《动物生物技术》教学课件：第六章转基因动物

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1、第六章第六章 转基因动物转基因动物第一节第一节 概述概述第二节第二节 建立转基因动物的建立转基因动物的 方法与检测方法与检测 第三节第三节 常见转基因动物的常见转基因动物的 建立建立第四节第四节 动物生物反应器动物生物反应器第一节第一节 概述概述概念v转基因技术转基因技术v转基因动物转基因动物转基因技术的定义转基因技术的定义v利用分子生物学技术，将某些生物的基因转利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变费品质等方面

2、向人类需要的目标转变转基因动物转基因动物 是指经转基因技术修饰的、外源基因是指经转基因技术修饰的、外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物给下一代的一类动物转基因动物的主要技术步骤转基因动物的主要技术步骤目的基因的分离、表达载体的构建目的基因的分离、表达载体的构建目的基因的分离、表达载体的构建目的基因的分离、表达载体的构建受体细胞的获得受体细胞的获得受体细胞的获得受体细胞的获得基因导入基因导入基因导入基因导入转基因胚胎的移植转基因胚胎的移植转基因胚胎的移植转基因胚胎的移植转基因整合表达的检测转基因整合表达的检测转基因整合表达的检测转基因

3、整合表达的检测转基因动物的遗传性能研究及选育转基因动物的遗传性能研究及选育转基因动物的遗传性能研究及选育转基因动物的遗传性能研究及选育组建转基因动物新类群组建转基因动物新类群组建转基因动物新类群组建转基因动物新类群转基因家畜的目标基因转基因家畜的目标基因v以促进生长的生长激素为主的调控身体组织以促进生长的生长激素为主的调控身体组织生长的基因生长的基因v调节机体免疫反应和抗病性的基因调节机体免疫反应和抗病性的基因v编码某些特殊蛋白质的基因编码某些特殊蛋白质的基因转基因动物研究的应用转基因动物研究的应用v基因表达和调控的研究基因表达和调控的研究v促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品促进动物生长、

4、提高畜产品产量、改善产品品质、动物品种改良品质、动物品种改良 v利用转基因动物作为生物反应器利用转基因动物作为生物反应器 v建立诊断和治疗人类疾病的动物模型建立诊断和治疗人类疾病的动物模型 v生产可用于人体器官移植的动物器官生产可用于人体器官移植的动物器官 转基因动物技术存在问题转基因动物技术存在问题v转基因动物的效率较低转基因动物的效率较低v转基因表达的混乱转基因表达的混乱v转基因对宿主动物的影响转基因对宿主动物的影响第二节第二节 建立转基因的方法与检测建立转基因的方法与检测一、转基因动物的制备方法一、转基因动物的制备方法二、提高外源基因的整合与表达效率的方法二、提高外源基因的整合与表达效率

5、的方法三、转基因鼠的应用三、转基因鼠的应用一、转基因动物的制备方法一、转基因动物的制备方法第二节第二节1 1、逆转录病毒法、逆转录病毒法2 2、DNADNA显微注射法显微注射法3 3、胚胎干细胞、胚胎干细胞4 4、精子介导法、精子介导法5 5、细胞核移植克隆法、细胞核移植克隆法6 6、近年来的一些技术、近年来的一些技术1.逆转录病毒法逆转录病毒法（retrovirus-mediated gene transfer） 概念概念 通过构建含有通过构建含有目的基因目的基因的的复制缺陷型复制缺陷型逆转录病逆转录病毒载体，转染毒载体，转染辅助细胞辅助细胞后形成具有感染性的病毒颗粒，后形成具有感染性的病毒

6、颗粒，再转染动物早期胚胎；然后将经转染的早期胚胎植入再转染动物早期胚胎；然后将经转染的早期胚胎植入假孕母鼠子宫内发育成嵌合体，经育种后得到转基因假孕母鼠子宫内发育成嵌合体，经育种后得到转基因动物品系动物品系第二节第二节逆转录病毒载体逆转录病毒载体外源基因外源基因8 8细胞胚细胞胚嵌合小鼠嵌合小鼠植入代孕母鼠植入代孕母鼠筛选筛选纯合转基因小鼠纯合转基因小鼠（2 2）步）步 骤骤宿主范围广泛，宿主染色体宿主范围广泛，宿主染色体DNADNA在整合位点附近较在整合位点附近较少发生少发生缺失和重排缺失和重排第二节第二节（3 3）优点）优点: :感染率高、细胞损伤小，胚胎存活率高，操作简单感染率高、细胞损

7、伤小，胚胎存活率高，操作简单 将胚胎置于高浓度病毒容器中，或与被感将胚胎置于高浓度病毒容器中，或与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘 辅助病毒（辅助病毒（helper virushelper virus）基因组可能与目的基）基因组可能与目的基因一起整合到同一细胞核中因一起整合到同一细胞核中商业生产转基因动物商业生产转基因动物第二节第二节（4 4）缺点：）缺点： 逆转录病毒载体容量有限，只能转移逆转录病毒载体容量有限，只能转移10kb10kb的的DNADNA，转入的基因一般没有其邻近的调控序列，转入的基因一般没有其邻近的调控序列2.DNA2.DNA显微注

8、射法显微注射法第二节第二节v正常雌鼠正常雌鼠: :产生产生5 51010个卵细胞个卵细胞/ /次次待雌鼠交配后，从其输卵管中取出受精卵待雌鼠交配后，从其输卵管中取出受精卵主要技术步骤主要技术步骤第二节第二节 使供体雌鼠使供体雌鼠超数排卵超数排卵，增加用于微注射接，增加用于微注射接种种DNADNA的受精卵数量的受精卵数量v经过处理的雌鼠：生产约经过处理的雌鼠：生产约3535个卵细胞个卵细胞/ /次次DNADNA显微注射要在精原核时注射才能有效显微注射要在精原核时注射才能有效步步骤骤将外源基因将外源基因注射注射入受精卵中入受精卵中 显微注射的基因通常为删除了显微注射的基因通常为删除了原核载体序列的

9、原核载体序列的线性线性DNADNA大约大约3 3周后，接受过注射的受精卵发育周后，接受过注射的受精卵发育生长成生长成胎鼠胎鼠，由代孕母鼠产下，由代孕母鼠产下步步骤骤将将25254040个受精卵用个受精卵用显微外科手术显微外科手术移移植到植到假孕雌鼠假孕雌鼠的输卵管内的输卵管内v理想情况下理想情况下, ,成功率为成功率为3%-5%3%-5%仅约仅约6666的受精卵能在显微注射中存活的受精卵能在显微注射中存活移植到子宫的受精卵，仅约移植到子宫的受精卵，仅约2525能发育成幼鼠能发育成幼鼠幼鼠中，仅约幼鼠中，仅约2525是转基因鼠是转基因鼠l l 显微注射获得转基因动物的成功率显微注射获得转基因动物

