蛋白质的结构功能及分离纯化课件

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1、第四章蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）蛋白质的化学组成和分类（一）蛋白质的化学组成和分类1 1、 元素组成元素组成 碳碳 50% 50% 氢氢7% 7% 氧氧23% 23% 氮氮16% 16% 硫硫 0-3% 0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼 凯氏定氮：粗蛋白质含量凯氏定氮：粗蛋白质含量= =蛋白氮蛋白氮6.256.252 2、 氨基酸组成氨基酸组成蛋白质是由蛋白质是由2020种种L-L-型型氨基酸组成的长链分子氨基酸组成的长链分子一、一、 蛋白质通论蛋白质通论蛋白质的结构功能及分离纯化课件3 3、 分类分类（1 1） 按组

2、成：按组成：单单纯纯蛋蛋白白质质：只只含含氨氨基基酸酸成成分分；可可以以根根据据其其物物理理性性质质进进行行分类分类缀缀合合蛋蛋白白质质：氨氨基基酸酸 + + 辅辅基基（配配体体）；可可以以按按其其非非氨氨基基酸酸成分进行分类成分进行分类（2 2）按生物学功能：）按生物学功能：酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白、异常蛋白。结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白、异常蛋白。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）（二） 蛋白质分子的形状和大蛋白质分子的形状和大小小1 1 形状形状纤维状蛋白质：具有比较简单

3、纤维状蛋白质：具有比较简单球状蛋白质球状蛋白质膜蛋白质膜蛋白质蛋白质的结构功能及分离纯化课件2大小少少于于5050个个氨氨基基酸酸的的低低分分子子量量多多聚聚物物称称为为肽肽，寡寡肽或生物活性肽，有时也称多肽。肽或生物活性肽，有时也称多肽。多于多于5050个氨基酸的称为蛋白质。个氨基酸的称为蛋白质。蛋白质分子量蛋白质分子量 = = 氨基酸数目氨基酸数目*110*110蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。一级结构：氨基酸顺序一级结构：氨基酸顺序二级结构：二级结构：螺旋、螺旋、折叠、折叠、转角，无规卷曲转角，无规卷曲

4、三级结构：三级结构： 整个肽链（亚基）的形状；整个肽链（亚基）的形状；四级结构四级结构 ：亚基之间的聚集形式。：亚基之间的聚集形式。（三）（三） 蛋白质的构象和蛋白质结构蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次的组织层次蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件（四）蛋白质功能的多样性（四）蛋白质功能的多样性催化酶，生物催化剂调节激素蛋白类，调节体内的物质代谢过程或参与基因表达的调控转运运输蛋白类，通过血流或膜通道转运特定的物质贮存能贮存氨基酸等，作为机体的营养物，在需要时提供各种元素运动使细胞或生物体发生运动结构成分具有强大的抗拉作用，对机体起支持作用支架作用在细胞应答激素和生长

5、因子的途径中起作用防御和进攻在细胞防御、保护和开发方面的主动作用异常功能蛋白质的结构功能及分离纯化课件二二 肽肽肽肽 (peptides) (peptides)是由氨基是由氨基酸通过肽键连接起来的酸通过肽键连接起来的一类有机物。根据其所一类有机物。根据其所含氨基酸残基的数量，含氨基酸残基的数量，有小肽和多肽之分。有小肽和多肽之分。小肽一般是指不到小肽一般是指不到1010个个氨基酸所组成的肽，多氨基酸所组成的肽，多肽一般是指肽一般是指10501050个氨个氨基酸所组成的肽。基酸所组成的肽。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一一） 肽肽键键与与肽肽链链肽肽键键：一一个个氨氨基基酸酸的的羧羧基基与与另

6、另一一个个氨氨基基酸酸的的氨氨基基之之间间失失水水形形成成的的酰酰胺胺键键。蛋白质的结构功能及分离纯化课件 肽键的特性肽键的特性氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用：氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用：肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部部分分双双键键性性质质，不不能能自自由由旋旋转转。在大多数情况下，以反式结构存在。在大多数情况下，以反式结构存在。组成肽键的原子处于同一平面组成肽键的原子处于同一平面- -肽平面。肽平面。蛋白质的结构功能及分离纯化课件肽键的结构特点：肽键的结构特点：1.1.酰酰胺胺氮氮上上的的孤孤对对电电子子与与相相邻邻羰羰基基之之间间形形成成共共振振杂杂

7、化体。化体。2.2.肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。3.3.肽肽键键具具有有平平面面性性，组组成成肽肽键键的的4 4个个原原子子和和2 2个个CC几几乎处在同一平面内（酰氨平面）。乎处在同一平面内（酰氨平面）。4.4.肽键亚氨基在肽键亚氨基在pH0-14pH0-14内不解离。内不解离。5.5.肽肽链链中中的的肽肽键键一一般般是是反反式式构构型型，而而ProPro的的肽肽键键可可能能出现顺、反两种构型出现顺、反两种构型蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件肽肽链链由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸由两个氨基酸组成的肽称为二肽，

8、由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。蛋白质的结构功能及分离纯化课件肽链中肽链中AA的排列顺序和命名的排列顺序和命名v在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。为氨基酸顺序。v通常在多肽链的一端含有一个游离的通常在多肽链的一端含有一个游离的 - -氨基，称为氨基端或氨基，称为氨基端或N-N-端；在另一端含有一个游离的端；在另一端含有一个游离的 - -羧基，称为羧基端或羧基，称为羧基端或C-C-端。端。v氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序

9、是从N N端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C C端氨基酸残基为端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Ser-Val-Tyr-Asp-GlnTyr-Asp-Gln蛋白质的结构功能及分离纯化课件1.1.旋旋光光性性：一一般般短短肽肽的的旋旋光光度度等等于于其其各各个个氨氨基基酸酸的的旋旋光度的总和。光度的总和。2.2.肽的酸碱性质肽的酸碱性质1)1)短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。2)2)肽肽的的酸酸碱碱性性质质主主要要取取决决于于端端和和端端COOHCOOH以及侧

10、链上可解离的基团。以及侧链上可解离的基团。3)3)在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。（二）肽的物理和化学性质（二）肽的物理和化学性质蛋白质的结构功能及分离纯化课件4）原则：当溶液原则：当溶液pH大于解离侧链的值，占优大于解离侧链的值，占优势势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液pH小于小于解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的共轭酸。共轭酸。3.肽的化学反应：肽的肽的化学反应：肽的-羧基，羧基，-氨基和侧链氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的基上的

11、活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应，如茚三酮反应、反应，如茚三酮反应、Sanger反应、反应、DNS反应反应和和Edman反应；还可发生双缩脲反应（含有两反应；还可发生双缩脲反应（含有两个或两个以上肽键的化合物与个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液碱性溶液发生反应生成紫红色或蓝紫色的复合物。氨基发生反应生成紫红色或蓝紫色的复合物。氨基酸无该反应）。酸无该反应）。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽一些小肽在动物体内主要用于合成蛋白质，作为体蛋白的结一些小肽在动物体内主要用于合成蛋白质，作为体蛋白的结构组分，构组分， 因而称之为结构肽因而称之为结

12、构肽(structural peptieds)(structural peptieds)。另有一些肽类物质，在体内并非用于合成蛋白质，而是独立另有一些肽类物质，在体内并非用于合成蛋白质，而是独立发挥其特定的生物学功能，一般称之为生物活性肽发挥其特定的生物学功能，一般称之为生物活性肽 （bioactive peptidesbioactive peptides），简称活性肽；），简称活性肽； 也称功能肽也称功能肽（functional peptides)functional peptides)。已为人们广泛熟悉的表皮生长因子（已为人们广泛熟悉的表皮生长因子（epidermal growth epi

13、dermal growth factor, EGF)factor, EGF)、成纤维细胞生长因子（、成纤维细胞生长因子（ fibroblast growth fibroblast growth factor, FGFfactor, FGF）、类胰岛素生长因子（）、类胰岛素生长因子（insulin-like growth insulin-like growth factor, IGF)factor, IGF)均为典型的生物活性肽。均为典型的生物活性肽。蛋白质的结构功能及分离纯化课件1谷胱甘肽谷胱甘肽(GSH)蛋白质的结构功能及分离纯化课件GSH的功能的功能SH缓冲剂：保护血液中的红细胞不受缓冲剂

14、：保护血液中的红细胞不受氧化损伤，维持血红素中半胱氨酸处于氧化损伤，维持血红素中半胱氨酸处于还原态还原态解毒作用：解毒作用：GHS可与过氧化氢或其它有可与过氧化氢或其它有机过氧化物反应机过氧化物反应参与氨基酸的转运参与氨基酸的转运蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件2、短杆菌肽（抗生素）短杆菌肽（抗生素） 由由短短杆杆菌菌产产生生的的1010肽肽环环。抗抗革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌，临床用于治疗化浓性病症。临床用于治疗化浓性病症。 L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL- L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL

15、-OrnL-LeuD-Phe L-ProL-Val OrnL-LeuD-Phe L-ProL-Val 蛋白质的结构功能及分离纯化课件3、脑啡肽（脑啡肽（5肽）肽）Met-脑啡肽：脑啡肽：TyrGlyGlyPheMetLeu-脑啡肽：脑啡肽：TyrGlyGlyPheLeu具有镇痛作用。具有镇痛作用。生物体内寡肽的来源：生物体内寡肽的来源：合成蛋白质的剪切、修饰合成蛋白质的剪切、修饰酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、动物肠道可吸收寡肽动物肠道可吸收寡肽蛋白质的结构功能及分离纯化课件4 4、肽类激素肽类激素蛋白质的结构功能及分离纯化课件一一级级结结构构：蛋蛋白白质质多多

16、肽肽链链中中氨氨基基酸酸残残基基的的排排列列顺顺序序 表表示示方方法法：N N- -末末端端向向C C- -末末端端维维持持力力： 肽肽 键键、 二二硫硫键键三三、蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）（一）蛋白质测序的策略蛋白质测序的策略 对对于于一一个个纯纯蛋蛋白白质质，理理想想方方法法是是从从N N端端直直接接测测至至C C端端，但目前只能测但目前只能测6060个个N N端氨基酸。端氨基酸。1 1、直接法（测蛋白质的序列）、直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法两种以上特异性裂解法 N N C C A A 法裂解法裂解 A1 A1 A2 A2

17、A3 A3 A4 A4 B B 法裂解法裂解 B1 B1 B2 B2 B3 B3 B4 B4 蛋白质的结构功能及分离纯化课件2 2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）蛋白质的结构功能及分离纯化课件3 测序前的准备工作1）蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定纯度纯度97%以上，均一。以上，均一。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带要求一条带DNScl（二甲氨基萘磺酰氯）法测（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸端氨基酸2）测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数SDS-PAGE凝胶过滤法凝胶过滤法沉降系数法

18、沉降系数法蛋白质的结构功能及分离纯化课件4蛋白质测序的一般步骤蛋白质测序的一般步骤（1 1）测定蛋白质分子中多肽链的数目；）测定蛋白质分子中多肽链的数目；（2 2）拆分蛋白质分子中的多肽链；）拆分蛋白质分子中的多肽链；（3 3）断裂链内二硫键；）断裂链内二硫键；（4 4）分析每一多肽链的氨基酸组成；）分析每一多肽链的氨基酸组成；（5 5）鉴定多肽链的）鉴定多肽链的N N末端和末端和C C末端残基；末端残基； （6 6）裂解多肽链成较小的肽段；）裂解多肽链成较小的肽段；（7 7）测定各个肽段的氨基酸顺序；）测定各个肽段的氨基酸顺序；（8 8）确定肽段在多肽链中的顺序；）确定肽段在多肽链中的顺序；

19、（9 9）确定多肽链中二硫键的位置。）确定多肽链中二硫键的位置。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）（二）N末末端和端和C-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定1N-末端分析末端分析DNS-cl法法：最最常常用用，黄黄色色荧荧光光，灵灵敏敏度度极极高高，DNS-多多肽肽水水解解后后的的DNS-氨基酸不需要提取。氨基酸不需要提取。DNFB法法：Sanger试试剂剂，DNP-多多肽肽，酸酸水水解解，黄黄色色DNP-氨氨基基酸酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等PITC法：法：Edman法，逐步切下。无色法，逐步切下。无

20、色PTH-氨基酸，有机溶剂抽氨基酸，有机溶剂抽提，层析。提，层析。蛋白质的结构功能及分离纯化课件2C-末端分析末端分析肼解法肼解法无水肼无水肼NH2NH21005-10h。苯苯甲甲醛醛沉沉淀淀氨氨基基酸酸的的酰酰肼肼，C端端游游离离氨氨基基酸酸留留在在上上清清中。中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。不能用此法。蛋白质的结构功能及分离纯化课件羧肽酶法（羧肽酶法（ProPro不能测）不能测）羧肽酶羧肽酶A A：除：除ProPro、ArgArg、LysLys外的所有外的所有C C端端a.aa.a羧肽酶羧肽酶B B：只水解：只水解ArgArg、LysLys N H N H2 2N ValSe

