蛋白质的结构测定PPT课件

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1、u第一节蛋白质溶液的热力学u第二节蛋白质折叠动理学u第三节突变、稳定性和折叠1热运动与蛋白质构象2热力学函数与热力学平衡3热容量4vant Hoff焓5折叠/退折叠转变6量热法与折叠过程热力学第十讲蛋白质的物理化学性质分析u第一节蛋白质溶液的热力学u第二节蛋白质折叠动理学u第三节突变、稳定性和折叠一、折叠动理研究技术二、两态动理三、过渡态1.折叠过程与过渡态2.对折叠过渡态的性质分析四、折叠中间态1.熔球态2.快态与慢态3.二硫键引起的中间态4.多结构域蛋白的折叠第十讲蛋白质的物理化学性质分析五、折叠的基本过程1.接触形成2.螺旋-链环转变3.-发卡形成u第一节蛋白质溶液的热力学u第二节蛋白质

2、折叠动理学u第三节突变、稳定性和折叠二、突变与热稳定性1.疏水突变2.氢键突变3.适应极端条件的突变体一、热力学参数在分子水平上的解释1.静电相互作用2.范德华相互作用3.氢键4.疏水效应5.二硫键第十讲蛋白质的物理化学性质分析三、突变与折叠过程1.过渡态的突变分析2.突变对稳定性和折叠过程的影响Nuclear Magnetic Resonance (NMR) X-ray Crystallography Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 第十一讲蛋白质的结构测定Nuclear Magnetic Resonance (NMR) X-ray Crystallog

3、raphy Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Does not need crystals. More information about dynamics. Limit to MW 40,000. Less reliable. +-Atomic resolution. +Unlimited size. +Time-resolved study can be performed. +Techniques very robust. +Need crystals. -Deal with very large complex. +Various sample fo

4、rms can be studied. +Lower sample purity. +Does not need crystals. +-Complicated experimental procedures.Lower resolution. -第十一讲蛋白质的结构测定X 射线晶体结构分析是使用X 射线作为物理工具，以晶体作为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种分析方法。所以，从使用的物理工具和研究对象的观点出发，它包含了X 射线和晶体这两方面内容。 1. X 射线X 射线是德国物理学家伦琴在1895 年发现的。随后，人们发现了X 射线的波动本质，其波长范围大约在0.0110 nm 的范围。

5、 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 晶体结构分析所使用的X 射线波长大多在0.l nm 左右，与分子中原子的距离相当。X 射线的生成主要有两种完全不同的方式，一种是阳极靶材料受到高能电子的轰击，原子的内层电子跃迁到外层后又跳回内层发出的所谓特征X 射线。这种X 射线的波长严格和构成该材料的原子能级相匹配。比如铜的K辐射，是铜的K 壳层电子跃迁到L 层又返回K 层后所发出的辐射，其波长约为0.154 nm ，这是X 射线晶体结构分析经常使用的X 射线波长。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 生成X 射线的另一种方式是同步

6、加速器辐射。当接近光速的高能带电粒子在磁场中沿曲线轨道运行时，沿切线方向就辐射出电磁波，电磁波的波长和强度与电子能量相关联。它是使用同步加速器的高能物理研究实验室所提供的寄生辐射，其波长在0.01 nm1 m 之间（从紫外线到X 射线），见图5-20。 同步辐射因其辐射强度高、波长连续可变、准直性能好等特点而在许多科学领域内获得了广泛的应用，其中包括X 射线晶体结构分析。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 2 . X 射线衍射X 射线晶体结构分析所依赖的物理原理是X 射线的衍射现象，衍射现象的产生是X 射线与组成晶体的原子核外电子相