10、的成功率一般只有一般只有11000第二节第二节DNADNA显微注显微注射效率射效率较低较低转入大鼠生长激素基因的小鼠转入大鼠生长激素基因的小鼠第二节第二节3、胚胎干细胞法（、胚胎干细胞法（embryonic stem cell,ES）（1 1）概念）概念 从早期胚胎内细胞团（从早期胚胎内细胞团（ICMICM）分离出来）分离出来的、能在体外培养的一种高度未分化的多的、能在体外培养的一种高度未分化的多能细胞。能细胞。第二节第二节滋养层滋养层内细胞群内细胞群步骤步骤通过胚胎干细胞获得转基因小鼠通过胚胎干细胞获得转基因小鼠第二节第二节v基因组内编码非必需产物的地方基因组内编码非必需产物的地方 减少整合

11、的减少整合的DNADNA对细胞的正常发育及对细胞的正常发育及功能的干扰功能的干扰ESES细胞的基因操作细胞的基因操作外源基因的整合位置外源基因的整合位置第二节第二节v 基因组内可转录的区域基因组内可转录的区域DNADNA载体设计载体设计第二节第二节定点整合元件定点整合元件基因打靶（基因打靶（gene targetinggene targeting）基因打靶基因打靶v原理原理 同源重组同源重组(homologous recombination) 发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间间进进行行单单链链或

12、双链片段的交换或双链片段的交换第二节第二节v细胞水平实现基因的细胞水平实现基因的定位修饰定位修饰筛选方法筛选方法第二节第二节j 正负筛选法正负筛选法j PCR PCR法法正负筛选法示意图正负筛选法示意图非特异整合非特异整合染色体染色体A在含在含GCV(GCV(丙氧鸟苷丙氧鸟苷)+G418)+G418的培养基中被淘汰的培养基中被淘汰目的目的基因基因HSV-tk1HB1neorHB2 HSV-tk2载载体体同源重组同源重组染色体染色体B在含在含GCV+G418GCV+G418的培养基中能生长的培养基中能生长HSV-tk1HB1neorHB2目的目的基因基因HSV-tk2载载体体PCRPCR法检测是

13、否特异整合同源重组法检测是否特异整合同源重组非特异整合非特异整合PCRPCR扩增扩增没有扩增产物没有扩增产物载体载体HB1USHB2目的目的基因基因A染色体染色体第二节第二节P2P1 有扩增产物有扩增产物同源重组同源重组HB1USHB2目的目的基因基因载体载体染色体染色体BPCRPCR扩增扩增P1P2第二节第二节“继多利羊成功克隆后的又一次科学奇迹继多利羊成功克隆后的又一次科学奇迹”“为了解人类脑基因活动开启了一扇天窗为了解人类脑基因活动开启了一扇天窗”3838岁的岁的美国普林美国普林美国普林美国普林斯顿大学斯顿大学斯顿大学斯顿大学钱卓钱卓将将NR2BNR2B基因置入老鼠胚胎育成基因置入老鼠胚

14、胎育成 “聪明鼠聪明鼠”1999NR2BNR2B基因能控制产生一种名为基因能控制产生一种名为NMDANMDA的受体，该的受体，该受体能够激活神经，帮助记忆。受体能够激活神经，帮助记忆。聪明鼠聪明鼠 转基因鼠在学习与记忆能力方面要明显超过转基因鼠在学习与记忆能力方面要明显超过普通鼠。普通鼠。20012001年年, , 华盛顿大学医学院培育出一批相同华盛顿大学医学院培育出一批相同的的“聪明鼠聪明鼠”后发现，它们对于长期慢性疼痛后发现，它们对于长期慢性疼痛的敏感度较高。的敏感度较高。v结果意味着，有可能针对结果意味着，有可能针对NMDANMDA受体研制受体研制出新型止痛药，以出新型止痛药，以缓解慢性

15、疼痛缓解慢性疼痛。v它们对疼痛和伤害有更好的记忆能它们对疼痛和伤害有更好的记忆能力，针对力，针对NMDANMDA受体的药物有可能帮助受体的药物有可能帮助记忆力衰退的老人记忆力衰退的老人增加记忆能力增加记忆能力。 受精后受精后8天。胚牙完成天。胚牙完成“着陆着陆“,微微嵌入子微微嵌入子宫内膜。此时它分裂发宫内膜。此时它分裂发育为几百个细胞。育为几百个细胞。 4、精子介导法、精子介导法卵子的外层被一层透明的薄膜保护着，这使它看起来卵子的外层被一层透明的薄膜保护着，这使它看起来像一个悬浮在天体中的漂亮的星球。此时经过种种障像一个悬浮在天体中的漂亮的星球。此时经过种种障碍的精子终于与卵子相遇，卵子外膜

16、成为它们第一道碍的精子终于与卵子相遇，卵子外膜成为它们第一道需要攻破的关卡。此时，精子们把头钻到卵子的外壁需要攻破的关卡。此时，精子们把头钻到卵子的外壁上，尾巴不断拍打着，卵子则随着精子尾部的运动缓上，尾巴不断拍打着，卵子则随着精子尾部的运动缓慢地逆时针转动。慢地逆时针转动。1）概念：）概念：v 利用精子作为外源基因的载体来建立利用精子作为外源基因的载体来建立转基因动物转基因动物2 2）方法）方法 将成熟的精子与外源将成熟的精子与外源DNADNA进行预培养之后，使精进行预培养之后，使精子有能力携带外源子有能力携带外源DNADNA进入卵中，使之受精，并使外进入卵中，使之受精，并使外源源DNADN

17、A整合于染色体中整合于染色体中v精子携带精子携带DNADNA主要是通过三种途径来完成，主要是通过三种途径来完成，即将外源即将外源DNADNA与精子共孵育、电穿孔导入法与精子共孵育、电穿孔导入法和和脂质体转染法脂质体转染法混合培养：混合培养： 外源外源DNADNA吸附到精子上并与之结合的比率较低，但该吸附到精子上并与之结合的比率较低，但该精子受精后受精卵外源基因的整合率较高，可达受精卵的精子受精后受精卵外源基因的整合率较高，可达受精卵的5050，对精子的活力和受精能力影响较小，对精子的活力和受精能力影响较小电穿孔法：电穿孔法： 通过高压电场暂时性地引起精子胞浆膜地通透通过高压电场暂时性地引起精子