21、rGly CN ValSerGly C图图P118羧肽酶法测羧肽酶法测C末端末端蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）二硫桥的断裂 过甲酸氧化：过甲酸氧化： SS + HCOOOH SO SS + HCOOOH SO3 3H H 巯基乙醇还原巯基乙醇还原（四）氨基酸组成的分析 酸水解的同时辅以碱水解酸水解的同时辅以碱水解蛋白质的结构功能及分离纯化课件（五五）多多肽肽链链的的部部分分裂裂解解和和肽肽段段混混合合物物的的分离纯化分离纯化1酶裂解法酶裂解法1）胰蛋白酶）胰蛋白酶LysX(XPro)ArgX2）胰凝乳蛋白酶）胰凝乳蛋白酶TyrX(XPro)TrpXPheX3）嗜热菌蛋白酶）嗜热菌蛋白酶L

22、eu(Trp、Try、Phe）X(XPro/Gly)4）胃蛋白酶）胃蛋白酶Phe(Trp、Try、Leu)Phe(Trp、Try、Leu)蛋白质的结构功能及分离纯化课件2 2 化学裂解法化学裂解法 溴化氰溴化氰 MetX MetX 产率产率85%85% 亚碘酰基苯甲酸亚碘酰基苯甲酸 TrpX TrpX 产率产率70-100%70-100% NTCB NTCB（2-2-硝基硝基-5-5-硫氰苯甲酸）硫氰苯甲酸）XCysXCys 羟胺羟胺NHNH2 2OH AsnGlyOH AsnGly 约约150150个氨基酸出现一次个氨基酸出现一次蛋白质的结构功能及分离纯化课件3、肽段的分离纯化肽段的分离纯化

23、电泳法电泳法根据分子量大小分离根据分子量大小分离离子交换层析法（离子交换层析法（DEAECellulose、DEAESephadex）根据肽段的电荷特性分离根据肽段的电荷特性分离反相法反相法根据肽段的极性分离根据肽段的极性分离凝胶过滤凝胶过滤要求：要求：单带单带单峰单峰端单一（常用端单一（常用cl法）法）蛋白质的结构功能及分离纯化课件四四蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构与生物功能与生物功能蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质的物种差异与生物进化1同源蛋白质：同源蛋白质：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。在不同的生物体内行使相同或相似功能的

24、蛋白质。如如：血血红红蛋蛋白白在在不不同同的的脊脊椎椎动动物物中中都都具具有有输输送送氧氧气气的的功功能能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。通通过过比比较较同同源源蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列的的差差异异可可以以研研究究不不同同物物种种间的亲源关系和进化。间的亲源关系和进化。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。蛋白质的结构功能及分离纯化课件同源蛋白质的特点：同源蛋白质的特点：同同源源蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列具具有有明明显显的的相相似似性性（序序列列同同源性）源性）

25、有有许许多多位位置置的的氨氨基基酸酸对对所所有有种种属属来来说说都都是是相相同同的的，称称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除除不不变变残残基基以以外外，其其它它位位置置的的氨氨基基酸酸对对不不同同的的种种属属有有很很大大变变化化，称称可可变变残残基基，可可变变残残基基中中，个个别别氨氨基基酸酸的的变变化不影响蛋白质的功能。化不影响蛋白质的功能。多肽链长度相同或相近多肽链长度相同或相近蛋白质的结构功能及分离纯化课件2细胞色素细胞色素C分子量：分子量：12500左右左右氨基酸残基：氨基酸残基：100个左右，单链。个左右，单链。25种生物中，细胞色素种生物

26、中，细胞色素C的不变残基的不变残基35个。个。60种生物中，细胞色素种生物中，细胞色素C的不变残基的不变残基27个。个。亲源关系越近的，其细胞色素亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。的差异越大。人与黑猩猩人与黑猩猩0人与猴人与猴1人与狗人与狗10人与酵母人与酵母44蛋白质的结构功能及分离纯化课件细胞色素细胞色素C功能功能:传递电子传递电子多肽链，血红多肽链，血红素，铁原子素，铁原子蛋白质的结构功能及分离纯化课件胰岛素胰岛素有有24个个氨氨基基酸酸残残基基位位置置始始终终不不变变：AB链链上上6个个Cys不不变变，

27、其其余余18个个氨氨基基酸酸多多数数为为非非极极性性侧侧链链，对对稳稳定定蛋蛋白白质质的的空空间间结结构构起重要作用。起重要作用。其其它它可可变变氨氨基基酸酸对对稳稳定定蛋蛋白白质质的的空空间间结结构构作作用用不不大大，但但对对免免疫疫反应起作用。反应起作用。猪猪与与人人接接近近，而而狗狗则则与与人人不不同同，因因此此可可用用猪猪的的胰胰岛岛素素治治疗疗人人的的糖尿病。糖尿病。蛋白质的结构功能及分离纯化课件3系系统统树树蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）（二） 同源蛋白质具有共同的进化起源同源蛋白质具有共同的进化起源1 1 氧合血红素蛋白质氧合血红素蛋白质2 2丝氨酸蛋白酶类丝氨酸蛋白酶类3

28、 3 功能差异很大的蛋白质功能差异很大的蛋白质蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）（三）血液凝固血液凝固与氨基酸序列的局部断裂与氨基酸序列的局部断裂1 1、 血液凝固中的级联过程血液凝固中的级联过程蛋白质的结构功能及分离纯化课件2 凝血酶和血纤蛋白原在血凝中的作用凝血酶和血纤蛋白原在血凝中的作用在在凝凝血血酶酶原原致致活活因因子子催催化化下下，凝凝血血酶酶原原分分 子子 中中 的的 Arg274Thr275Arg274Thr275、 Arg323Arg323Ile324Ile324断断裂裂，释释放放出出4848个个a.aa.a，产产生生活活性凝血酶。性凝血酶。 A A链链49 a.a49 a.

29、a B B链链259 a.a259 a.a蛋白质的结构功能及分离纯化课件纤维蛋白原纤维蛋白原 2 22 2r r2 2从从二二条条链链和和二二条条链链的的N N端端各各断断裂裂一一个个特特定定的的肽肽键键-Arg-ArgGly-Gly-，释释放放出出二二个个纤纤维维肽肽A A（1919个个氨氨基基酸酸）和和二二个个纤纤维维肽肽B B（2121个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。蛋白质的结构功能及分离纯化课件A、B肽肽切切除除后后，减减少少了了蛋蛋白白质质分分子子的的负负电电荷荷，促促进进分分子子间间聚聚集集，形成网状结构。形成网状结构。在凝血因子

30、在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。结合），生成交联的纤维蛋白。蛋白质的结构功能及分离纯化课件五、五、肽和蛋白质的人工合成肽和蛋白质的人工合成氨基保护：叔丁氧甲酰氯（氨基保护：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、）、苄苄氧酰氯（氧酰氯（CBZ-Cl）、）、对甲苯磺酰氯对甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）;羧基保护：苄酯、叔丁酯（成盐、成酯）羧基保护：苄酯、叔丁酯（成盐、成酯）;羧基活化：酰氯法（羧基活化：酰氯法（PCL5）、）、叠氮法、混叠氮法、混合酸酐法、活化酯法合酸

31、酐法、活化酯法;缩合剂：缩合剂：DCCI（二环己基碳二亚胺）直接二环己基碳二亚胺）直接接肽。接肽。蛋白质的结构功能及分离纯化课件第第5章章蛋白质的三维结构蛋白质的三维结构蛋白质的结构功能及分离纯化课件决定蛋白质天然构象的决定蛋白质天然构象的3个因素个因素: 1)与溶剂分子的相互作与溶剂分子的相互作用用;2)溶剂的溶剂的pH和离子强度和离子强度;3)蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列.每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列，实际上蛋白质每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列，实际上蛋白质的氨基酸序列是由的氨基酸序列是由DNA决定的。蛋白质的氨基酸序列具决定的。蛋白质的氨基酸序列具有重要意义：有重要意义

32、： 蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基础；础； 蛋白质的一级结构决定它的空间结构；蛋白质的一级结构决定它的空间结构； 氨基酸序列的改变可以导致蛋白功能异常和疾病；氨基酸序列的改变可以导致蛋白功能异常和疾病； 通过对一些蛋白质的氨基酸序列的比较可以反应出通过对一些蛋白质的氨基酸序列的比较可以反应出一些生物亲缘关系。一些生物亲缘关系。蛋白质的结构功能及分离纯化课件一一 研究蛋白质构象的方法研究蛋白质构象的方法X射线衍射法射线衍射法光谱学方法光谱学方法 紫外差光谱紫外差光谱 荧光和荧光偏振荧光和荧光偏振 圆二色性圆二色性 核磁共振核磁共振蛋白

33、质的结构功能及分离纯化课件二二稳定蛋白质三维结构的作用力稳定蛋白质三维结构的作用力蛋白质的折叠和具有生物学功能的蛋白质构象的稳定性依赖于大量的非共价因素，其中包括疏水效应、氢键、范德华力（van der Waals）和离子间相互作用；以及共价交联（二硫键）。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）（一） 氢氢 键键 氢键的贡献是协同蛋白质的折叠和帮助稳定球蛋氢键的贡献是协同蛋白质的折叠和帮助稳定球蛋白的天然构象。前面已经提到多肽链骨架的羰基和酰白的天然构象。前面已经提到多肽链骨架的羰基和酰胺基之间，特别是在球蛋白内部的那些基团之间常常胺基之间，特别是在球蛋白内部的那些基团之间常常形成氢键使肽链形成

34、形成氢键使肽链形成a-螺旋和螺旋和b-折叠结构。此外在多折叠结构。此外在多肽链骨架和水之间，多肽链骨架和极性侧链之间，两肽链骨架和水之间，多肽链骨架和极性侧链之间，两个极性侧链之间以及极性侧链和水之间也可以形成氢个极性侧链之间以及极性侧链和水之间也可以形成氢键。大多数氢键都是键。大多数氢键都是N-HO类型的。类型的。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质结构中常见的氢键蛋白质结构中常见的氢键蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）范德华力（二）范德华力范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德华力只有当两个非极性残基之间处于一定

35、距离华力只有当两个非极性残基之间处于一定距离时才能达到最大。虽然范德华力相对来说比较时才能达到最大。虽然范德华力相对来说比较弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具有加和性，因此范德华力对球蛋白的稳定性也有加和性，因此范德华力对球蛋白的稳定性也有贡献。有贡献。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）（三） 疏水相互作用疏水相互作用蛋白质中的疏水基团彼此靠近、聚集以避开蛋白质中的疏水基团彼此靠近、聚集以避开水的现象称之疏水相互作用（水的现象称之疏水相互作用（hydrophobic 0interaction）或疏水效应（）或疏水效应（hydrophobic ef

36、fect）。疏水相互作用在维持蛋白质构象中）。疏水相互作用在维持蛋白质构象中起着主要的作用，因为水分子彼此之间的相互起着主要的作用，因为水分子彼此之间的相互作用要比水与其它非极性分子的作用更强烈，作用要比水与其它非极性分子的作用更强烈，非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内部，而大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与部，而大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与水的接触。水的接触。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（四）盐（四）盐 键键带有相反电荷的侧链之间的离子相互带有相反电荷的侧链之间的离子相互作用也能帮助稳定球蛋白，虽然这种作用作用也能帮助稳定球蛋白，虽然这种

37、作用很弱。离子化的侧链一般都出现在球蛋白很弱。离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面，所以是溶剂化的，对于整个球蛋的表面，所以是溶剂化的，对于整个球蛋白的稳定性的贡献是最小的。白的稳定性的贡献是最小的。蛋白质的结构功能及分离纯化课件盐盐 键键蛋白质的结构功能及分离纯化课件（五） 二 硫 键除了氢键以外，共价交联，例如二硫键也有助于除了氢键以外，共价交联，例如二硫键也有助于某些球蛋白的天然构象的稳定，二硫键有时存某些球蛋白的天然构象的稳定，二硫键有时存在于由细胞分泌的蛋白质中，当这样的蛋白质在于由细胞分泌的蛋白质中，当这样的蛋白质离开细胞内环境时，由于有二硫键的存在，可离开细胞内环境时，由于有二硫

38、键的存在，可使得蛋白质对去折叠以及降解不那么敏感，而使得蛋白质对去折叠以及降解不那么敏感，而维持蛋白质的稳定。维持蛋白质的稳定。蛋白质的结构功能及分离纯化课件二二 硫硫 键键蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件三三多肽主链折叠的空间限制多肽主链折叠的空间限制氨基酸残基是通过肽键连接形成线性的多肽链的，一个氨基酸残基是通过肽键连接形成线性的多肽链的，一个多肽链的骨架是由通过肽键连接的重复单位多肽链的骨架是由通过肽键连接的重复单位N-C -C组组成的，酰胺氢和羰基氧结合在骨架上，而不同氨基酸成的，酰胺氢和羰基氧结合在骨架上，而不同氨基酸残基的侧链连接在残基的侧链连接在 -碳

