三种常用灭菌方法的比较三种常用灭菌方法的比较4.避免被杂菌污染的方法避免被杂菌污染的方法(1)注意灭菌操作原则,灭菌彻底,降低环境污染概率,手和实验服要清洁,减少操作时间,对污染源的改善考虑周到。(2)注意微生物生长条件,如pH、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱的环境,喜蛋白质丰富的营养物质,喜37的温度;而霉菌喜中性偏酸的环境,喜糖类丰富的营养物质,喜2530的温度。因此,可以根据不同微生物的“喜好”来减少污染。第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧目的
8、避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境或感染操作者二、大肠杆菌的培养与分离中应注意的问题二、大肠杆菌的培养与分离中应注意的问题1.划线分离操作中的有关问题划线分离操作中的有关问题(1)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环,在划线操作结束后,仍然需要灼烧接种环。(2)在灼烧接种环之后,要等其冷却后再进行划线,以免接种环温度太高,杀死菌种。(3)在做第二次以及其后的划线操作时,要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始划线,能使细菌的数目随着划线次数的增
9、加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.进行恒温培养时进行恒温培养时,要将培养皿倒置的原因要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿,则皿盖上形成的水滴会落到培养基表面并且扩散开,会冲散菌体,污染菌落,达不到分离的目的。因此恒温培养时,培养皿必须倒置。3.培养后判断是否有杂菌污染的方法培养后判断是否有杂菌污染的方法(1)从菌落的形态看,湿润度、透明度、黏稠度,呈何种颜色等,是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。(2)用显微镜镜检,观察菌的形态、大小,菌丝、孢子、芽孢等也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。(3)上述方法较难区分同类的不同物种,需要借助化学方法和进一步的形态观
10、察,如用革兰氏染色法,观察有无鞭毛、孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、芽孢等。例例1有些细菌可分解原油,从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题:(1)在筛选过程中,应将土壤样品稀释液接种于以为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲,该培养基属于培养基。(2)纯化菌种时,为了得到单菌落,常采用的接种方法有两种,即和。(3)为了筛选出高效菌株,可比较单菌落周围分解圈的大小,分解圈大说明该菌株的降解能力。(4)通常情况下,在微生物培养过程中,实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、和。无菌技术要求实验操作应在酒精灯附近进行,以避免周围环境中微生物的
11、污染。解析解析(1)从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株,使用的培养基应是以原油为唯一碳源的选择培养基,通过控制碳源,来促进能高效降解原油的菌株的生长,抑制其他微生物的生长。(2)菌种纯化培养时,常采用划线分离法和涂布分离法接种。(3)当固体培养基上长出单菌落后,可通过比较菌落周围分解圈的大小,来判断菌株降解原油能力的大小。一般来说,分解圈越大说明该菌株的降解能力越强,反之则越弱。(4)实验室培养微生物的过程中,常用灼烧灭菌法对接种环、接种针、试管口、瓶口等进行灭菌;用高压蒸汽灭菌法对培养基等进行灭菌;用干热灭菌法对玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等进行灭菌。无菌技术要求实验操作应
12、在酒精灯火焰旁进行,因为酒精灯火焰旁可形成一个无菌环境,可防止周围环境中微生物的污染。答案答案(1)原油选择(2)划线分离法涂布分离法(3)强(4)干热灭菌高压蒸汽灭菌火焰三、分离以尿素为氮源的微生物实验剖析三、分离以尿素为氮源的微生物实验剖析1.土样的获得土样的获得:从有哺乳动物排泄物的地方取得。2.实验步骤实验步骤:3.两种常用微生物接种方法比较两种常用微生物接种方法比较比较划线分离法涂布分离法原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体,即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不
13、同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落特点方法简单单菌落更易分开,但操作复杂些目的使培养基上形成由单个细胞繁殖而来的子细胞群体菌落知能拓展知能拓展(1)用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基。琼脂是未被纯化的混合物,内含一定量的含氮化合物,不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。(2)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红),标志着存在脲酶水解尿素的作用,从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大,表明菌株利用尿素的能力越强。(3)与全营养培养基