18、胞浆膜地通透性变化，从而使外源性变化，从而使外源DNADNA分子进入精子胞浆内，与染色体分子进入精子胞浆内，与染色体DNADNA整合；精子活力不发生明显下降，但受精率下降整合；精子活力不发生明显下降，但受精率下降脂质体介导法：脂质体介导法： 脂质体与脂质体与DNADNA结合后形成复合物，可以很容结合后形成复合物，可以很容易地与胞浆膜结合，进入细胞内，整合到染色体易地与胞浆膜结合，进入细胞内，整合到染色体上。从而提高精子摄取外源上。从而提高精子摄取外源DNADNA的效率，的效率，经脂质经脂质体转染的精子受精能力不受影响体转染的精子受精能力不受影响脂脂质质体体基基因因转转移移原原理理4)4)影响因

19、素：影响因素： 精浆中的精胺、聚酰胺类物质或体外获能剂精浆中的精胺、聚酰胺类物质或体外获能剂中的肝素均可阻止精子对中的肝素均可阻止精子对DNADNA的吸附的吸附 精子与外源精子与外源DNADNA温育前，必须对精子进行充分洗涤，温育前，必须对精子进行充分洗涤，以去掉这些物质以去掉这些物质 DNA DNA长度亦可影响其与精子的结合，较短的长度亦可影响其与精子的结合，较短的DNADNA片段不如较长的片段不如较长的DNADNA片段容易被精子所摄取片段容易被精子所摄取3)3)结合部位结合部位： 精子头后区域、精子头前区域以及精子整个精子头后区域、精子头前区域以及精子整个头部区域；头部区域；不出现在精子的

20、尾部不出现在精子的尾部5 5）优点：）优点：v简单、方便，依靠生理受精过程，免去了原核简单、方便，依靠生理受精过程，免去了原核的损伤的损伤v成本很低，只有显微注射法成本的成本很低，只有显微注射法成本的1 11010，不涉，不涉及对动物进行手术处理及对动物进行手术处理6 6）用于现代家畜育种：）用于现代家畜育种： 用携带有外源基因的精子给发情母畜授用携带有外源基因的精子给发情母畜授精，在母畜所生的后代中，就有一定比例的精，在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合了外源基因的转基因动物动物是整合了外源基因的转基因动物5、细胞核移植克隆法、细胞核移植克隆法6岁岁憨态可掬的多憨态可掬的多莉对科技的

21、贡莉对科技的贡献是不朽的献是不朽的 多莉是个多莉是个孩子的母亲孩子的母亲 定义定义 ：将供体细胞核移入将供体细胞核移入去核的卵母细胞中去核的卵母细胞中, ,使后者使后者不经精子穿透等有性过程不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育即可被激活、分裂并发育, ,使得核供体的基因得到完使得核供体的基因得到完全复制全复制1 1）核）核 移移 植植 技技 术术 简简 介介1除核2注核3注核4注核5注核6电击1 切开卵母细胞透明带切开卵母细胞透明带2 挤出卵母细胞细胞核挤出卵母细胞细胞核3 注入供体细胞核注入供体细胞核4 电融合仪融合电融合仪融合5培养培养12345（1）核移植的原理）核移植的原理v理

22、论基础理论基础来源于同一胚胎或细胞系的所有细胞核都含有与来源于同一胚胎或细胞系的所有细胞核都含有与受精卵完全相同的遗传信息，从基因组成上应该受精卵完全相同的遗传信息，从基因组成上应该具有与受精卵一样的指导个体发育的全部潜能具有与受精卵一样的指导个体发育的全部潜能v早期的胚胎细胞具有全能性，在卵母细胞的转录因早期的胚胎细胞具有全能性，在卵母细胞的转录因子作用下，基因组可以从头开始转录和翻译子作用下，基因组可以从头开始转录和翻译（1）核移植的原理）核移植的原理v利用利用“血清饥饿血清饥饿”等方法，诱导培养体细胞处于等方法，诱导培养体细胞处于G G0 0期，从而恢复体细胞核去分化和再分化能力；卵子期

23、，从而恢复体细胞核去分化和再分化能力；卵子或卵母细胞可解除核组织的阻遏状态，使其恢复多或卵母细胞可解除核组织的阻遏状态，使其恢复多能性，甚至全能性能性，甚至全能性v供体核和受体细胞（供体核和受体细胞（MIIMII期卵母细胞）质在复制时间期卵母细胞）质在复制时间上和染色体的倍数上保持一致；再通过电刺激、钙上和染色体的倍数上保持一致；再通过电刺激、钙离子载体等方法激活受体细胞，恢复到离子载体等方法激活受体细胞，恢复到“受精受精”时时状态状态（2）核移植技术的程序）核移植技术的程序供体细胞的准备供体细胞的准备受体细胞的准备和去核受体细胞的准备和去核核移植核移植细胞融合细胞融合胚胎移植胚胎移植活化活化

24、重组胚培养重组胚培养供体细胞核供体细胞核的来源的来源体体细细胞胞核核移移植植胚胚胎胎细细胞胞核核移移植植胚胚胎胎干干细细胞胞核核移移植植供受体种间关系供受体种间关系异异种种核核移移植植同同种种核核移移植植核移植目的核移植目的生生殖殖性性克克隆隆治治疗疗性性克克隆隆2 2）核）核 移移 植植 分分 类类生殖性克隆生殖性克隆v治疗性克隆治疗性克隆是指通过核移植技术构建来源于病人体细胞的胚是指通过核移植技术构建来源于病人体细胞的胚胎，待胚胎发育至囊胚阶段后取出内细胞团，在胎，待胚胎发育至囊胚阶段后取出内细胞团，在体外培养胚胎干细胞，然后定向诱导胚胎干细胞体外培养胚胎干细胞，然后定向诱导胚胎干细胞分化

25、成病人所需要的细胞类型，然后再移植回病分化成病人所需要的细胞类型，然后再移植回病人身上人身上或通过组织工程构建病人所需要的组织或器官，或通过组织工程构建病人所需要的组织或器官，移植给病人，来替代或补充病变或受到损伤的细移植给病人，来替代或补充病变或受到损伤的细胞、组织和器官，从而实现对疾病的治疗，例如胞、组织和器官，从而实现对疾病的治疗，例如治疗帕金森氏病和糖尿病等治疗帕金森氏病和糖尿病等 治治疗疗性性克克隆隆3 3）克）克 隆隆 动动 物物 的的 鉴鉴 定定DNA 指指 纹纹 ：指每个个体所特有的基因多态性：指每个个体所特有的基因多态性鉴定方法：鉴定方法：RAPD 微卫星微卫星 RFLP D