39、上。碳上。蛋白质的结构功能及分离纯化课件酰胺平面酰胺平面参与肽键形成的参与肽键形成的2个原子个原子以及另外以及另外4个取代成员：个取代成员：羰基氧原子、酰胺氢原羰基氧原子、酰胺氢原子、以及子、以及2个相邻的个相邻的 -碳原子构成了一个肽单碳原子构成了一个肽单位。位。肽键的部分双键特性防碍肽键的部分双键特性防碍了了C-N键的旋转，其结键的旋转，其结果造成肽单位实际上是果造成肽单位实际上是个平面个平面-酰胺平面。酰胺平面。蛋白质的结构功能及分离纯化课件由于连接在两个由于连接在两个 -碳上的侧链基团之间的立体干碳上的侧链基团之间的立体干扰，不利于顺式构象的形成，对伸展的反式构象扰，不利于顺式构象的形

40、成，对伸展的反式构象的形成有利，因此蛋白质中几乎所有的肽单位都的形成有利，因此蛋白质中几乎所有的肽单位都是反式构象。是反式构象。蛋白质的结构功能及分离纯化课件二面角（二面角（dihedralangle)一个蛋白质的构象取决一个蛋白质的构象取决于肽单位绕于肽单位绕N-C 键和键和C -C键的旋转，旋键的旋转，旋转本身受到肽链的主转本身受到肽链的主链和相邻残基的侧链链和相邻残基的侧链原子之间的立体干扰原子之间的立体干扰的限制。的限制。蛋白质的结构功能及分离纯化课件一个肽平面绕一个肽平面绕N-C 键旋转的角度用键旋转的角度用F F表示，而绕表示，而绕C -键旋转的角度用键旋转的角度用Y Y表示，顺时

41、针方向为正，表示，顺时针方向为正，反时针为负，理论上反时针为负，理论上F(F(fai) )和和Y(Y(fai) )可以取可以取180至至180之间的任一个角度。当包含之间的任一个角度。当包含a的的两个肽键处于同一平面时，两个肽键处于同一平面时，F F和和Y Y都定义为都定义为0。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件四四二级结构：二级结构：肽主链折叠的规则方式肽主链折叠的规则方式早在早在1951年，年，Pauling和和Corey根据对一些简单根据对一些简单化合物，例如氨基酸、化合物，例如氨基酸、二肽以及三肽的二肽以及三肽的X-射线射线晶体图的研究数据，提晶体图的研究数据

42、，提出了两个周期性的多肽出了两个周期性的多肽结构：结构： -螺旋（螺旋（a-helix）和）和b b-折叠（折叠（b-sheet）结构，它们是许）结构，它们是许多纤维蛋白和球蛋白的多纤维蛋白和球蛋白的主要的二级结构。主要的二级结构。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）（一） -螺旋螺旋在一个理想的在一个理想的 -螺旋螺旋中，每一个氨基酸中，每一个氨基酸残基绕螺旋轴上升残基绕螺旋轴上升了了0.15nm，每圈螺，每圈螺旋需要旋需要3.6个氨基酸个氨基酸残基（一个羰基、残基（一个羰基、3个个N-Ca-C单位和单位和一个氮），它们绕一个氮），它们绕螺旋轴上升的距离，螺旋轴上升的距离，即螺距为即螺距为0

43、.54nm。蛋白质的结构功能及分离纯化课件在在 -螺旋中，螺旋中，相邻相邻的螺圈之间形成链的螺圈之间形成链内氢键，内氢键，多肽链骨多肽链骨架的每个羰基氧架的每个羰基氧（氨基酸残基（氨基酸残基n）与它后面与它后面C-端方端方向的第四个残基向的第四个残基（n4）的）的 -氨氨基氮形成氢键，螺基氮形成氢键，螺旋内的氢键几乎平旋内的氢键几乎平行于螺旋的长轴，行于螺旋的长轴，所有的羰基都指向所有的羰基都指向C-末端。末端。蛋白质的结构功能及分离纯化课件影响影响 -螺旋形成的原因螺旋形成的原因氨基酸组成与序列氨基酸组成与序列多多肽肽链链上上连连续续出出现现带带同同种种电电荷荷基基团团的的氨氨基基酸酸残残基

44、基,(如如Lys，或或Asp，或或Glu)，不不能能形形成成稳稳定定的的螺螺旋旋。如如多多聚聚Lys、多聚、多聚Glu。Gly在肽中连续存在时，不易形成在肽中连续存在时，不易形成螺旋。螺旋。R基大（如基大（如Ile）不易形成）不易形成螺旋螺旋Pro、脯氨酸中止、脯氨酸中止螺旋。螺旋。R基基较较小小，且且不不带带电电荷荷的的氨氨基基酸酸利利于于螺螺旋旋的的形形成成。如如多聚丙氨酸在多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成的水溶液中自发卷曲成螺旋。螺旋。蛋白质的结构功能及分离纯化课件pH对对螺旋的影响螺旋的影响蛋白质的结构功能及分离纯化课件右手右手-螺旋与左手螺旋与左手-螺旋螺旋右手螺旋比左手螺旋稳

45、定。右手螺旋比左手螺旋稳定。蛋白质中的蛋白质中的-螺旋几乎都螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左白酶中有很短的一段左手手螺旋，由螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成）组成（+64、+42）。）。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）（二）b b-折叠片折叠片Pauling和和Corey提提出的出的b b-折叠结构，折叠结构，是一种由伸展的多是一种由伸展的多肽链（称之肽链（称之b b链）链）组成的二级结构。组成的二级结构。b b-折叠又分为平行折叠又分为平行式（所有肽链的式（所有肽链的N端都在同一方向）端都在同一方向）和反平行式（肽链和反平

46、行式（肽链N端一反一正）。端一反一正）。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（1）氢氢键键与与肽肽链链的的长长轴轴接接近近垂直。垂直。（2）多多肽肽主主链链呈呈锯锯齿齿状状折折叠叠构象构象（3）侧侧链链R基基交交替替地地分分布布在在片层平面的两侧。片层平面的两侧。在在 -螺旋中，每一个氨基酸螺旋中，每一个氨基酸残基绕轴上升残基绕轴上升0.15nm，但，但在在b b-构象中，每个残基大构象中，每个残基大约占约占0.320.34nm，羰基，羰基氧和酰胺氢之间的氢键起氧和酰胺氢之间的氢键起着稳定着稳定b b-折叠结构的作用。折叠结构的作用。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）（三）转角及其它转角及其它除除

47、 -螺旋和螺旋和b b-折叠结折叠结构之外，球蛋白还含构之外，球蛋白还含有一些非重复的三维有一些非重复的三维结构区。非重复区一结构区。非重复区一般是由般是由2至至16个氨基个氨基酸残基组成，这些非酸残基组成，这些非重复区可以连接二级重复区可以连接二级结构和环（结构和环（loop）处）处改变肽链折叠的方向，改变肽链折叠的方向，使得蛋白质最终呈现使得蛋白质最终呈现球形。球形。蛋白质的结构功能及分离纯化课件转角转角 由由多多肽肽链链上上4 4个个连连续续的的氨氨基基酸酸残残基基组组成成；主主链链骨骨架架以以1801800 0返返回回折折叠叠；第第一一个个肽肽单单位位上上的的羰羰基基氧氧原原子子与与第

48、第三三个个肽肽单单位位上上的的亚亚氨氨基基氢氢原原子子生生成成一一个个氢氢键。键。蛋白质的结构功能及分离纯化课件发夹发夹由一条伸展的多肽链由一条伸展的多肽链弯曲而成的两条等弯曲而成的两条等长、彼此相邻、反长、彼此相邻、反向平行的肽段；两向平行的肽段；两条肽段依靠氢键联条肽段依靠氢键联系，氢键有系，氢键有16个；个；此构象包含此构象包含1011个氨基酸残基。个氨基酸残基。蛋白质的结构功能及分离纯化课件无规卷曲无规卷曲没有规律的多肽链主链骨架构象。没有规律的多肽链主链骨架构象。往往与生物活性有关往往与生物活性有关-螺螺旋旋，-转转角角，-折折叠叠在在拉拉氏氏图图上上有有固固定定位位置置，而而无无规

49、规卷曲的卷曲的、二面角可存在于所有允许区域内。二面角可存在于所有允许区域内。蛋白质的结构功能及分离纯化课件大多数蛋白质可以分为两种主要类型：纤维蛋白大多数蛋白质可以分为两种主要类型：纤维蛋白（Fibrous proteins）和球蛋白（）和球蛋白（globular proteins）。一般来说纤维蛋白的特性通过它的二级）。一般来说纤维蛋白的特性通过它的二级结构就可表现出来，但球蛋白的生物学功能通常都是结构就可表现出来，但球蛋白的生物学功能通常都是以三级结构表现出来的，而某些球蛋白的生物学活性以三级结构表现出来的，而某些球蛋白的生物学活性则需要四级结构。则需要四级结构。纤维蛋白的主要功能是维持和

50、支撑单个的细胞和整个纤维蛋白的主要功能是维持和支撑单个的细胞和整个的有机体。的有机体。 -角蛋白和胶原蛋白是最常见的纤维蛋白，角蛋白和胶原蛋白是最常见的纤维蛋白， -角蛋白是毛发和动物尾巴的主要成分，而胶原蛋白角蛋白是毛发和动物尾巴的主要成分，而胶原蛋白是腱、皮肤、骨骼和牙齿的主要蛋白成分。是腱、皮肤、骨骼和牙齿的主要蛋白成分。大多数球蛋白是水溶性的、多肽链紧密折叠、轮廓上大多数球蛋白是水溶性的、多肽链紧密折叠、轮廓上象一个球型的大分子。球蛋白典型特征是它有一个疏象一个球型的大分子。球蛋白典型特征是它有一个疏水的内部环境和一个亲水的表面水的内部环境和一个亲水的表面.五五 纤维状蛋白质纤维状蛋白

51、质蛋白质的结构功能及分离纯化课件纤纤维维蛋蛋白白：是是动动物物体体的的基基本本支支架架和和外外保保护护成分。分子对称性差，分子轴比大于成分。分子对称性差，分子轴比大于10。可溶性：肌球蛋白可溶性：肌球蛋白纤维蛋白质纤维蛋白质不溶性：角蛋白不溶性：角蛋白胶原蛋白胶原蛋白弹性蛋白弹性蛋白球球状状蛋蛋白白：具具有有多多种种多多样样的的生生物物功功能能。分分子子对对称称性性佳佳，分分子子轴轴比比小小于于10。溶溶解解度度较好。较好。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）（一） -角蛋角蛋白白蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）丝心蛋白与（二）丝心蛋白与折叠折叠蛋白质的结构功

52、能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）胶原蛋白（三）胶原蛋白-三股螺旋三股螺旋蛋白质的结构功能及分离纯化课件结构特征结构特征肽链的氨基酸顺序多肽链的氨基酸顺序多为为(Gly-x-y)，其中，其中x残基往往是残基往往是Pro，y残基往往是残基往往是Hyp，因此不可能形成，因此不可能形成螺旋或螺旋或折叠。折叠。三股左手螺旋平行排三股左手螺旋平行排列，相互绞合，生列，相互绞合，生成右手螺旋。各肽成右手螺旋。各肽链借助链借助Gly残基的残基的肽键之间形成氢键肽键之间形成氢键而交联在一起。而交联在一起。蛋白质的结构功能及分离纯化课件六六超二级结构和结构域超二级结构和结构域蛋白质分子中存在的

53、由若干相邻的二级蛋白质分子中存在的由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成结构单元按一定规律组合在一起，形成在空间上可彼此区别的结构单位在空间上可彼此区别的结构单位充当更高层次结构的构件，与空间结构充当更高层次结构的构件，与空间结构的运动性有密切关系的运动性有密切关系蛋白质的结构功能及分离纯化课件超二级结构超二级结构 也称之基元（motifs），是二级结构的组合结构。这类结构存在于大量的各种不同的蛋白质结构中。超二级结构可能具有一种特定的功能或是作为大的功能单位结构域的一部分。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件在二级或超二级结构在二级或超二级结构基础上形成的

54、特定区基础上形成的特定区域，参与蛋白质结构域，参与蛋白质结构的装配，并与蛋白质的装配，并与蛋白质的许多功能，如分子的许多功能，如分子间的识别和相互作用间的识别和相互作用等有密切关系等有密切关系折叠单位折叠单位 功能单位功能单位 运动性运动性结构域结构域蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件EFEF手手：钙钙结结合合蛋蛋白白中中，含含 有有 Helix-Loop-LelixHelix-Loop-Lelix结构结构锌锌指指：DNADNA结结合合蛋蛋白白中中，2 2个个HisHis、2 2个个CysCys结结合合一一个个ZnZn亮亮氨氨酸酸拉拉链链：DNADNA结结合合蛋蛋白白