14、上的菌落数比较,尿素培养基上只有少数菌落,这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极小部分。例例2根据分离以尿素为氮源的微生物实验,回答下列问题:(1)写出脲酶降解尿素的反应式:。(2)该实验分离细菌时用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种,更容易形成单菌落的是。(3)A同学筛选出的菌落为150个,其他同学只筛选出50个,并且他在设计实验时并没有设置对照。你认为A同学结果产生的原因可能有哪些?。如何设计对照实验排除可能影响实验结果的因素:。(4)涂布平板的所有操作怎样保证无菌?。(5)有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用?解析解析脲即尿素,是蛋白质降解的产物。有一些细菌含有脲酶可以分解尿素
15、,利用尿素作为其生长的氮源。本实验使用涂布分离法分离以尿素为氮源的微生物,用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种,更容易形成单菌落的是10-5土壤稀释液,浓度越小越易形成单菌落。A同学结果产生的原因可能是土样不同,也可能是培养基污染或操作失误,可设计对照实验排除可能影响实验结果的因素,方案有二:一是由其他同学用与A同学一样的土壤进行实验,如果结果与A同学一致,则证明A同学无误,如果结果不同,则证明A同学存在操作失误或培养基配制有问题;另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养,作为空白对照,以检验培养基是否受到污染。答案答案(1)(NH2)2CO+H2O2NH3+CO2(2)
16、10-5土壤稀释液(3)可能是土样不同,也可能是培养基污染或操作失误方案有二:一是由其他同学用与A同学一样的土壤进行实验,如果结果与A同学一致,则证明无误,如果结果不同,则证明A同学存在操作失误或培养基配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养,作为空白对照,以检验培养基是否受到污染(4)应从操作的各个细节保证“无菌”,都应在酒精灯火焰附近进行。例如,酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物质、吸管要在酒精灯火焰周围等(5)如果土壤中有许多尿素,在自然界较高温度下会被水解,水解后的氨使土壤变成碱性,氨还与其他阴离子物质如S、C、N等形成化合物,则会使土壤
17、板结。有脲酶的细菌可降解土壤中的尿素,并利用所形成的氨,有利于自然界中氮的循环方法方法消毒与灭菌消毒与灭菌项目消毒灭菌条件使用较为温和的理化方法使用强烈的理化因素结果杀死物体表面或内部一部分微生物杀死物体内外所有的微生物适用实验操作的空间、操作者的衣着和手微生物的培养器皿、接种用具和培养基等常用方法煮沸消毒法(如100,5min6min),巴氏消毒法(80,15min),酒精、氯气、石炭酸等化学药剂消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌突破方法例例3细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理,这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A.接种环、手、培养基B.高压锅、手、接种
18、环C.培养基、手、接种环D.接种环、手、高压锅突破方法解析解析一般来说灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力,对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分微生物,而对被消毒的物体基本无害,操作者的手需要消毒。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备,通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌,适用于微生物的接种工具,如接种环。答案答案C【思维点拨】【思维点拨】(1)高温加热灭菌,其原理就是使细菌体内的蛋白质变性,从而达到杀灭细菌的作用。(2)化学药剂消毒的方法,其作用原理是使细菌体内蛋白质变性,但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外
19、层进入细胞内,因此化学方法难以消灭孢子和芽孢。(3)体积分数为70%的乙醇杀菌效果最强。浓度过低,杀菌力弱;浓度过高,使菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜,乙醇分子不能渗入细菌内,杀菌效果受影响。对刚洗刷后未干的器皿,则可选择75%的酒精进行消毒。(4)灭菌的目的:无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还能有效避免操作者自身被微生物感染。(5)培养基的制作是否合格的验证:如果未接种的培养基在恒温箱中保温12天后无菌落生长,就说明培养基的制备是成功的,否则需要重新制备。3-1无菌操作技术是微生物培养过程的关键,试回答以下两题。(1)下列材料或用具中:培养细菌用的培养基与培养皿玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管实验操作者的双手需要灭菌的是:;需要消毒的是:。(填序号)(2)实验结束后,使用过的培养基应该进行处理后,才能倒掉。答案答案(1)和(2)灭菌解析解析灭菌与消毒是两个不同的概念,一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力,对于培养基、培养器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部的部分微生物而对被消毒的物体基本无害,操作者的双手需要消毒。