7、互作用的结果。X 射线衍射是劳厄（Laue ）等人在1912 年发现的。当不考虑衍射线强度时，X 射线衍射与可见光的衍射很相似，简单说来，都是光线通过光栅后改变了光线的传播方向的一种物理现象。当光线打到光栅上时，光栅上的每一个结点都变成了一个点光源，它们向四面八方发射出与入射线有相同波长的散射线，散射线在空间的叠加就会产生衍射现象。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 条件是光栅的尺寸要和射线的波长是同数量级的，这样光栅上不同结点上的散射线才能发生相干，即叠加。这是因为散射线的路径方向不同会产生一个光程差，从而造成散射线叠加，其后果为，在空间的某处光波加强，在另一处则是减弱或相消。

8、晶体中分子内原子间距在0.1 nm 范围左右，所以使用波长0.l nm 左右的X 射线可以使晶体产生衍射现象，这是因为核外电子散射X 射线的结果。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 著名的布拉格公式(2dhklsin=n)就是根据散射线叠加的原理推导出来的。它将入射线波长、衍射线方向以及光栅结构三者建立起了数学的定量关系，为X射线晶体结构分析奠定了基础。当然，光有布拉格公式还是不够的，因为它仅仅将光栅结构（晶体中晶胞的大小和形状，包括它的对称性）和衍射方向联系了起来，至于晶胞中的原子种类及其在晶胞中的分布位置还要靠衍射线的强度信息才能推导出来。所以，还要介绍富里哀综合法在测定晶体

9、结构中的应用。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 3 周期函数和富里哀定理周期函数就是一个自身重复的函数。富里哀理论表明，任何一个有理的周期函数都可以通过把足够数量的正（余）弦函数相叠加起来构成原来的那个周期函数。晶体中原子的核外电子在空间的分布是周期重复的，被称为电子密度。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 4 晶体晶体是衍射光栅，是X 射线晶体结构分析的研究对象。要想使用X 射线衍射来测定某物质的结构，就必须将该物质先制备成晶体。晶体的最基本特征是它的内部高度有序性。也就是说，组成晶体的分子、原子在三维空间中是严格按着一定次序周期排布的，只有这样才能形成衍射光栅

10、。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 晶体的最小结构单位叫晶胞，晶体就是通过晶胞在三维空间的周期重复（平移）而构成的。可以想象成晶体里面存在着无数个形状、体积完全相同的小平行六面体，这些平行六面体面靠面，边靠边，中间无缝隙。通常，一个中等大小的单晶体，边长23mm 的立方体内含有1020个左右这样的平行六面体。显然，仅根据物质在晶体中周期排布这一性质来选晶胞是不行的（选取方式太多），所以又增加了一些规则，如晶胞的三边尽量成直角等。于是，晶胞的选取只有7种类型，称为7种晶系。此外，通过深入的研究又发现，晶体中结构通过平移产生的重复部分又被划分成14种不同类型的点阵，这都是几何晶体学

11、的内容 。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 晶体的另一个重要性质就是对称性。晶胞存在的可能的230 个空间群，就是利用一定的对称操作将某物质的可重复部分在14 种晶体点阵上的安排加以总结的结果。因为晶胞有对称性，所以晶胞内部由对称元素相关的最小单位又称为不对称单位。不对称单位是晶体结构分析的单位，它虽然是分子结构的独立单位，但它不是晶体的重复单位，因为它不说明晶体的周期性质。显然，只有晶胞才是晶体的最小单位。它们之间的关系可由图5-6 所示。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 图5-6 晶体中晶胞和不对称单位的关系。

12、(a)不对称单位中有一个或多个分子；(b)分子由空间群对称操作形成一组分子集合；(c)分子集合形成晶胞；(d)晶胞平移形成晶体。5 天然和重组蛋白质X 射线晶体结构分析的特殊性早在1830 年就有了血红蛋白晶体，而且直到X射线晶体学问世(1930年前后)，蛋白质晶体已有很多，但直到1934 年，英国 著 名 晶 体 学 家 伯 纳 尔 （ J. Bernal） 和 克 萝 芙 特 （ D. Crowfoot, 就是1956年解出维生素B12晶体结构的霍奇金教授，她因此而获得1964 年诺贝尔奖）才发现，研究蛋白质晶体应该和小分子晶体完全不同，后者往往是暴露在空气中；而前者必须与母液一起密封在毛

