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1、三、电泳法三、电泳法（electrophoresis）n历史及应用历史及应用n分类分类（据原理）（据原理）n基本原理基本原理n常用电泳法例举常用电泳法例举 全属于区带电泳（注意介质）n电泳法最早由瑞典的Tiselius于1937建立，用移界电泳法成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即白蛋白、1 - 、2 - 、-、和-球蛋白。n在药学领域，是生化药物和基因工程药物分析的重要手段。按分离原理分类n移界电泳移界电泳 （moving boundary EP）n区带电泳区带电泳 (zone EP)n等速电泳等速电泳 (isotachophoresis)n等电聚焦等电聚焦 (isoelectricfoc
2、using)不同电泳法的分离原理示意图AB+B A B AABB AABCC B A移界移界区带区带A B C等速等速等电聚焦等电聚焦pH9 8 7 6混合混合分立分立稳态稳态时毗邻时毗邻稳态稳态时分立静时分立静止止高效毛细管电泳（high performance capillary electrophores,HPCE）毛细管区带电泳毛细管等电聚焦与一般电泳法的区别与一般电泳法的区别： 使用了毛细管柱。使用了毛细管柱。极为高效。极为高效。基本原理基本原理： 在电场作用下,溶质因 迁移率(泳动率)不同而达到分离.阻力: f=6rvrv (r(r为质点直径; ; 为介质粘度;v v为迁移率) )
3、受力分析动力: F=EQq质荷比q质点有效直径q溶液粘度q离子强度q电渗现象影响因素影响因素离子氛现象：被分离的粒子（如蛋白），在离子强度大的体系中。离子氛现象明显。具相反电荷的粒子阻碍了粒子的运动, 朝相反方向运动.离子强度对电泳的影响离子强度 +离子氛迁移率电渗现象对电泳的影响 电渗电渗：液体在电场中对固体支持物固体支持物的相对移动固体固体- - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + +电渗方向 介质介质 原理原理 特点特点纸电泳纸电泳Paper electrophoresis 纸（纤维纸（纤维素）素）质荷比质荷比分辨率低分辨率低醋酸纤
4、维素醋酸纤维素薄膜电泳薄膜电泳醋酸纤维醋酸纤维素素质荷比质荷比在纸电泳基础上的在纸电泳基础上的改进改进PAGE法法聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶质荷比质荷比+分子分子筛筛凝胶不仅作为支持凝胶不仅作为支持物，且以分子筛主物，且以分子筛主动参与样品的分离。动参与样品的分离。SDS-PAGE聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶分子筛分子筛用于测定蛋白质亚用于测定蛋白质亚基的分子量基的分子量琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳电泳 琼脂糖琼脂糖分子筛分子筛因孔径大，用于核因孔径大，用于核酸的研究酸的研究醋酸纤维素较纸电泳的优点n电渗现象影响小n醋酸纤维素膜对蛋白的吸附小，几无“拖尾”。n由于醋酸纤维素亲水性小，所容纳的缓冲
5、液也较少，电流大部分是由样品传导，所以分离速度快。醋酸纤维素是纤维素（纸）的醋酸酯醋酸纤维素是纤维素（纸）的醋酸酯丙烯酰胺丙烯酰胺 + N，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 具三维空间凝胶网络具三维空间凝胶网络聚合聚合催化剂：催化剂：过硫酸铵过硫酸铵（AP）催化生成自由基加速剂：加速剂： 四甲基乙二胺四甲基乙二胺（TEMED）提供自由基为什么聚丙烯酰胺具有分子筛的作用？为什么聚丙烯酰胺具有分子筛的作用？（不同的配比不同的配比 不同的孔径不同的孔径）SDS-PAGE与PAGE有什么区别呢？SDS（十二烷基磺酸钠）十二烷基磺酸钠）+蛋白蛋白线性复合物线性复合物使复合物所带负电荷远超过天然使复合物所
6、带负电荷远超过天然蛋白本身电荷，蛋白本身电荷，消除了电荷效应消除了电荷效应，而而分子量占主导分子量占主导。琼脂琼脂糖琼脂胶脱去SO42-丙酮酸酯基应用应用由于孔径大，对大多数蛋白来说，其分子筛作用微不足道。因此广泛应用于核酸的研究，分离范围广（200bp-50kb的DNA）.PAGE圆盘电泳（disc EP）不连续平板电泳（slab EP）连续样品胶 （溶解样品）浓缩胶 （无分子筛作用，浓缩样品）分离胶 （主要分子筛兼有质荷比）discNotice: 1.两化合物均是中枢神经系统毒物,避免吸入粉尘和接触皮肤。 2.染色： 一般用考马斯亮蓝R-250（595nm）若灵敏度要求高，用微量银染（灵敏
7、度较前者大100倍）Steps: 1.制胶 2.上样 3.电泳 4.染色Steps:1.loadedwithDNA2.beingrunbytheapplicationofanelectriccurrent3.Observation.ThesmallerthepieceofDNA,thefasteritrunsinthegel.4.observeunderultravioletlightwhenthecurrentisturnedoff.thegelisstainedwithethidiumbromide(EB).Result Notice :溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用溴化乙锭是一
8、种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液洒在台面上，用后用水彻底冲洗干净洒在台面上，用后用水彻底冲洗干净四、生物检定法定义定义： 利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。生物检定的应用范围v药物效价测定药物效价测定 1.理化方法不能测定含量 2. 虽可用理化方法测定，但理化测定不能反映临床生物活性 或效价（如氨基苷类）v微量生理活性物质的测定微量生理活性物质的测定 因浓度低，很难用理化方法测定（神经介质、激素等） 注意点：只有当无适当理化方法时，才用生物检定只有当
9、无适当理化方法时，才用生物检定法。它是理化检验的一个补充。法。它是理化检验的一个补充。原因原因 由于生物差异的存在，生物检定结果误差较大，重现性比较差，需要控制的条件较多；测定费时，计算繁琐。 谢谢！DNA-19缺点缺点：存在对流。成分相互重叠。定义定义: 在一根在一根U型管里的型管里的溶液溶液中中,各物质据各物质据泳动速率泳动速率的不同的不同,达到分离达到分离.移界电泳移界电泳+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10人工人工pH梯度梯度基于如蔗糖的密度梯度。自然自然pH梯度梯度基于载体两性电解质分辨率分辨率0.01pH单位单位定义定义:在电泳过程中在电泳过程中,应用各种不同的应用各种不同的惰性支持介质惰性支持介质(醋酸纤维素醋酸纤维素,聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖等聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖等)使具有使具有不同泳动速率不同泳动速率的各组分形成的各组分形成各自各自的区带的区带.区带电泳区带电泳