26、OLLY的鉴定：微卫星的鉴定：微卫星 4）核移植的意义和应用前景）核移植的意义和应用前景v细胞核质关系的研究细胞核质关系的研究v遗传育种和挽救濒危动物：胚胎克隆遗传育种和挽救濒危动物：胚胎克隆v医药和疾病治疗医药和疾病治疗n 基因治疗基因治疗基因治疗即利用基因工程技术治疗人类遗传性疾病基因治疗即利用基因工程技术治疗人类遗传性疾病正正常常的的人人类类基基因因可可以以克克隆隆并并引引入入遗遗传传病病患患者者的的体体细细胞，以替代、修复或纠正有缺陷的基因胞，以替代、修复或纠正有缺陷的基因通通常常使使用用一一种种反反转转录录病病毒毒作作为为基基因因治治疗疗的的转转移移系系统统，重组载体可以感染人的组织

27、和细胞，但不自我复制重组载体可以感染人的组织和细胞，但不自我复制l例例例例 ： 重重重重 症症症症 综综综综 合合合合 性性性性 免免免免 疫疫疫疫 缺缺缺缺 乏乏乏乏 症症症症（SCIDSCID）缺少腺苷酸脱氨基酶基因缺少腺苷酸脱氨基酶基因1990年，转基因年，转基因T淋巴细淋巴细胞注射到人体骨髓组织中胞注射到人体骨髓组织中治疗治疗SCID5）细胞核移植影响因素）细胞核移植影响因素v供体细胞和受体胞质的选择供体细胞和受体胞质的选择DNADNA复制前期（复制前期（G G1 1期）细胞作为供体，第二次减期）细胞作为供体，第二次减数分裂中期（数分裂中期（MIIMII期）卵母细胞为受体，核移植期）卵

28、母细胞为受体，核移植胚胎发育率较高胚胎发育率较高 同步化处理或预先激活同步化处理或预先激活细胞核完全去除细胞核完全去除 移植胚的非整倍性，卵移植胚的非整倍性，卵裂异常、发育受阻、早期胚胎死亡裂异常、发育受阻、早期胚胎死亡5）细胞核移植影响因素）细胞核移植影响因素v细胞融合与卵母细胞活化细胞融合与卵母细胞活化灭活的仙台病毒灭活的仙台病毒 防止病毒扩散而发生污染防止病毒扩散而发生污染聚乙二醇聚乙二醇 较大毒性较大毒性电融合电融合 效率高效率高电激活电激活 多次电脉冲处理、延长脉多次电脉冲处理、延长脉 冲时间、电融合液中加入冲时间、电融合液中加入 Sr Sr2+2+或三磷酸肌醇或三磷酸肌醇5）细胞核

29、移植影响因素）细胞核移植影响因素v端粒长度缩短问题端粒长度缩短问题正常细胞缺乏端粒酶，端粒随细胞正常细胞缺乏端粒酶，端粒随细胞分裂而变短，细胞衰老；生殖细胞、分裂而变短，细胞衰老；生殖细胞、癌细胞都有此酶，不会衰老癌细胞都有此酶，不会衰老实验论证不统一实验论证不统一5）细胞核移植影响因素）细胞核移植影响因素vX X染色体灭活染色体灭活 雌雄动物的基因剂量补偿雌雄动物的基因剂量补偿v克隆胚胎某些基因的重编程异常克隆胚胎某些基因的重编程异常 重复序列的甲基化异常重复序列的甲基化异常（1 1）成功率低下。这是目前克隆技术的最大难题。）成功率低下。这是目前克隆技术的最大难题。（1 1）在卵母细胞的去核

30、过程中，去核效率低，损失）在卵母细胞的去核过程中，去核效率低，损失1/21/21/31/3的卵母细胞质。的卵母细胞质。（2 2）重组胚的融合和卵母细胞质的激活用到电脉冲。电脉冲）重组胚的融合和卵母细胞质的激活用到电脉冲。电脉冲激活卵母细胞，其融合效率无法控制。激活卵母细胞，其融合效率无法控制。（3 3）核程序重排。细胞重新恢复全能性过程的机理还不清楚。）核程序重排。细胞重新恢复全能性过程的机理还不清楚。（4 4）细胞周期同步化。供体细胞和受体细胞的细胞周期同步）细胞周期同步化。供体细胞和受体细胞的细胞周期同步化是核移植的关键，同步化技术并不成熟。化是核移植的关键，同步化技术并不成熟。（5 5）

31、早衰问题。早衰是事实，但机理尚不清楚。）早衰问题。早衰是事实，但机理尚不清楚。（6 6）破坏自然界的多样性，对生物系统的影响难以预测。）破坏自然界的多样性，对生物系统的影响难以预测。（7 7）伦理问题。克隆人的问题无法回避。）伦理问题。克隆人的问题无法回避。目前动物克隆中存在的问题目前动物克隆中存在的问题v piggy-BacvTALEN(transcription activator-like effector nuclease) v ZFN(Zinc-finger nuclease)v CRISPR(clustered regulatoryinterspaced short palindr

32、omic repeat)6、其他方法、其他方法二、提高外源基因的整合与表达效率的方法1 1、采用适当的外源基因导入方法与整合方式、采用适当的外源基因导入方法与整合方式v只有部分外源只有部分外源DNADNA拷贝才整合入染色体拷贝才整合入染色体逆转录病毒：整合频率最高，病毒容量限制逆转录病毒：整合频率最高，病毒容量限制同源重组：精确修饰基因组最有效办法同源重组：精确修饰基因组最有效办法显微注射：受多种因素影响显微注射：受多种因素影响vDNADNA随机整合机制随机整合机制DNADNA随机整合在染色体随机整合在染色体DNADNA断裂处断裂处v转基因整合的拷贝数转基因整合的拷贝数2 2、利用位点独立性元

33、件提高转基因的整合表达效率、利用位点独立性元件提高转基因的整合表达效率v理论上，顺式作用元件决定着外源基因的特异性表达理论上，顺式作用元件决定着外源基因的特异性表达vMARMAR（核基质黏附区，（核基质黏附区，matrix attachment regionmatrix attachment region）位于位于DNADNA上各转录单位的交界处，是上各转录单位的交界处，是DNADNA在核基质或染在核基质或染色体支架上的附着点，将染色质锚定在核基质上，以色体支架上的附着点，将染色质锚定在核基质上，以防其自由转动，并使防其自由转动，并使DNADNA发生解链发生解链将将DNADNA隔离成许多拓扑学