55、中中，由由亮亮氨氨酸酸侧侧链链形形成的拉链式结构成的拉链式结构蛋白质的结构功能及分离纯化课件七七球状蛋白质与三级结构球状蛋白质与三级结构三级结构是由一三级结构是由一个已经具有了个已经具有了某些某些 -螺旋和螺旋和/或或折叠区折叠区的多肽链折叠的多肽链折叠成一个紧密包成一个紧密包裹的、几乎成裹的、几乎成球形的空间结球形的空间结构，或称为天构，或称为天然构象。然构象。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）球状蛋白质的分类（一）球状蛋白质的分类蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）球状蛋白质三维结构的特征（二）球状蛋白质三维结构的特征 1 含多种二级结构单元含多种二级结构单

56、元2 具有明显的折叠层次具有明显的折叠层次3紧密的球状或椭球状实体紧密的球状或椭球状实体4疏水侧链埋藏在分子内部，疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面亲水侧链暴露在分子表面5 表面的空穴是活性部位表面的空穴是活性部位蛋白质的结构功能及分离纯化课件三级结构的一个重要特点是在一级结构上三级结构的一个重要特点是在一级结构上离得远的氨基酸残基在三级结构中可以离得远的氨基酸残基在三级结构中可以靠的很近，它们的侧链可以发生相互作靠的很近，它们的侧链可以发生相互作用。二级结构是靠骨架中的酰胺和羰基用。二级结构是靠骨架中的酰胺和羰基之间形成的氢键维持稳定的，三级结构之间形成的氢键维持稳定的，三级结构

57、主要是靠氨基酸残基侧链之间的非共价主要是靠氨基酸残基侧链之间的非共价相互作用（主要是疏水作用）维持稳定相互作用（主要是疏水作用）维持稳定的，此外二硫键也是稳定三级结构的力。的，此外二硫键也是稳定三级结构的力。在一个蛋白质的三级结构中，二级结构在一个蛋白质的三级结构中，二级结构区之间是通过一些片段连接的。区之间是通过一些片段连接的。蛋白质的结构功能及分离纯化课件八八膜蛋白的结构膜蛋白的结构蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）膜内在蛋白（一）膜内在蛋白蛋白质的结构功能及分离纯化课件具有单个跨膜肽段的膜蛋白具有单个跨膜肽段的膜蛋白蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）脂锚定膜蛋白（二）脂锚定膜蛋白蛋白

58、质的结构功能及分离纯化课件具有多个跨膜肽段的膜蛋白具有多个跨膜肽段的膜蛋白蛋白质的结构功能及分离纯化课件九九蛋白质的折叠和结构预测蛋白质的折叠和结构预测蛋白质的变性蛋白质的变性氨基酸序列规定蛋白质的三维结构氨基酸序列规定蛋白质的三维结构蛋白质折叠蛋白质折叠蛋白质结构的预测蛋白质结构的预测蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）蛋白质的变性（一）蛋白质的变性环境的变化或是化环境的变化或是化学处理都会引起学处理都会引起蛋白质天然构象蛋白质天然构象的破坏，并伴随的破坏，并伴随着生物活性的丧着生物活性的丧失，这一过程称失，这一过程称为蛋白质变性为蛋白质变性（denaturation）。）。蛋白质的结构功能

59、及分离纯化课件变性因素：有几种方法可以用来使蛋白质变性，变性因素：有几种方法可以用来使蛋白质变性，例如提高或降低例如提高或降低pH；加热蛋白质溶液；苛刻的；加热蛋白质溶液；苛刻的高温条件，或是用强酸或强碱处理还可能导致高温条件，或是用强酸或强碱处理还可能导致蛋白质不可逆的失活。盐酸胍、尿素以及去污蛋白质不可逆的失活。盐酸胍、尿素以及去污剂也会引起蛋白质的变性。剂也会引起蛋白质的变性。变性表现：生物功能丧失，物理和化学性质发生变性表现：生物功能丧失，物理和化学性质发生改变。改变。变性机理：破坏次级键，但未改变一级结构。变性机理：破坏次级键，但未改变一级结构。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）氨

60、基酸序列规定蛋白质的（二）氨基酸序列规定蛋白质的三维结构三维结构除去变性因素后，在适宜条件下，变性的蛋白质可以从伸展态恢复到折叠态，并恢复全部的生物活性。这种现象称为蛋白复性（renaturation）。可逆变性充分证明了蛋白质的三级可逆变性充分证明了蛋白质的三级结构是由一级结构确定的。结构是由一级结构确定的。蛋白质的结构功能及分离纯化课件核糖核酸酶核糖核酸酶A的变性与复性实验的变性与复性实验最早研究蛋白质由变性状态经折叠再形成它的天然构象的是Christian B. Anfinsen等人。他们用含有2-巯基乙醇的8M脲的变性剂使RNase A变性，导致酶的三级结构和催化活性完全丧失，生成含有

61、8个巯基的多肽链。如果使变性的酶氧化和再折叠，8对巯基可以随机配对的话，那么就有可能生成105种二硫键不同的结构，但具有生物活性的只有一种。事实上当除去还原剂后，在8M脲的环境下氧化，形成的蛋白质中有99都含有不正确的二硫键，而且活性大约是原来酶活性的1。蛋白质的结构功能及分离纯化课件如果将还原剂和脲同时都除去，如果将还原剂和脲同时都除去，并且稀释还原的蛋白和将它并且稀释还原的蛋白和将它于生理于生理pH条件下暴露在空气条件下暴露在空气中，中，Rnase A会自发地获得会自发地获得它的天然构象，一套正确的它的天然构象，一套正确的二硫键和充分的酶活性。二硫键和充分的酶活性。实验表明正确的二硫键实验

62、表明正确的二硫键只有当蛋白质折叠成它的天只有当蛋白质折叠成它的天然构象后才能形成。如果向然构象后才能形成。如果向含有拼凑的不正确二硫键的含有拼凑的不正确二硫键的失活形式的蛋白质溶液中加失活形式的蛋白质溶液中加入少量的还原剂，然后缓慢入少量的还原剂，然后缓慢加热，也可以复性。加热，也可以复性。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）蛋白质折叠（三）蛋白质折叠蛋白质是沿着指定途径折叠成其天然构象的，蛋白质是沿着指定途径折叠成其天然构象的，而不是通过随机构象搜索碰到的。而不是通过随机构象搜索碰到的。蛋白质折叠始于局部二级结构的形成。即蛋白质折叠始于局部二级结构的形成。即,蛋蛋白质表现出一种层次折叠的方式

63、白质表现出一种层次折叠的方式:先形成小的先形成小的局部结构元件局部结构元件,然后聚集成较大的结构元件然后聚集成较大的结构元件,它它们之间在进一步形成更大的结构元件。们之间在进一步形成更大的结构元件。蛋白质二硫键异构酶（蛋白质二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase,PDI)和分子伴侣（和分子伴侣（molecularchaperones)有利于蛋白质体内折叠。有利于蛋白质体内折叠。蛋白质的结构功能及分离纯化课件分子伴侣的作用机制分子伴侣的作用机制分子伴侣是结合去折叠和部分折叠肽链的必需分子伴侣是结合去折叠和部分折叠肽链的必需蛋白质。蛋白质。Hsp70家族（家族（heats

64、hockprotein）陪伴蛋白（陪伴蛋白（chaperonin）蛋白质的结构功能及分离纯化课件与蛋白质折叠相关的疾病与蛋白质折叠相关的疾病淀粉样沉积（淀粉样沉积（amyloid deposit):amyloid deposit):以不溶性蛋以不溶性蛋白质在脑中或其它组织中的聚积为特征，从而白质在脑中或其它组织中的聚积为特征，从而导致某些神经疾病。导致某些神经疾病。阿尔茨海默病（阿尔茨海默病（Alzheimers diseaseAlzheimers disease）：由）：由于于-淀粉样蛋白在脑中形成纤维沉积或瘢块。淀粉样蛋白在脑中形成纤维沉积或瘢块。 -淀粉样蛋白是从其前体蛋白质上裂解下来淀

65、粉样蛋白是从其前体蛋白质上裂解下来的一个的一个4040个残基的片段。个残基的片段。蛋白质的非正常折叠是一类传染性疾病的致病蛋白质的非正常折叠是一类传染性疾病的致病因素：疯牛病（牛海鳗状脑病因素：疯牛病（牛海鳗状脑病bovine bovine spongiform encephalopathyspongiform encephalopathy），克），克- -雅病雅病（Greutzfeldt-Jacob diseaseGreutzfeldt-Jacob disease）及羊骚痒病）及羊骚痒病等。等。朊病毒蛋白质朊病毒蛋白质蛋白质的结构功能及分离纯化课件朊病毒蛋白质（朊病毒蛋白质（prion）Pr

66、ion:proteinaceousinfectiousparticle在正常脑组织中，主要是在正常脑组织中，主要是-螺旋构象，而螺旋构象，而在病脑中，变成在病脑中，变成-折叠和折叠和-螺旋的混螺旋的混合物，从而形成损坏脑细胞的不溶性纤合物，从而形成损坏脑细胞的不溶性纤维聚积物。维聚积物。 朊病毒的感染性是因为异常折叠的朊朊病毒的感染性是因为异常折叠的朊病毒蛋白质具有催化正常朊病毒蛋白质病毒蛋白质具有催化正常朊病毒蛋白质错误折叠的能力。错误折叠的能力。蛋白质的结构功能及分离纯化课件Prion生物学生物学专门研究生物界中一类蛋白质专门研究生物界中一类蛋白质,这类蛋白这类蛋白质至少存在两种构象体质至

67、少存在两种构象体,其中某个其中某个(或某或某些些)构象体不具有自我增殖构象体不具有自我增殖(self-propagating)能力能力,但必需至少存在一种但必需至少存在一种具有自我增殖能力的构象体具有自我增殖能力的构象体,这两类构象这两类构象体往往拥有不同的生理功能体往往拥有不同的生理功能.蛋白质也是一种遗传物质蛋白质也是一种遗传物质,蛋白质储存和蛋白质储存和传递的生物信息是通过其空间构象来实传递的生物信息是通过其空间构象来实现的现的.蛋白质的结构功能及分离纯化课件（四）（四）蛋白质结构的预测蛋白质结构的预测构象预测：构象预测：结构设计：蛋白质工程（结构设计：蛋白质工程（proteinengi

68、neering）分子设计的知识依据：分子设计的知识依据：1）蛋白质分子间的）蛋白质分子间的进化关系；进化关系；2）蛋白质一级结构与空间结）蛋白质一级结构与空间结构的关系；构的关系；3）蛋白质结果与功能的关系。）蛋白质结果与功能的关系。蛋白质的结构功能及分离纯化课件十十 亚基缔合和四级结构亚基缔合和四级结构蛋白质的结构功能及分离纯化课件亚基：具有独立的三级结构的多肽链亚基：具有独立的三级结构的多肽链四级结构：各亚基间相互作用并组装成具有生四级结构：各亚基间相互作用并组装成具有生物活性的特定构象物活性的特定构象四级结构的概念只适用于具有多个亚基的蛋白质，四级结构的概念只适用于具有多个亚基的蛋白质，

69、称为寡聚蛋白，所以四级结构指的是亚基的组称为寡聚蛋白，所以四级结构指的是亚基的组织。织。（一）有关四级结构的一些概念有关四级结构的一些概念蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质分子的缔合：蛋蛋白质分子的缔合：蛋白质在各结构层次上白质在各结构层次上结合，成为复杂的、结合，成为复杂的、更具功能的分子结构更具功能的分子结构形式形式蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）（二） 四级结构缔合的驱动力四级结构缔合的驱动力寡聚蛋白亚基之间是通过非共价键连接寡聚蛋白亚基之间是通过非共价键连接的，疏水相互作用是将亚基结合在一起的，疏水相互作用是将亚基结合在一起的主要的力，静电引力对于亚基的正确的主要的力，静电引力对

70、于亚基的正确排列也有贡献。排列也有贡献。疏水作用疏水作用极性基团之间的氢键和离子键极性基团之间的氢键和离子键二硫键二硫键蛋白质的结构功能及分离纯化课件1 1、同多聚与杂多聚、同多聚与杂多聚2 2、同种缔合与异种缔合、同种缔合与异种缔合同种缔合：亚基间相互作用的表面是相同的，形成的同种缔合：亚基间相互作用的表面是相同的，形成的结构是对称的结构是对称的异种缔合：亚基间相互作用的表面是不同的，形成线异种缔合：亚基间相互作用的表面是不同的，形成线形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外壳。形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外壳。（三）亚基之间的缔合方式（三）亚基之间的缔合方式蛋白质的结构功能及分离纯化课件（四