13、细管内，以免蛋白质晶体暴露在空气中因失水而破坏。经历了整整20年，第一张完美的蛋白质晶体 胃蛋白酶的X 射线衍射照片才出世。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 佩鲁茨（Perutz ）曾于1937 年将血红蛋白的X 射线晶体结构分析作为他的博士论文，但他完成血红蛋白的0.55 nm 分辨率的晶体结构是1959 年，这是第二个问世的蛋白质晶体结构。第一个蛋白质晶体结构是肯德鲁（Kendrew ）于1957 年完成的肌红蛋白的0.6 nm 分辨率结构。他们使用了相同的方法同晶置换法，并因此而获得了1962 年的诺贝尔奖金。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 同晶置换法的

14、大意是：要对所研究的蛋白质晶体中的分子做一点化学修饰，即在分子的特定位置上加入一些重原子。所谓重原子，就是元素周期表中碘原子以上的原子，相对于构成蛋白质的碳、氮、氧原子来说它们就是重原子。当然，这种化学修饰不能破坏晶体的周期排布性质。利用引进的重原子所造成的衍射线强度的差别，使用帕特森函数就有可能推出位相信息。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 数据精度不够就需要改进收集衍射数据的仪器设备。早期的X光机功率低，无论是封闭管式还是可拆式，X 光能量都很低。使用X 光胶片又引进了一系列误差。所以X 射线衍射仪、转靶X 光机、细聚焦X 光管、多丝面探测器、图像板（image plate

15、 ）、同步加速器辐射都应运而生了。另一方面，蛋白质晶体学总是率先使用当代运转最快速的电子计算机，这是因为它所需要的运算量极大，特别是对结构模型的精化，没有大容量、速度快的计算机是不行的。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 在蛋白质晶体结构分析方法没有突破以前，培养蛋白质晶体当然不是个主要问题。早期，人们乐观地看到在马脾上滴几滴硫酸镉溶液就可以获得一种蛋白质晶体，待到方法突破之后，人们才真正体会到蛋白质晶体的生长原来是结构分析的一个瓶颈。用于小分子晶体生长的简单蒸发过饱和法不适用于蛋白质晶体的生长。所以蛋白质晶体生长技术也成了蛋白质晶体学发展的一部分。 一、概念基本原理 第一节 X

16、 射线晶体结构分析 最后，对X射线晶体结构分析的基本原理和光学显微镜的成像原理作一个简单的类比。光学显微镜使人们能见到肉眼见不到的东西，这是因为和光波波长相当的样本距离（如细胞器等）可以作为光波的衍射光栅，衍射线经物镜的组合聚焦（叠加）给出了一个实体的虚像，然后经目镜放大，人们就可以见到细胞器了。这样说来，X射线衍射晶体结构分析和光学显微镜应该有大致类似的物理学原理，所不同的是人们找不到一个透镜来聚焦X射线，所以必须通过富里哀加和来重现电子密度。同时，在富里衰加和时又需要解决位相问题，这就使问题复杂化起来。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 科学的发展正使人们发现一些更简单的方法

17、最终可以直接看到复杂的蛋白质三维结构。比如，X光激光不断向短波方向延伸，就有可能发明X光激光显微镜，因为激光的位相已知，将会使问题大大简化。在现阶段，由于仪器技术和方法的不断改进，以前测定一个蛋白质的结构需要以年计算，而现在可能只需要以天计算了。第三代同步辐射的应用，使晶体小到2040nm的蛋白质复合物等结构得以测定并达到原子分辨率水平。这些复合物有上百纳米的大晶胞，使衍射数据量达到天文数字。同时，由于极强的同步辐射光源加上极细的聚焦，使蛋白质结构的动态研究成为可能，如大分子酶在晶体中的催化过程。目前，时间的分辨已可达到纳秒的水平。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 由于X射线衍