34、限制性的功能区域，每个功能隔离成许多拓扑学限制性的功能区域，每个功能区域就形成一个拓扑学解旋的环，每个环就是一个转区域就形成一个拓扑学解旋的环，每个环就是一个转录单位录单位置于人置于人- -珠蛋白珠蛋白DNADNA结构域的界限区，能起到转录激结构域的界限区，能起到转录激活的作用，并显示出与核基质分子有较高的亲和力活的作用，并显示出与核基质分子有较高的亲和力vLCRLCR（基因座位控制区，（基因座位控制区，locus control locus control regionregion）调控一群相邻基因表达的边界序列调控一群相邻基因表达的边界序列是由位于基因簇是由位于基因簇55端的多个端的多个D

35、NADNA酶高度敏感位点酶高度敏感位点组成组成哺乳动物哺乳动物-珠蛋白基因簇的珠蛋白基因簇的LCRLCR对基因簇中所有对基因簇中所有的基因在发育过程中的正确有序的表达起调控作的基因在发育过程中的正确有序的表达起调控作用用3、选择合适的目的基因与表达载体、选择合适的目的基因与表达载体v微小基因微小基因删除了某些相当大的内含子，靠近删除了某些相当大的内含子，靠近5 5端的内含子应端的内含子应最大限度地保留，以利于最大限度地保留，以利于mRNAmRNA的正确拼接的正确拼接v错误拼接错误拼接v载体序列载体序列4、通过共注射提高外源基因的表达水平、通过共注射提高外源基因的表达水平v不同基因构建以首尾相连

36、的形式共整合，在某种程不同基因构建以首尾相连的形式共整合，在某种程度上形成相对独立的区域或形成一个开放的染色体度上形成相对独立的区域或形成一个开放的染色体域域v将特定的高水平表达基因与构件共注射，可以协同将特定的高水平表达基因与构件共注射，可以协同作用，从而提高外源基因的表达水平作用，从而提高外源基因的表达水平第三节第三节 常见转基因动物的建立常见转基因动物的建立v转基因牛转基因牛v转基因羊、转基因羊、猪猪、兔、兔1、转基因牛、转基因牛携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔滔滔”v利用乳腺作为生物反应器利用乳腺作为生物反应器收集卵母细胞收集卵母细胞体外成熟体

37、外成熟体外受精体外受精受精卵分离受精卵分离DNA显微注射显微注射体外胚胎发育体外胚胎发育到囊胚阶段到囊胚阶段胚胎移植胚胎移植对转基因子对转基因子代进行筛选代进行筛选 用途用途v改变牛奶的成分：改变牛奶的成分：转入超量表达的转入超量表达的k k酪蛋白基因增加酪蛋白基因增加k k酪蛋白的产量酪蛋白的产量v获得产奶量更大，生长更快的优良品种：获得产奶量更大，生长更快的优良品种：转入超量转入超量表达的牛生长激素基因，提高产量，减少消耗表达的牛生长激素基因，提高产量，减少消耗v在乳腺中表达乳糖酶基因可能产生不含乳糖的牛奶在乳腺中表达乳糖酶基因可能产生不含乳糖的牛奶v制药厂：制药厂：转入人的岩藻糖转移酶基

38、因的体细胞克隆转入人的岩藻糖转移酶基因的体细胞克隆牛牛 治疗和预防胃病治疗和预防胃病我国的研究现状：我国的研究现状：v20032003年年3 3月，中国农业大学成功获得我国第一头体细月，中国农业大学成功获得我国第一头体细胞转基因克隆牛胞转基因克隆牛v同年同年1010月，又获得世界上第一头转人岩藻糖转移酶月，又获得世界上第一头转人岩藻糖转移酶基因的体细胞克隆牛，并且开创了用基因的体细胞克隆牛，并且开创了用冷冻卵母细胞冷冻卵母细胞克隆成功的先例克隆成功的先例v中国科学家的冷冻、复苏、克隆技术，解决了动物中国科学家的冷冻、复苏、克隆技术，解决了动物克隆因新鲜胚胎成活时间短而推广应用严重受限的克隆因新

39、鲜胚胎成活时间短而推广应用严重受限的世界性难题，为世界动物克隆技术的发展树立了新世界性难题，为世界动物克隆技术的发展树立了新的里程碑的里程碑v批量生产体细胞克隆牛批量生产体细胞克隆牛300300多头，数量之大为世界之多头，数量之大为世界之最；妊娠率最；妊娠率35.235.2（国际水平为（国际水平为2121）；产犊率）；产犊率15.815.8（国际水平为（国际水平为1010）；转基因克隆胚胎的妊）；转基因克隆胚胎的妊娠率娠率2727（国际水平为（国际水平为10101515）；产犊率）；产犊率3030（国际水平为（国际水平为10101515）v前景前景v转基因牛是一种高效的生产蛋白质的机器转基因牛

40、是一种高效的生产蛋白质的机器v一头优良的乳牛，一年可产奶一头优良的乳牛，一年可产奶6000-100006000-10000公斤，奶公斤，奶中蛋白含量达中蛋白含量达3.1%3.1%，一年可产蛋白质，一年可产蛋白质200-300200-300公斤，公斤，若用一小部分能力来生产外源蛋白质既然不影响动若用一小部分能力来生产外源蛋白质既然不影响动物的健康，也不影响奶的物理性状物的健康，也不影响奶的物理性状v其产品的生物活性高其产品的生物活性高v产品的纯度高，其纯度可达到产品的纯度高，其纯度可达到99.99%99.99%v产品多样化产品多样化v增强抗病性增强抗病性 如：美国和日本的研究人员通过转基因技术培

41、如：美国和日本的研究人员通过转基因技术培育出一种不产生朊蛋白的牛胚胎育出一种不产生朊蛋白的牛胚胎 方法：方法： 首先从牛体细胞内提取了产生朊蛋白的基因首先从牛体细胞内提取了产生朊蛋白的基因序列，随后用一个人造脱氧核糖核酸序列，随后用一个人造脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)片段插入片段插入该基因序列，阻止基因发挥正常功能，然后将这段该基因序列，阻止基因发挥正常功能，然后将这段经过改造的基因序列重新注入牛体细胞内，再通过经过改造的基因序列重新注入牛体细胞内，再通过克隆技术培育出牛胚胎克隆技术培育出牛胚胎v缺点缺点获得转基因牛比其它转基因动物更加困难：微分干获得转基因牛比其它转基因动物更加困难：微分