71、）四级缔合在结构和功能上（四）四级缔合在结构和功能上的优越性的优越性1、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性2、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。3、提高基因编码的效率和经济性。、提高基因编码的效率和经济性。4、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。5、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。6、适当降低溶液渗透压。、适当降低溶液渗透压。7、具有协同效应和别构效应，实现对酶活性的、具有协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节。调节。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（五

72、）（五） 寡聚蛋白与别构效应寡聚蛋白与别构效应别构蛋白：别构蛋白：除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。白质构象的变化而相互作用。别构效应：别构效应：别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位产生的影响。质的构象，从而对活

73、性部位产生的影响。蛋白质的结构功能及分离纯化课件同促效应（同位效应）：同促效应（同位效应）：一种配体的的结合对于其它部位结合后续同种配一种配体的的结合对于其它部位结合后续同种配体的能力的影响，包括（正）协同效应和负协体的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同效应。同促效应一般是指活性部位之间的效应。同促效同促效应一般是指活性部位之间的效应。同促效应是别构效应的基础，别构效应可以看成应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对是对同位效应的一种修饰同位效应的一种修饰异促效应（异位效应）：异促效应（异位效应）：就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性

74、部位的影响。部位的影响。蛋白质的结构功能及分离纯化课件正正协协同同效效性性：一一种种配配基基的的结结合合促促进进后后续续配配基基的的结合，结合，S S型配体结合曲线。型配体结合曲线。负负协协同同效效性性：一一种种配配基基的的结结合合抑抑制制促促进进后后续续配配基的结合。基的结合。正正效效应应物物：促促进进活活性性部部位位与与配配基基结结合合的的别别构构效效应物。应物。负负效效应应物物：抑抑制制活活性性部部位位与与配配基基结结合合的的别别构构效效应物。应物。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次一级结构：多肽链上的氨基酸排列顺序一级结构：多肽链上的氨基酸排列顺序 二级结构

75、：多肽链主链骨架的局部空间结构二级结构：多肽链主链骨架的局部空间结构 超二级结构：二级结构单位的集合体超二级结构：二级结构单位的集合体结构域：多肽链上可以明显区分的球状区域结构域：多肽链上可以明显区分的球状区域 三级结构：整个多肽链上所有原子的空间排布三级结构：整个多肽链上所有原子的空间排布四级结构：由球状亚基或分子缔合而成的聚合体结构四级结构：由球状亚基或分子缔合而成的聚合体结构蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件第6章蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系蛋白质的结构功能及分离纯化课件一、一、肌红蛋白的结构与功能肌红蛋白的结构与功

76、能哺乳动物肌肉中储氧的哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。蛋白质。由一条多肽链（珠蛋白）由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组和一个血红素辅基组成。成。球状分子，单结构域。球状分子，单结构域。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）（一） 肌红蛋白的三级结构肌红蛋白的三级结构8 8段直的段直的-螺旋组成，分螺旋组成，分别命名为别命名为A A、B B、CHCH，拐弯处是由拐弯处是由1-81-8个氨基酸个氨基酸组成的松散肽段（无规组成的松散肽段（无规卷曲）。卷曲）。4 4个个ProPro残基各自处在一个残基各自处在一个拐弯处，另外拐弯处，另外4 4个是个是SerSer、ThrThr、AsnAsn、IleIl

77、e。血红素辅基血红素辅基 ，扁平状，结，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。个洞穴内。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）辅基血红素（二）辅基血红素蛋白质的结构功能及分离纯化课件Fe原子的原子的6个配位键个配位键蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）O2与肌红蛋白的结合肌红蛋白的结合蛋白质的结构功能及分离纯化课件（四）（四）O2的结合改变的结合改变肌红蛋白的构象肌红蛋白的构象蛋白质的结构功能及分离纯化课件(五五)肌红蛋白的氧结合曲线肌红蛋白的氧结合曲线氧饱和度：氧饱和度：蛋白质的结构功能及分离纯化课件Y=0.5Y=0.5时时 ， 肌肌 红红 蛋蛋 白白 的的 一一 半半

78、被被 饱饱 和和 ， POPO2 2=K =K = = P P5050=2torr=2torr解解离离常常数数K K也也称称为为P P5050，即即肌肌红红蛋蛋白白一一半半被被饱饱和和时时的的氧氧压。压。 蛋白质的结构功能及分离纯化课件二二血红蛋白的结构与功能血红蛋白的结构与功能 在在血血液液中中结结合合并并转运转运O O2 2蛋白质的结构功能及分离纯化课件(一一)血红蛋白的结构血红蛋白的结构1血红蛋白的亚基组成血红蛋白的亚基组成4个个多多肽肽亚亚基基，每每个个亚亚基基上上都都有有一一个个血血红红素素基基和和一一个个氧氧结合部位。结合部位。成人：成人：HbA：2298%，HbA2：222%胎儿

79、：胎儿：HbF22早期胚胎：早期胚胎：22蛋白质的结构功能及分离纯化课件2血红蛋白的三级结构血红蛋白的三级结构接接近近于于球球体体，4个个亚亚基基分分别别在在四四面面体体的的四四个个角角上上，每每个个亚亚基基上上有有一个血红素辅基。一个血红素辅基。、链链的的三三级级结结构构与与肌肌红蛋白的很相似，红蛋白的很相似，蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）O2结合结合引起的血红蛋白构的血红蛋白构象变化象变化氧合作用显著改变血红蛋白的四级结构氧合作用显著改变血红蛋白的四级结构血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换的转换氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同氧合血红蛋白和去

80、氧血红蛋白代表不同的构象态的构象态蛋白质的结构功能及分离纯化课件血红蛋白四级结构血红蛋白四级结构蛋白质的结构功能及分离纯化课件存在于四条亚基间的存在于四条亚基间的8对作用力对作用力蛋白质的结构功能及分离纯化课件去氧状态与氧合状态构象比较去氧状态与氧合状态构象比较蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）（三）血红蛋白的氧合曲线血红蛋白的氧合曲线蛋白质的结构功能及分离纯化课件四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是线是S型曲线型曲线蛋白质的结构功能及分离纯化课件血红蛋白血红蛋白P P5050

81、=26 torr=26 torr，肺肺泡泡氧氧压压：PoPo2 2 =100 =100 torr torr ， Y=0.97Y=0.97 肌肌肉肉毛毛细细血血管管：PoPo2 2 =20 =20 torrtorr， Y=0.25 Y=0.25释释放放 氧氧： Y=0.97Y=0.970.25=0.720.25=0.72肌红蛋白（无协同效应）：肌红蛋白（无协同效应）：YY不足不足0.10.1协协同同效效应应可可增增加加血血红红蛋蛋白白在在肌肌肉肉中中的的卸卸氧氧量量，使使它它能能有有效效地地输输送氧气。送氧气。蛋白质的结构功能及分离纯化课件S型曲线的生理意义型曲线的生理意义S型曲线的上部较平坦，

82、型曲线的上部较平坦，说明在肺部，氧分压虽有说明在肺部，氧分压虽有较大的变化，但血液的氧较大的变化，但血液的氧饱和度没有多大，即存在饱和度没有多大，即存在较多的氧合血红蛋白，因较多的氧合血红蛋白，因为，在肺部，要求血液中为，在肺部，要求血液中所有的脱氧血红蛋白尽量所有的脱氧血红蛋白尽量地结合更多的氧。地结合更多的氧。S型曲线的中段坡度较大，型曲线的中段坡度较大，说明在肌肉中，氧分压即说明在肌肉中，氧分压即使有很小的下降，血液中使有很小的下降，血液中的氧饱和度亦有较大的下的氧饱和度亦有较大的下降，即在肌肉中，氧合血降，即在肌肉中，氧合血红蛋白能释放较多的氧。红蛋白能释放较多的氧。S型曲线恰好满足了

83、肌肉型曲线恰好满足了肌肉等组织的生理需要。等组织的生理需要。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（四）（四）H H+ +、CO2和和BPG对血红蛋白结合对血红蛋白结合O2的影响的影响血血红红蛋蛋白白上上有有CO2和和BPG结结合合部部位位，因因此此，血血红红蛋白还能运输蛋白还能运输CO2。波波耳耳效效应应：增增加加CO2的的浓浓度度、降降低低pH能能显显著著提提高高血血红红蛋蛋白白亚亚基基间间的的协协同同效效应应，降降低低血血红红蛋蛋白白对对O2的的亲亲和和力力，促促进进O2的的释释放放，反反之之，高高浓浓度度的的O2也能促使血红蛋白释放也能促使血红蛋白释放H+和和CO2。蛋白质的结构功能及分离纯化

84、课件1波尔效应波尔效应H H+ +和和CO2促进促进O2的释放的释放H H+ +的结合部位：的结合部位：ValVal的氨基的氨基 His His的咪唑基的咪唑基COCO2 2的结合部位：的结合部位：4 4个亚基的个亚基的N N末端的末端的氨基氨基它们的结合，有助它们的结合，有助于血红蛋白脱氧构于血红蛋白脱氧构象的稳定象的稳定蛋白质的结构功能及分离纯化课件波尔效应的生理意义波尔效应的生理意义血液流经组织时，由于组织血液流经组织时，由于组织的的pHpH值较低，值较低， CO CO2 2分压较高，分压较高，高浓度的高浓度的H H+ +和和COCO2 2有利于有利于氧合氧合血红蛋白分子释放血红蛋白分子

85、释放O O2 2，使组，使组织能比单纯的氧分压下降时织能比单纯的氧分压下降时获得更多的获得更多的O O2 2。而且，而且，O O2 2的的释放又促进了释放又促进了脱氧血红蛋白脱氧血红蛋白分子与分子与H H+ +和和COCO2 2的结合。的结合。当血液流经肺部时，由于肺当血液流经肺部时，由于肺气泡的气泡的O O2 2分压较分压较高，促进脱高，促进脱氧血红蛋白分子释放氧血红蛋白分子释放H H+ +和和COCO2 2。而且，而且， CO CO2 2的呼出，有利于的呼出，有利于氧合血红蛋白的生成。氧合血红蛋白的生成。蛋白质的结构功能及分离纯化课件2BPG降低血红蛋白对降低血红蛋白对O2的亲和力的亲和力

86、BPG BPG （2,3-2,3-二二磷磷酸酸甘甘油油酸酸）是是血血红红蛋蛋白白的的负负效效应物。应物。BPGBPG通通过过与与两两个个亚亚基基形形成成盐盐键键稳稳定定了了血血红红蛋蛋白白的的脱脱氧氧态态的的构构象象，因因而而降降低低脱脱氧氧血血红红蛋蛋白白的的氧氧亲和力。亲和力。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件BPG的影响的影响无无BPGBPG时，时，P P5050=1 torr=1 torr，BPG=4.5mMBPG=4.5mM时，时，P P5050=26 torr=26 torrBPGBPG进一步提高了血红蛋白进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，的输氧效率

87、。在肺部，P PO2O2超过超过100torr100torr，因此，因此，即使没有即使没有BPGBPG，血红蛋白，血红蛋白也能被饱和，在组织中，也能被饱和，在组织中，P PO2O2低，低，BPGBPG降低血红蛋白降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。蛋白的卸氧量。蛋白质的结构功能及分离纯化课件红细胞中的红细胞中的BPGBPG浓度的变化是调节血红蛋浓度的变化是调节血红蛋白分子对白分子对O2O2的亲和力的重要因素。的亲和力的重要因素。（1 1）高高山山适适应应和和肺肺气气肿肿的的生生理理补补偿偿变变化化：BPGBPG升高。升高。（2 2）血库储血时加入肌苷可转变为）血库

88、储血时加入肌苷可转变为BPGBPG。蛋白质的结构功能及分离纯化课件三三血红蛋白分子病血红蛋白分子病蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）分子病是遗传的（一）分子病是遗传的分子病：由构成生物机体基本物质分子一级结分子病：由构成生物机体基本物质分子一级结构发生变异而引起的疾病。这种变异来源于遗构发生变异而引起的疾病。这种变异来源于遗传物质基因的突变，因此是遗传性的。传物质基因的突变，因此是遗传性的。个体差异：同种生物来源的一种蛋白质，有时个体差异：同种生物来源的一种蛋白质，有时存在两种或两种以上的形式，它们的氨基酸序存在两种或两种以上的形式，它们的氨基酸序列通常只有一二个残基的差异。列通常只有一二个

89、残基的差异。蛋白质的结构功能及分离纯化课件氨基酸的改变与异常血红蛋白氨基酸的改变与异常血红蛋白蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）镰刀状细胞贫血病（二）镰刀状细胞贫血病血红蛋白病：血红蛋白病：由于由于或或链发生了变化。链发生了变化。蛋白质的结构功能及分离纯化课件GlutoVal蛋白质的结构功能及分离纯化课件sticklhydrophobicpatch蛋白质的结构功能及分离纯化课件longfibers蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）地中海贫血（三）地中海贫血缺少或或链。原因：缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因相关基因发生了无义突变或移码突变，产生不正确的链在编码区外的突变导致转录被阻断，或前