42、干涉相差显微镜难以分辨猪、牛等的精前核，需进行涉相差显微镜难以分辨猪、牛等的精前核，需进行进一步超速离心才能分辨出进一步超速离心才能分辨出从受精卵发育成小牛差不多要花两年的时间，且牛从受精卵发育成小牛差不多要花两年的时间，且牛的每胎产仔数很少，进一步提高了成本的每胎产仔数很少，进一步提高了成本2 2、转基因羊、转基因羊v主要集中在利用其乳腺作为生物主要集中在利用其乳腺作为生物反应器生产药物蛋白反应器生产药物蛋白构建用乳腺特异性启动子驱动的编码人类基因的载构建用乳腺特异性启动子驱动的编码人类基因的载体，得到转基因绵羊和山羊，能将表达的人类蛋白体，得到转基因绵羊和山羊，能将表达的人类蛋白质分泌到乳

43、汁中，所表达的蛋白质是经过的糖化的，质分泌到乳汁中，所表达的蛋白质是经过的糖化的，理论上同从人体提取的蛋白质一样具有生物活性理论上同从人体提取的蛋白质一样具有生物活性已在转基因羊的乳汁中成功的表达了凝血因子已在转基因羊的乳汁中成功的表达了凝血因子IXIX、白细胞介素白细胞介素2 2、尿激酶等多种药物蛋白、尿激酶等多种药物蛋白乳球蛋白乳球蛋白启动子启动子ATT显微注射显微注射绵羊卵细胞绵羊卵细胞母绵羊母绵羊纯合转基因绵羊纯合转基因绵羊PCR 方方法检测法检测收集转基因羊乳收集转基因羊乳ATT只在乳腺只在乳腺组织中表达组织中表达分离羊乳中的蛋白质分离羊乳中的蛋白质纯的纯的ATT（抗（抗胰蛋白酶）胰

44、蛋白酶）羊乳中含羊乳中含有有ATT在绵羊奶中生产在绵羊奶中生产ATT3 3、转基因猪、转基因猪以转化人的血红蛋白基因最为成功：以转化人的血红蛋白基因最为成功：v将人的将人的珠蛋白基因的调控区域与两个人珠蛋白基因的调控区域与两个人11珠蛋珠蛋白，一个人白，一个人aa珠蛋白基因相连接，构建载体，得珠蛋白基因相连接，构建载体，得到的转基因猪在血液中表达了人的血红蛋白到的转基因猪在血液中表达了人的血红蛋白v人们根据各种化学标准检测发现，它们与天然的人们根据各种化学标准检测发现，它们与天然的人的血红蛋白性质完全相同人的血红蛋白性质完全相同v利用转基因动物生产的人血红蛋白来辅助输血利用转基因动物生产的人血

45、红蛋白来辅助输血异种器官移植异种器官移植v 会产生强烈的排异反应：有相当一部分是由于仅会产生强烈的排异反应：有相当一部分是由于仅发生于非灵长类哺乳动物中的蛋白糖基化修饰造成发生于非灵长类哺乳动物中的蛋白糖基化修饰造成的的v在猪、牛等动物中，糖基化修饰的最后步骤是在在猪、牛等动物中，糖基化修饰的最后步骤是在1 1，3 3半乳糖基转移酶的作用下，在糖链的末端半乳糖基转移酶的作用下，在糖链的末端加两个半乳糖基，加两个半乳糖基，而这种修饰在人细胞中根本不存而这种修饰在人细胞中根本不存在，所以在器官移植后会产生针对这种在，所以在器官移植后会产生针对这种糖基糖基化修化修饰的超急性和急性排异作用饰的超急性和

46、急性排异作用超急性排异反应：超急性排异反应：完全完全针对糖针对糖链末端的链末端的1 1，3 3半乳糖基半乳糖基而产生的大量的抗体和补体而产生的大量的抗体和补体急性排异反应：急性排异反应：大部分大部分针对糖针对糖链末端的链末端的1，3半乳糖基而半乳糖基而产生的大量的抗体，同时有一产生的大量的抗体，同时有一些抗体是针对异源蛋白本身产些抗体是针对异源蛋白本身产生的，但无补体产生生的，但无补体产生补体补体抗体抗体半乳糖基半乳糖基vPPL Therapeutics Inc.PPL Therapeutics Inc.的两个研究小组各自的两个研究小组各自独立的通过细胞核移植克隆法获得了敲除一独立的通过细胞核

47、移植克隆法获得了敲除一个个1 1，3 3半乳糖基转移酶等位基因的猪，半乳糖基转移酶等位基因的猪，导致猪特异性的导致猪特异性的1 1，3 3半乳糖基修饰大半乳糖基修饰大大减少大减少2001年年12月底出生的月底出生的5只可爱的只可爱的敲除一个敲除一个1，3半乳糖基转移半乳糖基转移酶等位基因转基因克隆小猪酶等位基因转基因克隆小猪 ，这，这些转基因小猪将为研究和些转基因小猪将为研究和“生产生产”适用于人体移植手术使用的动适用于人体移植手术使用的动物器官提供巨大的帮助物器官提供巨大的帮助v转基因猪研究集中于：转基因猪研究集中于：(1)(1)生产性能的改良生产性能的改良v产生的转基因猪明显提高了产生的转

48、基因猪明显提高了饲料转化率、增重率，减少饲料转化率、增重率，减少了脂肪，但却出现关节炎、了脂肪，但却出现关节炎、胃溃疡、不育等副作用胃溃疡、不育等副作用(2)提高猪的抗病力提高猪的抗病力: : 基因转移是降低家畜疾病易感性的免疫策略之一基因转移是降低家畜疾病易感性的免疫策略之一 种属特异性疾病：从抗病的动物体中克隆出有关种属特异性疾病：从抗病的动物体中克隆出有关基因，将其转移给易感品种基因，将其转移给易感品种 病原体致病基因的反义基因导入畜禽细胞病原体致病基因的反义基因导入畜禽细胞近日，NatureBiotechnology杂志刊登了转基因猪可以抵抗呼吸综合症病毒的相关报告。美国研究人员利用C

49、RISPR-Cas9基因编辑技术剔除了CD163基因，繁殖出了能抵抗PRRS病毒的转基因猪。(3)(3)生产非常规畜牧产品生产非常规畜牧产品v利用转基因动物生产人类药用蛋白等非常规利用转基因动物生产人类药用蛋白等非常规畜牧产品，是目前世界上转基因研究的热点畜牧产品，是目前世界上转基因研究的热点之一之一(4)(4) 器官移植器官移植 ： 猪体在体重和生理上与人相似，器官与人的器官相猪体在体重和生理上与人相似，器官与人的器官相仿，实施手术相对快速简单仿，实施手术相对快速简单 猪容易饲养，成熟快，数量较多，没有伦理和安全猪容易饲养，成熟快，数量较多，没有伦理和安全性方面的问题性方面的问题 克服补体介