90、体mRNA发生不正确加工蛋白质的结构功能及分离纯化课件四四免疫系统和免疫球蛋白免疫系统和免疫球蛋白蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）相关概念1 1 抗原抗原抗抗原原是是指指进进入入异异体体机机体体后后，能能致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞产产生生特特异异抗抗体体，并并能能与与抗抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。抗原性包括免疫原性和抗原特异性。抗原性包括免疫原性和抗原特异性。免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。抗原特异性是指与抗体特异结合的

91、能力。抗抗原原决决定定簇簇：抗抗原原性性由由抗抗原原分分子子表表面面特特殊殊的的化化学学基基团团决决定定（一一级级结结构构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。抗原决定簇的作用：抗原决定簇的作用：被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。与相应抗体的与相应抗体的FabFab结合。结合。蛋白质的结构功能及分离纯化课件2 2 抗体抗体 在在对对抗抗原原刺刺激激的的免免疫疫应应答答中中，B B淋淋巴巴细细胞胞产产生生的的一一类类糖糖蛋蛋白白，它它是是能能与与相相应应

92、抗抗原原特特异异性性结结合合、产产生生免免疫疫反反应应的的球球蛋蛋白白，称称免疫球蛋白。免疫球蛋白。抗体具有两个特点：抗体具有两个特点：高度特异性高度特异性多样性多样性几几乎乎所所有有的的外外源源蛋蛋白白都都能能诱诱导导相相应应的的特特异异性性抗抗体体，人人体体内内任任一一时刻约有时刻约有1000010000种抗体存在。种抗体存在。蛋白质的结构功能及分离纯化课件3 3 抗原抗体反应抗原抗体反应抗体是抗体是2 2价的，抗原是多价的。价的，抗原是多价的。抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。 抗抗原原一一抗抗体体比比例例适适中中，形形成成网

93、网状状的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物，不不可溶。可溶。 抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。 原抗体反应的条件：原抗体反应的条件：抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。二二者者各各有有对对应应的的化化学学基基团团，通通过过作作用用力力使使二二者者结结合合（离离子子键键、氢键氢键 等）等）蛋白质的结构功能及分离纯化课件免疫复合物的形成和沉淀免疫复合物的形成和沉淀蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）免疫球蛋白的结构与类别1免疫球蛋白的结构免疫球蛋白是一组即互相联系、免疫球蛋白是一组即互相联系、有具有巨大多样性的蛋白质。有具有巨大多样性的蛋

94、白质。所有的免疫球蛋白都至少含所有的免疫球蛋白都至少含有有4个亚基：两条轻链（个亚基：两条轻链（L）和两条重链（和两条重链（H），（），（LH）2。相同的两条重链通过链间的相同的两条重链通过链间的二硫键连接呈二硫键连接呈Y型，相同的两型，相同的两条轻链也分别通过链间的二条轻链也分别通过链间的二硫键与重链的硫键与重链的Y臂相连。臂相连。蛋白质的结构功能及分离纯化课件可变区和稳定区可变区和稳定区在不同的抗体分子中，轻链和重链的在不同的抗体分子中，轻链和重链的N-端区有着不同的氨基酸序列，称为可端区有着不同的氨基酸序列，称为可变区（变区（V区，区，variableregion）；而在）；而在C-端区

95、，其氨基酸序列较为恒定，称端区，其氨基酸序列较为恒定，称为稳定区（为稳定区（C区，区，constantregion)。可变区的可变性主要定位于每条链可变区的可变性主要定位于每条链的三个超变区（的三个超变区（hypervariableregion），在三维结构中，轻链和重），在三维结构中，轻链和重链的超变部分在一起成环，形成跨院链的超变部分在一起成环，形成跨院结合部位。每一可变区的余下部分保结合部位。每一可变区的余下部分保持着稳定的序列，一般不直接与抗原持着稳定的序列，一般不直接与抗原相接触，称为框架区（相接触，称为框架区（frameworkregion）.蛋白质的结构功能及分离纯化课件轻链的结

96、构轻链的结构蛋白质的结构功能及分离纯化课件免疫球蛋白的结构域每一条轻链含有两个重每一条轻链含有两个重复性的片段，约有复性的片段，约有110个氨个氨基酸。它们折叠成两个致基酸。它们折叠成两个致密的三维结构域，一个相密的三维结构域，一个相当于轻链的可变区，另一当于轻链的可变区，另一结构域相当于稳定区。每结构域相当于稳定区。每一条重链含有四个重复性一条重链含有四个重复性的片段，约有的片段，约有110个氨基酸。个氨基酸。它们折叠成四个致密的三它们折叠成四个致密的三维结构域，一个作为可变维结构域，一个作为可变区，另三个结构域相当于区，另三个结构域相当于稳定区。稳定区。蛋白质的结构功能及分离纯化课件Fab

97、和和Fc片段片段用木瓜蛋白酶酶解抗体，可用木瓜蛋白酶酶解抗体，可产生两个产生两个Fab片段和一个片段和一个Fc片片段。段。Fab（fragmentantigenbinding):仅有一个抗原结合部仅有一个抗原结合部位，不能对抗原发生交联。位，不能对抗原发生交联。Fc（fragmentcrystallize）：）：有效应物部位，能引发抗原有效应物部位，能引发抗原的破坏。的破坏。F（ab）2：用胃蛋白酶水解：用胃蛋白酶水解抗体释放出的片段，它有两抗体释放出的片段，它有两个抗原结合部位，仍能够与个抗原结合部位，仍能够与抗原交联。抗原交联。蛋白质的结构功能及分离纯化课件2免疫球蛋白的免疫球蛋白的分类分

98、类5类不同的疫球蛋类不同的疫球蛋白家族的区别白家族的区别在于它们含有在于它们含有的重链的种类的重链的种类不同，有些情不同，有些情况下它们的亚况下它们的亚基结构也不同。基结构也不同。蛋白质的结构功能及分离纯化课件IgM以五聚体形以五聚体形式存在，它与式存在，它与入侵的微生物入侵的微生物结合并活化补结合并活化补体，杀害并吞体，杀害并吞噬细胞。是动噬细胞。是动物对一新的抗物对一新的抗原作出应答时，原作出应答时，第一个产生的第一个产生的免疫球蛋白。免疫球蛋白。蛋白质的结构功能及分离纯化课件IgG能够激化补能够激化补体并启动巨噬体并启动巨噬细胞。是在初细胞。是在初次免疫应答后，次免疫应答后，特别是在再次

99、特别是在再次免疫应答后血免疫应答后血流中的主要免流中的主要免疫球蛋白疫球蛋白蛋白质的结构功能及分离纯化课件IgG是唯一能够通过胎盘是唯一能够通过胎盘的免疫球蛋白，从而的免疫球蛋白，从而为胎儿提供免疫防护。为胎儿提供免疫防护。它还可分泌进入母亲它还可分泌进入母亲乳汁，由新生动物自乳汁，由新生动物自肠道进入血流，在胎肠道进入血流，在胎儿出生后继续提供防儿出生后继续提供防护。由于初乳中含有护。由于初乳中含有一种抗胰蛋白酶因子，一种抗胰蛋白酶因子，可保护免疫球蛋白不可保护免疫球蛋白不被分解，即以大分子被分解，即以大分子被吸收。被吸收。蛋白质的结构功能及分离纯化课件IgA是机体分泌液中的是机体分泌液中的

100、主要免疫球蛋白，是主要免疫球蛋白，是防止这些部位受侵染防止这些部位受侵染的一线防卫。血清中的一线防卫。血清中的的IgA主要是单体，主要是单体，有少量二聚体，也是有少量二聚体，也是通过通过J链联结两个单链联结两个单体的。体的。蛋白质的结构功能及分离纯化课件分泌型分泌型IgA在唾液、眼泪、初乳及鼻、在唾液、眼泪、初乳及鼻、支气管和胃肠道的分泌支气管和胃肠道的分泌液中，有大量的分泌型液中，有大量的分泌型IgA。它由两个单体。它由两个单体IgA、一条一条J链及一个分泌成链及一个分泌成分（又叫分泌片，分（又叫分泌片，SC）所组成。分泌型所组成。分泌型IgA能能通过细胞膜进入外分泌通过细胞膜进入外分泌腺的

101、管腔，具有抗细菌腺的管腔，具有抗细菌和病毒的作用，并具有和病毒的作用，并具有抗蛋白水解酶的作用。抗蛋白水解酶的作用。蛋白质的结构功能及分离纯化课件IgE产生于组织，它产生于组织，它在组织中与抗原结合，在组织中与抗原结合，刺激肥大细胞释放出刺激肥大细胞释放出大范围的介质。这些大范围的介质。这些介质随后活化白细胞，介质随后活化白细胞，可杀灭各种类型的寄可杀灭各种类型的寄生虫。但也可能引起生虫。但也可能引起过敏反应的临床症状。过敏反应的临床症状。蛋白质的结构功能及分离纯化课件IgD存在于存在于B淋巴细胞淋巴细胞的表面，在各种体液的表面，在各种体液中也有痕量存在。中也有痕量存在。蛋白质的结构功能及分离

102、纯化课件（三）免疫球蛋白的生物学功能结合抗原结合抗原绝大多数抗绝大多数抗体是识别蛋白体是识别蛋白质中的特殊表质中的特殊表面结构，而不面结构，而不是识别它的特是识别它的特定氨基酸序列。定氨基酸序列。蛋白质的结构功能及分离纯化课件抗原通过抗体交联抗原通过抗体交联蛋白质的结构功能及分离纯化课件激活补体激活补体补体是由补体是由30多种相互多种相互作用的可溶性蛋白质组作用的可溶性蛋白质组成。在正常生理情况下，成。在正常生理情况下，它们以非活化形式在血它们以非活化形式在血液和细胞外液中环流，液和细胞外液中环流，当受到某种激活剂作用当受到某种激活剂作用后，即出现一系列级联后，即出现一系列级联反应，各种补体分

103、子依反应，各种补体分子依次活化，最终产生溶细次活化，最终产生溶细胞性效应。胞性效应。蛋白质的结构功能及分离纯化课件C1与抗体的结合与抗体的结合蛋白质的结构功能及分离纯化课件抗体多样性和自身免疫病抗体多样性和自身免疫病抗体多样性：几乎所有大分子都具有抗抗体多样性：几乎所有大分子都具有抗原性，免疫系统有能力产生几十亿的不原性，免疫系统有能力产生几十亿的不同抗体。但免疫球蛋白基因的数量远远同抗体。但免疫球蛋白基因的数量远远小于观察到的抗体多样性水平，抗体序小于观察到的抗体多样性水平，抗体序列的多样性来源于列的多样性来源于B细胞发育过程中的基细胞发育过程中的基因变化。因变化。自身免疫病（自身免疫病（a

104、utoimmunedisease）：由）：由于免疫系统失去对自身抗原的耐受性。于免疫系统失去对自身抗原的耐受性。蛋白质的结构功能及分离纯化课件免疫定位法免疫定位法酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（ELISAELISA）WesternWestern印迹印迹(Western blotting)(Western blotting)（四）（四） 基于抗体基于抗体- -抗原相互作用抗原相互作用的生化分析方法的生化分析方法蛋白质的结构功能及分离纯化课件1免疫定位法免疫定位法基于抗体对基于抗体对表位的高特异表位的高特异性，将一抗体性，将一抗体作用于特定的作用于特定的蛋白质抗原，蛋白质抗原，用免疫荧光光用免

105、疫荧光光学显微术或免学显微术或免疫电镜术可测疫电镜术可测定在某一细胞定在某一细胞中的抗原位置。中的抗原位置。蛋白质的结构功能及分离纯化课件2酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法（ELISA）先将抗体或抗原吸附于固相先将抗体或抗原吸附于固相载体的表面，与待测样品载体的表面，与待测样品进行抗原抗体反应后，再进行抗原抗体反应后，再加入耦联了某种酶的抗体，加入耦联了某种酶的抗体，使酶也连接在固相载体的使酶也连接在固相载体的表面，洗涤除去未结合的表面，洗涤除去未结合的酶标记抗体，加入该酶的酶标记抗体，加入该酶的显色或荧光反应底物，由显色或荧光反应底物，由于底物被酶作用而分解，于底物被酶作用而分解，使颜色

106、发生变化或发出荧使颜色发生变化或发出荧光。根据颜色或荧光变化光。根据颜色或荧光变化的程度，就可判断目的抗的程度，就可判断目的抗原的浓度。原的浓度。蛋白质的结构功能及分离纯化课件化学发光的一般原理图化学发光的一般原理图底物底物产物产物酶酶二抗二抗一抗一抗抗原抗原蛋白质的结构功能及分离纯化课件3免疫印迹法（免疫印迹法（Westernblotting）先将蛋白质样品用单向的先将蛋白质样品用单向的SDS-PAGE或双向的聚丙或双向的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再烯酰胺凝胶电泳分离，再将分离出的蛋白质转移将分离出的蛋白质转移（印迹）到硝化纤维或尼（印迹）到硝化纤维或尼龙薄片上，把它与此种蛋龙薄片上，把它与此

107、种蛋白质的特异抗体共同保温，白质的特异抗体共同保温，然后再洗去未结合上的抗然后再洗去未结合上的抗体，对凝胶上面与抗体结体，对凝胶上面与抗体结合的蛋白质进行测定。该合的蛋白质进行测定。该法可用于测定混合物中的法可用于测定混合物中的一种或几种抗原。一种或几种抗原。蛋白质的结构功能及分离纯化课件五五肌球蛋白丝、肌动蛋白丝肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩与肌肉收缩蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）（一）骨骼肌组织骨骼肌组织肌肉由肌纤维束组成肌肉由肌纤维束组成每条肌纤维都是长而每条肌纤维都是长而细的多核细胞细的多核细胞,这种这种细胞与肌肉的长度相细胞与肌肉的长度相当当肌纤维含有成束的侧肌纤维含有成束的

108、侧向排列的肌原纤维向排列的肌原纤维肌原纤维由交替的成肌原纤维由交替的成束的粗丝和细丝组成束的粗丝和细丝组成蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）（二）A带与带与I带带肌原纤维（肌原纤维（myofibril）的功能单位是肌节的功能单位是肌节（sarcomere），在肌），在肌节中是相互交替的暗节中是相互交替的暗的的A带和亮的带和亮的I带，在带，在两种带中间依次有两种带中间依次有H区区和和Z线。线。A带含有粗丝带含有粗丝,I带含有细带含有细丝丝.两套丝通过互相重两套丝通过互相重叠的肌横桥相连叠的肌横桥相连.蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）（三）粗丝和细丝粗丝和细丝粗丝（粗丝（thickfilam

109、ent）：含）：含有肌球蛋白（有肌球蛋白（myosin）,只只存在于存在于A带带细丝（细丝（thinfilament）：含）：含有肌动蛋白（有肌动蛋白（actin）、原）、原肌球蛋白（肌球蛋白（tropomyosin）和肌钙蛋白（和肌钙蛋白（troponin）蛋白质的结构功能及分离纯化课件1肌球蛋白肌球蛋白分子量约为分子量约为540000，由，由6个多肽链组成个多肽链组成,包括两条重包括两条重的多肽链和两对轻链，排布成一双头球形区与两的多肽链和两对轻链，排布成一双头球形区与两股缠绕着的股缠绕着的-螺旋相连。螺旋相连。蛋白质的结构功能及分离纯化课件粗丝的结构粗丝的结构在生理的离子强度和在生理的离

110、子强度和pH的溶液中，肌球蛋白自发的溶液中，肌球蛋白自发地聚合成粗丝（尾部伸向中央聚合成粗丝的主轴，地聚合成粗丝（尾部伸向中央聚合成粗丝的主轴，头部向两侧凸出形成横桥）头部向两侧凸出形成横桥）头部具有头部具有ATP酶活性酶活性头部与细丝联结头部与细丝联结蛋白质的结构功能及分离纯化课件2肌动蛋白肌动蛋白分子量为分子量为42000，成球形，单体称为，成球形，单体称为G-肌动蛋白。肌动蛋白。在生理条件下，许多单体聚合形成纤维状，在生理条件下，许多单体聚合形成纤维状，称为称为F-肌动蛋白，是细丝的基本结构。肌动蛋白，是细丝的基本结构。蛋白质的结构功能及分离纯化课件细丝的结构细丝的结构由两条肌动蛋白单体

111、聚合形成的丝相互盘绕形由两条肌动蛋白单体聚合形成的丝相互盘绕形成螺旋形，其上结合原肌球蛋白和肌钙蛋白。成螺旋形，其上结合原肌球蛋白和肌钙蛋白。蛋白质的结构功能及分离纯化课件3肌球蛋白与肌动蛋白相互作用模型肌球蛋白与肌动蛋白相互作用模型每一个肌动蛋白单每一个肌动蛋白单体可与一个肌球蛋体可与一个肌球蛋白头部结合白头部结合.原肌原肌球蛋白球蛋白-肌钙蛋白肌钙蛋白复合物通过控制粗复合物通过控制粗丝上肌球蛋白头部丝上肌球蛋白头部接近处于细丝的肌接近处于细丝的肌动蛋白上的结合部动蛋白上的结合部位来控制肌肉的收位来控制肌肉的收缩缩.蛋白质的结构功能及分离纯化课件（四）（四）肌肉收缩的机制肌肉收缩的机制蛋白质

112、的结构功能及分离纯化课件1肌原纤维的收缩肌原纤维的收缩-肌丝滑动模肌丝滑动模型型当肌肉收缩时，粗当肌肉收缩时，粗丝和细丝相对滑丝和细丝相对滑动（动（Slideoveroneanother），），使肌节的长度缩使肌节的长度缩短短,而粗丝与细而粗丝与细丝的长度不变丝的长度不变.蛋白质的结构功能及分离纯化课件2肌肉收缩中力的产生肌肉收缩中力的产生肌肉收缩的力量来自于肌球蛋白、肌动蛋白和肌肉收缩的力量来自于肌球蛋白、肌动蛋白和ATP之间的相互作用。之间的相互作用。蛋白质的结构功能及分离纯化课件肌肌肉肉收收缩缩的的机机制制图图示示蛋白质的结构功能及分离纯化课件3肌肉收缩的调控肌肉收缩的调控在生理条件下，

113、神经是通过在生理条件下，神经是通过Ca2+调控肌肉收缩的，调控肌肉收缩的，而而Ca2+则通过原肌球蛋白和肌钙蛋白实现其调控则通过原肌球蛋白和肌钙蛋白实现其调控作用作用(肌钙蛋白中的一个亚基肌钙蛋白中的一个亚基-肌钙蛋白肌钙蛋白C对对Ca2+敏感敏感)。在没有在没有Ca2+时，肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用被时，肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用被原肌球蛋白和肌钙蛋白所抑制，因为原肌球蛋白原肌球蛋白和肌钙蛋白所抑制，因为原肌球蛋白阻碍了肌球蛋白的头部与肌动蛋白的接触。阻碍了肌球蛋白的头部与肌动蛋白的接触。神经兴奋能触发肌浆网上的钙泵释放神经兴奋能触发肌浆网上的钙泵释放Ca2+，释放的，释放的Ca2+与肌

114、钙蛋白中的成分结合并引起肌钙蛋白的与肌钙蛋白中的成分结合并引起肌钙蛋白的构象发生改变，使原肌球蛋白移入细丝螺旋形槽构象发生改变，使原肌球蛋白移入细丝螺旋形槽中，从而使肌球蛋白的头部得以与肌动蛋白接触，中，从而使肌球蛋白的头部得以与肌动蛋白接触，于是发生于是发生ATP的水解和肌肉收缩。的水解和肌肉收缩。蛋白质的结构功能及分离纯化课件4ATP的供给的供给来源：酵解作用、三羧酸循环和氧化磷酸化来源：酵解作用、三羧酸循环和氧化磷酸化储备：磷酸肌酸。在肌肉静止时，储备：磷酸肌酸。在肌肉静止时，ATP将磷酸基转将磷酸基转给肌酸，生成磷酸肌酸储备；当肌肉收缩时，磷给肌酸，生成磷酸肌酸储备；当肌肉收缩时，磷酸

115、肌酸又将磷酸基转给酸肌酸又将磷酸基转给ADP以生成以生成ATP。当肌肉持续活动时，磷酸肌酸很快被消耗，当肌肉持续活动时，磷酸肌酸很快被消耗，ATP含含量下降，量下降，ADP和磷酸基的浓度上升，同时和磷酸基的浓度上升，同时AMP的浓度也上升，这些变化促进了酵解作用、三羧的浓度也上升，这些变化促进了酵解作用、三羧酸循环和氧化磷酸化，产生酸循环和氧化磷酸化，产生ATP。蛋白质的结构功能及分离纯化课件第第7章章蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的结构功能及分离纯化课件一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质两性解离两性解离等电点等电点等离子点等离子点蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋

116、白质的两性解离和等电点蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件例：有一个蛋白质，其侧链上有羧基例：有一个蛋白质，其侧链上有羧基30个个(pK=4.3),咪咪唑基唑基10个个(pK=7.0),e-氨基氨基15个个(pK=10),设设C-末端的末端的a-羧基的羧基的pK=3.5，N-末端的末端的a-氨基的氨基的pK=9.5，计算，计算此蛋白质的等电点此蛋白质的等电点解：等电点是净电荷为零时的分子状态。由于在该蛋解：等电点是净电荷为零时的分子状态。由于在该蛋白质中最多可以带有白质中最多可以带有30+1个负电荷，个负电荷，15+

117、10+1个正电个正电荷，两者相差荷，两者相差5个电荷。要使正负电荷相等，只能让个电荷。要使正负电荷相等，只能让30个羧基个羧基(pK=4.3)少带少带5个负电，即有个负电，即有25个羧基解离，个羧基解离，有有5个羧基不解离。个羧基不解离。根据根据pH=pK+lg(碱碱/酸）酸）则则pH=4.3+lg(25/5）=5.0蛋白质的结构功能及分离纯化课件二、蛋白质分子的大小与形状二、蛋白质分子的大小与形状根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相

118、对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量测定相对分子质量蛋白质分子的形状蛋白质分子的形状蛋白质的结构功能及分离纯化课件三、蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀稳定蛋白质亲水胶体的两个因素：稳定蛋白质亲水胶体的两个因素：水化层：蛋白质中的亲水基团多位于颗粒水化层：蛋白质中的亲水基团多位于颗粒表面，在水溶液中能与水起水合作用，在表面，在水溶液中能与水起水合作用，在蛋白质分子周围形成一个较稳定的水化层，蛋白质分子周围形成一个较稳定的水化层，使蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质。使蛋白质水溶液具有亲

119、水胶体的性质。电荷：蛋白质分子在一定电荷：蛋白质分子在一定pH溶液中带有相溶液中带有相同电荷，同种电荷相互排斥，使蛋白质之同电荷，同种电荷相互排斥，使蛋白质之间彼此不能相聚沉淀。间彼此不能相聚沉淀。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀蛋白质分子聚集而从溶液析出的现象称蛋白质分子聚集而从溶液析出的现象称为蛋白质沉淀。为蛋白质沉淀。主要方法：中性盐主要方法：中性盐(盐溶与盐析盐溶与盐析)、有机、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂与酸类、溶剂、重金属盐、生物碱试剂与酸类、加热加热原理：破坏稳定蛋白质亲水胶体的因素原理：破坏稳定蛋白质亲水胶体的因素水化层和电荷水化层和电荷蛋白质的结构功能

120、及分离纯化课件蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应蛋白质分子中的自由蛋白质分子中的自由C-末端的末端的a-羧基和羧基和N-末端的末端的a-氨基、肽键以及某些氨基酸氨基、肽键以及某些氨基酸残基的侧链基团，能够与某种化学试剂残基的侧链基团，能够与某种化学试剂发生反应，产生有色物质。发生反应，产生有色物质。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质的结构功能及分离纯化课件生物体组织无细胞抽提液溶解度分级法各种层析方法或电泳法（配合超滤技术）精制品结晶冻干粉破碎、溶解、离心分离除核酸前处理粗分级细分级从组织中分离纯化蛋白质的一

121、般程序蛋白质的结构功能及分离纯化课件大肠杆菌含有2000种以上的蛋白质，为了分离它所表达的一个外源基因的产物并保持它的活性，常有很大困难。但可根据某种目的，具体采用不同的方法。1）利用溶解度差别：硫酸铵或酒精分级沉淀2）利用蛋白质分子大小：SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心及超滤等3）根据不同电荷：离子交换层析、等电聚焦、圆盘电泳、毛细管电泳等4）利用该产物的抗体：亲和层析、免疫沉淀等5）对产品进行浓缩：选用合适截留分子量的超滤膜进行超过滤等6）对产品纯度的鉴定：电泳、末端分析、HPLC等蛋白质的结构功能及分离纯化课件五、五、蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法分子大小分子大小溶解度溶解度

122、电荷电荷吸附性质吸附性质对配体分子的生物学亲和力对配体分子的生物学亲和力蛋白质的结构功能及分离纯化课件（一）根据分子大小不同的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法透析和超过滤透析和超过滤密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心凝胶过滤凝胶过滤蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件1透透析析将浓缩液装在一个用赛咯吩将浓缩液装在一个用赛咯吩（cellophane）制造的透析袋内，）制造的透析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有很多缓冲液的容器浮在一个装有很多缓冲液的容器内进行透析。因为赛咯吩膜是半内进行透析。因为赛咯吩膜是半通透的膜，