50、导的超敏排斥反应：受体的先天性补体克服补体介导的超敏排斥反应：受体的先天性补体系统缺陷或用抑制剂抑制受体的补体系统系统缺陷或用抑制剂抑制受体的补体系统 将少量的人类基因注入到将少量的人类基因注入到12个细胞阶段的猪胚胎个细胞阶段的猪胚胎中去，得到一二只会天然产生这些保护性蛋白的转中去，得到一二只会天然产生这些保护性蛋白的转基因小猪，虽然仍会携带使人类产生补体的半乳糖，基因小猪，虽然仍会携带使人类产生补体的半乳糖，但器官与组织已经得起人类的补体但器官与组织已经得起人类的补体我国成功研制出转基因猪皮我国成功研制出转基因猪皮 选择适宜的诱导免疫耐受基因，通过载体转入猪皮，选择适宜的诱导免疫耐受基因，

51、通过载体转入猪皮，使猪皮产生与人皮结构相近的细胞因子使猪皮产生与人皮结构相近的细胞因子 猪的体表面积大，皮源丰富，特别是猪皮在结构、猪的体表面积大，皮源丰富，特别是猪皮在结构、理化特性及功能等方面均与人类的皮肤相似理化特性及功能等方面均与人类的皮肤相似4、转基因兔、转基因兔v旁帕氏病（遗传性糖原贮积病）旁帕氏病（遗传性糖原贮积病） 是由于是由于葡糖苷酶失活而造成的遗传病葡糖苷酶失活而造成的遗传病v编码编码葡糖苷酶的基因转入兔，获得可在乳汁中葡糖苷酶的基因转入兔，获得可在乳汁中分泌的分泌的葡糖苷酶的转基因兔，酶产量高达葡糖苷酶的转基因兔，酶产量高达1g/1L1g/1L， 只需只需200200只兔

52、子就可满足全世界患者一年对只兔子就可满足全世界患者一年对葡糖苷酶的需求葡糖苷酶的需求v兔子成熟快、饲养成本低、产奶量相对较大，成为兔子成熟快、饲养成本低、产奶量相对较大，成为转基因动物生物反应器的候选物种转基因动物生物反应器的候选物种5、转基因禽类、转基因禽类v具有独特性质：具有独特性质：禽类的受精过程中，同时有好几个精子进入卵细胞，禽类的受精过程中，同时有好几个精子进入卵细胞，无法分清哪一个精前核将与卵前核融合无法分清哪一个精前核将与卵前核融合胚胎移植困难：禽类受精后其卵细胞很快就会裹上胚胎移植困难：禽类受精后其卵细胞很快就会裹上一层坚固的膜，周围是大量的清蛋白，再被内外一层坚固的膜，周围是

53、大量的清蛋白，再被内外两层壳膜封闭起来两层壳膜封闭起来无法分辨禽类的特异的胚胎干细胞无法分辨禽类的特异的胚胎干细胞v科学家设想：科学家设想：v从供体鸡中取出囊胚细胞，利用脂质体与外源基因从供体鸡中取出囊胚细胞，利用脂质体与外源基因DNADNA的复合体进行转染，将外源基因导入新孵鸡卵胚的复合体进行转染，将外源基因导入新孵鸡卵胚胎的胚囊腔内胎的胚囊腔内v有些子代中就包含了混合细胞，在大部分的受体细有些子代中就包含了混合细胞，在大部分的受体细胞中混合了部分供体细胞的这种遗传混合体，称为胞中混合了部分供体细胞的这种遗传混合体，称为嵌合体（嵌合体（chimerachimera）v在一些嵌合体内，由转染细

54、胞传代产生的细胞有可在一些嵌合体内，由转染细胞传代产生的细胞有可能发育成为部分生殖系统组织，并形成生殖细胞。能发育成为部分生殖系统组织，并形成生殖细胞。人们可以通过对这些嵌合体进行连续杂交，建立起人们可以通过对这些嵌合体进行连续杂交，建立起转基因鸡系转基因鸡系分离囊胚细胞分离囊胚细胞卵黄卵黄囊胚层囊胚层通过脂质体转染通过脂质体转染外源基因外源基因把转染的囊胚细胞注把转染的囊胚细胞注射入胚盘下腔空间射入胚盘下腔空间卵黄卵黄胚盘下空间胚盘下空间异源嵌合体异源嵌合体未转基因鸡未转基因鸡转基因鸡转基因鸡研究人员首先在病毒中添加了可合成研究人员首先在病毒中添加了可合成绿色荧光蛋白质的水母基因绿色荧光蛋白

55、质的水母基因GFP，然，然后再将病毒基因植入鸡蛋中。从这些后再将病毒基因植入鸡蛋中。从这些鸡蛋孵出来的鸡经过紫外线照射后，鸡蛋孵出来的鸡经过紫外线照射后，头部发出了亮绿色的荧光头部发出了亮绿色的荧光基基因因一一旦旦被被改改动动，一一方方面面可可能能引引起起生生物物体体内内一一系系列列未未知知的的结结构构与与功功能能的的变变化化；另另一一方方面面，转转基基因因操操作作对对生物体的影响会通过遗传传递生物体的影响会通过遗传传递6 6、转基因技术的安全性问题、转基因技术的安全性问题MM外外外外源源源源基基基基因因因因引引引引入入入入后后后后，是是是是否否否否会会会会影影影影响响响响其其其其他他他他重重

56、重重要要要要的的的的调调调调节节节节基基基基因因因因，甚甚甚甚至至至至会会会会激活原癌基因？激活原癌基因？激活原癌基因？激活原癌基因？MM转转转转基基基基因因因因技技技技术术术术的的的的广广广广泛泛泛泛应应应应用用用用是是是是否否否否会会会会导导导导致致致致难难难难以以以以消消消消灭灭灭灭的的的的新新新新病病病病原原原原物物物物出出出出现现现现？MM是否会造成生态学灾难？是否会造成生态学灾难？是否会造成生态学灾难？是否会造成生态学灾难？MM人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？

57、人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？v转基因食品安全性评价原则转基因食品安全性评价原则实质等同性原则实质等同性原则预先防范原则预先防范原则个案评估原则个案评估原则逐步评估原则逐步评估原则风险效益平衡的原则风险效益平衡的原则v转基因动物制品的安全性转基因动物制品的安全性从表达产物中除去能引起人类变态反应的非人类从表达产物中除去能引起人类变态反应的非人类蛋白蛋白产品与人体蛋白有足够的相似性产品与人体蛋白有足够的相似性不携带任何对人类有害的基因、病原微生物不携带任何对人类有害的基因、病原微生物第四节第四节 动物生物反应器动物生物反应器v概述概述v乳腺生物反应器乳腺生物反应器v其它生物

58、反应器其它生物反应器v存在问题与发展前景存在问题与发展前景v动物生物反应器动物生物反应器经人们的有意干涉，通过实验手段，将外源目的经人们的有意干涉，通过实验手段，将外源目的基因导入动物细胞中，稳定地整合到动物基因组基因导入动物细胞中，稳定地整合到动物基因组中，并遗传给子代的转基因动物中，并遗传给子代的转基因动物转基因动物作为生物产品制造工厂，生产人类所转基因动物作为生物产品制造工厂，生产人类所需的药用蛋白需的药用蛋白乳腺、血液乳腺、血液、泌尿系统、精囊腺、泌尿系统、精囊腺一、概述一、概述利用乳腺来生产药物蛋白利用乳腺来生产药物蛋白v“pharmingpharming”v原因：原因： 乳汁可以由

59、乳腺不断的分泌，而且产量很乳汁可以由乳腺不断的分泌，而且产量很高，长期收集也不会对动物造成伤害高，长期收集也不会对动物造成伤害 将新的药物蛋白限制在乳腺内生产，最后将新的药物蛋白限制在乳腺内生产，最后分泌到乳汁中，一般不会对转基因动物的正分泌到乳汁中，一般不会对转基因动物的正常生理生活造成影响常生理生活造成影响 乳腺分泌的蛋白质是经过高等哺乳动物的乳腺分泌的蛋白质是经过高等哺乳动物的翻译后加工的，这使得生产的药物蛋白更接翻译后加工的，这使得生产的药物蛋白更接近于人类自身的蛋白质近于人类自身的蛋白质 乳汁中蛋白质纯化起来相对较为容易，而乳汁中蛋白质纯化起来相对较为容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白

60、质也为数不多且在乳汁中含有的其他蛋白质也为数不多二、乳腺生物反应器原理二、乳腺生物反应器原理v指用重组指用重组DNADNA技术和转基因技术，将目的基因转移置技术和转基因技术，将目的基因转移置尚处于原核阶段（尚处于原核阶段（1 1、2 2细胞的受精卵）的动物胚胎细胞的受精卵）的动物胚胎中，经胚胎移植，得到转基因乳腺表达的个体中，经胚胎移植，得到转基因乳腺表达的个体v需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区v酪蛋白、乳清蛋白酪蛋白、乳清蛋白鼠乳清酸性蛋白（鼠乳清酸性蛋白（WAPWAP）基因表达构件、牛）基因表达构件、牛- -乳球乳球蛋白（蛋白（BLGBLG）基因表达构件

61、、牛）基因表达构件、牛s1-s1-酪蛋白基因表达、酪蛋白基因表达、- -酪蛋白基因表达构件酪蛋白基因表达构件二、乳腺生物反应器原理二、乳腺生物反应器原理v目的基因的选择目的基因的选择选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因量低、应用前景广阔的蛋白基因三、乳腺生物反应器建立方法三、乳腺生物反应器建立方法v目的基因及乳腺特异蛋白表达启动子序列的获得目的基因及乳腺特异蛋白表达启动子序列的获得外源基因组外源基因组DNADNA片段，包括调控序列及

62、基因内序列片段，包括调控序列及基因内序列大容量载体大容量载体定点整合定点整合v将表达载体转染至动物乳腺细胞表达，提取细胞分泌将表达载体转染至动物乳腺细胞表达，提取细胞分泌蛋白，检测目的基因表达情况蛋白，检测目的基因表达情况v利用显微注射等方法将有效的乳腺特异表达载体转入利用显微注射等方法将有效的乳腺特异表达载体转入受体胚胎细胞，通过胚胎移植，获得在乳腺特异高效受体胚胎细胞，通过胚胎移植，获得在乳腺特异高效表达外源基因的转基因动物表达外源基因的转基因动物四、其它生物反应器四、其它生物反应器v动物血液生物反应器动物血液生物反应器利用血液定位表达的转基因动物生物反应器利用血液定位表达的转基因动物生物

63、反应器缺陷：生产有活性的蛋白或多肽进入转基因动物缺陷：生产有活性的蛋白或多肽进入转基因动物血液循环时影响动物的健康血液循环时影响动物的健康适合生产人血红蛋白、抗体或非活性的融合蛋白适合生产人血红蛋白、抗体或非活性的融合蛋白v动物尿腺（膀胱）生物反应器动物尿腺（膀胱）生物反应器膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基而且它的基因是高度保守的因是高度保守的,将外源基因插入将外源基因插入5端调控序列中端调控序列中,就就可以指导外源基因在尿中表达可以指导外源基因在尿中表达优

64、点：优点：v可直接非侵入性地收集产物可直接非侵入性地收集产物v从尿中获得产物经济有效且纯化方法多从尿中获得产物经济有效且纯化方法多v生产周期短，雌雄动物均可获得表达产物生产周期短，雌雄动物均可获得表达产物v动物精囊腺生物反应器动物精囊腺生物反应器利用小鼠利用小鼠P12P12启动子在雄性动物副性腺（前列启动子在雄性动物副性腺（前列腺、精囊腺、尿道球腺）的特异性表达模型腺、精囊腺、尿道球腺）的特异性表达模型，在在转基因小鼠的精液中转基因小鼠的精液中获得了人生长激素获得了人生长激素关于该系统能表达的蛋白质的复杂程度以及分关于该系统能表达的蛋白质的复杂程度以及分泌的机制目前尚不明确泌的机制目前尚不明确v鸡蛋生物反应器鸡蛋生物反应器家禽转基因技术相对落后家禽转基因技术相对落后生产重组药用蛋白：降低成本、提高效率生产重组药用蛋白：降低成本、提高效率生产免疫球蛋白：不会产生副作用生产免疫球蛋白：不会产生副作用五、动物生物反应器存在的问题与发展前景五、动物生物反应器存在的问题与发展前景v构建动物生物反应器成功率低构建动物生物反应器成功率低v造成宿主基因突变问题造成宿主基因突变问题v外源基因表达水平不高外源基因表达水平不高v逆转录病毒转染法研究中存在问题逆转录病毒转染法研究中存在问题