123、蛋白质等大分子不能通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进质周围的小分子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，行交换，通过多次更换透析液，就可除去小分子（如硫酸铵）。就可除去小分子（如硫酸铵）。蛋白质的结构功能及分离纯化课件超超过过滤滤利用压力和利用压力和离心力，借离心力，借助于超滤膜助于超滤膜将分子质量将分子质量不同的物质不同的物质进行分离进行分离蛋白质的结构功能及分离纯化课件2密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心蛋白质颗粒可蛋白质颗粒可根据其分子质根据其分子质量和密度的大量和密度的大小不同，沉降小不同，沉降到与

124、自身密度到与自身密度相等的介质梯相等的介质梯度处。度处。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件RCF=(1.11810-5)RRPM2RCF:相对离心力，以地球引力来表示相对离心力，以地球引力来表示数字数字gRPM:离心机每分钟的转速离心机每分钟的转速R：半径（离心机旋转中心至离心管的距离）：半径（离心机旋转中心至离心管的距离）S：沉降系数，单位是：沉降系数，单位是1X10-13秒秒蛋白质的结构功能及分离纯化课件3 3 凝胶过滤凝胶过滤凝胶层析是按照蛋白凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分质分子量大小进行分离的技术，又称之凝离的技术，又称之凝

125、胶过滤，分子筛层析胶过滤，分子筛层析或排阻层析。或排阻层析。多孔载体珠：由不溶多孔载体珠：由不溶性但高亲水的高聚物性但高亲水的高聚物制成，如聚丙烯酰胺制成，如聚丙烯酰胺(Bio-Gel)(Bio-Gel)、葡聚糖、葡聚糖(Sephadex)(Sephadex)、琼脂糖、琼脂糖(Sepharose)(Sepharose)等。等。蛋白质的结构功能及分离纯化课件单个凝胶珠本身象个单个凝胶珠本身象个“筛子筛子”。不同类。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的作成一个凝胶柱。当

126、含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。

127、凝胶过滤所用的凝胶孔径洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量质分子量 。蛋白质的结构功能及分离纯化课件在一定的条件下，被分离的蛋白质的分子量的对在一定的条件下，被分离的蛋白质的分子量的对数与其洗脱体积成比例，所以常利用这一原理数与其洗脱体积成比例，所以常利用这一原理进行天然蛋白质分子量的测定。进行天然蛋白质分子量的测定。蛋白质的结构功能及分离纯化课件（二）（二）利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法等电点沉淀等电点沉淀盐析法盐析法有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀原理：破坏稳定蛋白质亲水胶体的因素原理：破坏稳定蛋白质亲水胶体的因

128、素水水化层和电荷化层和电荷蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件盐盐溶溶与与盐盐析析大多数蛋白质在高盐浓度下其溶解度下大多数蛋白质在高盐浓度下其溶解度下降，而且不同蛋白质获得盐析效果所需降，而且不同蛋白质获得盐析效果所需的盐浓度不同。的盐浓度不同。中性盐的加入，使水的活度降低，从而中性盐的加入，使水的活度降低，从而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，引起蛋白质分子间水化膜逐渐被破坏，引起蛋白质分子间相互聚集而析出。相互聚集而析出。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的盐析沉淀蛋白质的盐析沉淀蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋

129、白质的结构功能及分离纯化课件有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂能降低溶液的介电常数，使蛋白有机溶剂能降低溶液的介电常数，使蛋白质中相反电荷基团的引力增大，互相吸质中相反电荷基团的引力增大，互相吸引而凝聚；同时，有机溶剂还能和蛋白引而凝聚；同时，有机溶剂还能和蛋白质争夺水化膜，使蛋白质集聚。质争夺水化膜，使蛋白质集聚。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件（三）（三）根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法电泳电泳层析层析蛋白质的结构功能及分离纯化课件1电泳电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品

130、加到一块预先制别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是）。凝胶可以是淀粉凝胶（淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。）。一般凝胶介质中的一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这

131、样它们可以向阳大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。的多少有关。蛋白质的结构功能及分离纯化课件非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等电聚焦等电聚焦双向电泳双向电泳蛋白质的结构功能及分离纯化课件凝胶的有效孔径和分子筛效应凝胶的有效孔径和分子筛效应凝胶分子中分子的分离取决于它的电荷凝胶分子中分子的分离取决于它的电荷, ,分子分子量和形状量和形状凝胶分离不同分子量大小的分子的特性称为分凝胶分离不同分子量大小的分

132、子的特性称为分子筛效应子筛效应(Molecular sieving effect)(Molecular sieving effect)凝胶的有效孔径取决于凝胶的有效孔径取决于T%,T%,随随T%T%的增加而减少的增加而减少 T=( T=(丙烯量（丙烯量（g g）+ +甲叉量（甲叉量（g g）)/)/终体积终体积 C= C=甲叉量（甲叉量（g g）/(/(丙烯量（丙烯量（g g）+ +甲叉量甲叉量（g g）) )） T T总百分浓度，总百分浓度，C C交联百分浓度交联百分浓度蛋白质的结构功能及分离纯化课件2SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，发展了十二烷在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，发

133、展了十二烷基硫酸钠基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有去聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有去污剂十二烷基硫酸钠（污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸沸35分钟），通过加热和分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的（使二硫键

134、还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。蛋白质的结构功能及分离纯化课件由于由于SDS是带有负电荷的分子，是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，的氨基酸的疏水侧链结合，结合结合SDS的比率大约是一个的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的残基结合一分子的SDS，大，大的蛋白质按比率可以结合更的蛋白质按比率可以结合更多的多的SDS。所有结合。所有结合SDS的的蛋白质蛋白质-SDS复合物的

135、形状近复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。电质分子量的大小成比例。电泳时泳时SDS-蛋白质复合物在凝蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。主要取决于蛋白质分子量。蛋白质的结构功能及分离纯化课件在蛋白质样品加到凝胶上后，接通在蛋白质样品加到凝胶上后，接通电源，所有电源，所有SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物都向着阳极迁移。由于它们通都向着阳极迁移。由于它们通过凝胶的速率与它们分子量的过凝胶的速率与它们分子量

136、的对数成反比，大的蛋白质会遇对数成反比，大的蛋白质会遇到更多的阻力，因此它们迁移到更多的阻力，因此它们迁移的速度比小的蛋白质慢，这实的速度比小的蛋白质慢，这实际上是一种分子筛效应。但这际上是一种分子筛效应。但这种分子筛效应不同于凝胶过滤种分子筛效应不同于凝胶过滤层析中的分子筛效应。在凝胶层析中的分子筛效应。在凝胶过滤层析中，大分子被排出在过滤层析中，大分子被排出在凝胶的孔径之外，因此移动很凝胶的孔径之外，因此移动很快；而在快；而在SDS-PAGE中，所有中，所有的分子都应穿过凝胶，很显然的分子都应穿过凝胶，很显然大分子的迁移是最慢的。由此大分子的迁移是最慢的。由此就造成了各种蛋白质的迁移率就造

137、成了各种蛋白质的迁移率的不同，结果反应在电泳后的的不同，结果反应在电泳后的凝胶上。凝胶通过染色（常用凝胶上。凝胶通过染色（常用的考马斯亮蓝染料）出现不同的考马斯亮蓝染料）出现不同的蛋白带。的蛋白带。蛋白质的结构功能及分离纯化课件SDS-PAGESDS-PAGE结果示意图结果示意图肽链会根据分子量大肽链会根据分子量大小以不同速率在胶内小以不同速率在胶内迁移。迁移。分子量最小的肽链会分子量最小的肽链会迁移至最远端。迁移至最远端。蛋白质的结构功能及分离纯化课件未知蛋白质的分子量（严格讲应未知蛋白质的分子量（严格讲应是多肽链的分子量）可以通是多肽链的分子量）可以通过与同一块凝胶上参考蛋白过与同一块凝胶

138、上参考蛋白的迁移率相比较计算出来。的迁移率相比较计算出来。在在SDS-PAGE中，在一定的中，在一定的凝胶浓度下，蛋白质（实际凝胶浓度下，蛋白质（实际上是多肽链）的分子量对数上是多肽链）的分子量对数与多肽链的迁移率成线性关与多肽链的迁移率成线性关系，所以通过依据标准蛋白系，所以通过依据标准蛋白迁移率画出的标准蛋白分子迁移率画出的标准蛋白分子量对数对它们迁移率的标准量对数对它们迁移率的标准曲线，根据未知蛋白迁移率曲线，根据未知蛋白迁移率就可从标准曲线上求出未知就可从标准曲线上求出未知蛋白的分子量。蛋白的分子量。蛋白质的结构功能及分离纯化课件3 3 等电聚焦等电聚焦不同蛋白质所不同蛋白质所带正电荷

139、和带正电荷和负电荷基团负电荷基团的数量不同，的数量不同，当蛋白质在当蛋白质在它的等电点它的等电点时净电荷为时净电荷为零，在电场零，在电场中不再移动。中不再移动。+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10蛋白质的结构功能及分离纯化课件IEF结果示意图结果示意图蛋白质的结构功能及分离纯化课件4双双向向电电泳泳蛋白质样品蛋白质样品首先在一个首先在一个方向经过等方向经过等电聚焦，然电聚焦，然后在第二方后在第二方向通过向通过SDS-PAGE蛋白质的结构功能及分离纯化课件电泳结果图电泳结果图蛋白质的结构功能及分离纯化课件5离子交换层析离子交换层析蛋白质的蛋白质的分离基于分离基于它们的

140、总它们的总净电荷。净电荷。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件（四）利用选择性吸附的纯化方法（四）利用选择性吸附的纯化方法羟磷灰石层析羟磷灰石层析疏水作用层析疏水作用层析蛋白质的结构功能及分离纯化课件（五）利用对配体的特异生物学（五）利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法亲和力的纯化方法蛋白质的结构功能及分离纯化课件亲亲和和层层析析利用蛋白质的生利用蛋白质的生物性质进行分离。物性质进行分离。蛋白质混合物中蛋白质混合物中的某一种蛋白质的某一种蛋白质能与固定化配体能与固定化配体进行特异地、高进行特异地、高亲和性地非共价亲和性地非共价结合。结合。

141、蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定电泳法：电泳法：SDS-PAGE、浓度梯度、浓度梯度PAGE、印迹转移、等电聚焦、双向电泳、毛细印迹转移、等电聚焦、双向电泳、毛细管电泳等管电泳等免疫法：免疫扩散、免疫电泳、酶联免免疫法：免疫扩散、免疫电泳、酶联免疫吸附（疫吸附（ELISA）、免疫印迹等）、免疫印迹等高效液相层析（高效液相层析（HPLC）分光光度法分光光度法超速离心法超速离心法蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质的结构功能及分离纯化课件例：有一蛋白质，在某组织内含量较低，很难分离提例：有一蛋白质，在某组织内含

142、量较低，很难分离提纯，现已知其分子量，并从其它实验室要来了该蛋纯，现已知其分子量，并从其它实验室要来了该蛋白质的抗体，问用哪些实验方法可以初步证实组织白质的抗体，问用哪些实验方法可以初步证实组织内的确含有该蛋白质？内的确含有该蛋白质？解：先根据这种蛋白质的分子量，选用一定浓度的聚解：先根据这种蛋白质的分子量，选用一定浓度的聚丙烯酰胺作为分离胶，用丙烯酰胺作为分离胶，用SDS-PAGE分离从该组织分离从该组织中所提取得到的蛋白质。然后，用蛋白质印迹技术，中所提取得到的蛋白质。然后，用蛋白质印迹技术，转移到特定类型的薄膜上，最后用酶联抗体进行检转移到特定类型的薄膜上，最后用酶联抗体进行检测，观察一

143、种分子量的蛋白质条带是否呈阳性反应。测，观察一种分子量的蛋白质条带是否呈阳性反应。如果呈阳性反应，则可初步证实组织内的确含有该如果呈阳性反应，则可初步证实组织内的确含有该蛋白质。蛋白质。蛋白质的结构功能及分离纯化课件蛋白质化学研究中常用试剂分类小肽的氨基酸顺序测定：异硫氢酸苯酯（小肽的氨基酸顺序测定：异硫氢酸苯酯（PITC）多肽链的氨基末端的确定：多肽链的氨基末端的确定：2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯（FDNB）、）、丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）一个没有二硫键的蛋白质的可逆变性：尿素等一个没有二硫键的蛋白质的可逆变性：尿素等芳香族氨基酸残基的羧基一侧肽键的水解：胰凝芳香族氨基酸残基的羧基一侧肽键的水解：胰凝乳蛋白酶等乳蛋白酶等甲硫氨酸的羧基一侧肽键的水解：溴化氰甲硫氨酸的羧基一侧肽键的水解：溴化氰（CNBr）通过氧化途径将二硫键打开：过甲酸等通过氧化途径将二硫键打开：过甲酸等蛋白质的结构功能及分离纯化课件