18、射分析技术的发展，以及核磁共振、蛋白质结构预测等技术在蛋白质结构分析中的应用，使20 世纪末又诞生了一门新兴学科结构生物学。该学科是以生命物质的空间结构的运动性为基础来阐明生命活动本质的一门学科，特别是在人体基因组定位之后，又发展成为结构基因组学或称结构蛋白质学，其目的就是获得全部蛋白质的三维结构与功能的关系。显然，结构生物学在研究基因功能的战略任务上将起到关键性的作用。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 反过来，基因功能研究的需要，又要求快速、准确、系统地测定每一个基因所表达的蛋白质结构，目前人们也只是掌握了其中的12而已。这就要求发展快速批量表达基因的方法，与蛋白质纯化、培养

19、晶体、数据收集、分析结构形成“一条龙”，使用最先进的软件和技术使晶体结构分析达到全自动化。这样一来，就可使晶体结构分析的过程大大简化到犹如操作一台普通的光学显微镜，甚至达到使中学生也可以使用的程度。实现结构的全自动化分析（其中不仅是X射线晶体结构的全自动化分析，还包括NMR的全自动化分析），是结构基因组学的基本要求，否则很难想象实现工业化大批量“生产”蛋白质的三维结构，也就谈不上基因功能研究的现代化。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 蛋白质X 射线晶体结构测定的基本过程 经基因克隆、表达后所生成的蛋白质提纯。这一步原属于生物化学工作者的工作，在结构基因组学时代，很多实验室已把这

20、一步工作作为X 射线晶体学工作的第一步。 晶体生长并经冷冻技术处理； 重原子衍生物制备； 衍射数据收集； 衍射数据分析和改进； 获得最后的结构模型（包括修正）。以上的步骤也是结构测定全自动化分析的几个基本环节 。 一、概念基本原理 第一节 X 射线晶体结构分析 蛋白质结晶和晶体生长是影响结构分析速度的重要阶段。 1 对原材料的要求 晶体的重要特征是其内部的高度有序性，所以要求能够生长晶体的原材料也应具有高度的均一性。构成原料的微观不均一性的某些方面对某些生物化学研究可能是不重要的，但直接影响到大的单晶的形成。 要求在长晶体以前对其生物化学性质尽量有一个非常透彻的了解，样品的分离提纯条件往往就是

21、晶体生长的最佳条件之一。同时，还要对样品中的内含物做到心中有数，特别是金属离子，需要了解清楚。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 蛋白质结晶和晶体生长是影响结构分析速度的重要阶段。 1 对原材料的要求 在拿到样品之后，最好是做一个等电聚焦，考察一下是否是一条带，若不是就要小心了。还要注意到样品在运输过程中的变化，样品一般应以冻干粉保存，否则就应该处于液氮保存状态之下。使用样品一般应在低温状态下操作，若发现有纯度问题就要小心鉴定，最后很可能不得不使用高压液相层析（HPLC ）来分析，甚至分离。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 2 晶体生长的生物化学条

22、件 小分子晶体生长的自由能、相平衡理论，溶质、溶剂分散以及排斥和相互作用的学说等很难应用于蛋白质的晶体生长，由于蛋白质构象固有的复杂性，目前尚无法对溶液中的自由能、固态中可能形成的键数以及键能等因素进行精确的理论计算和预测，所以，蛋白质的晶体生长仍以经验总结为主。蛋白质晶体生长的生化条件主要是指pH 值、离子强度、沉淀剂和添加剂（如有机溶剂、盐或去垢剂）的浓度等因素。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 首先要注意到，生物化学的分离、提纯过程就是蛋白质不断均一浓缩的过程。在纯化的最后阶段，一旦溶液中的蛋白质达到了溶解度最小的条件, 同时蛋白质溶液达到过饱和的时候，蛋白质在溶

23、液中是处于亚稳态，蛋白质就能成核并形成晶体，从溶液中析出。关键是要使这个过程足够缓慢，使蛋白质有机会形成规则的周期排布，才能形成大晶体。如果这个过程发展得太快，尽管晶体生长的条件已经满足，蛋白质还是完全有可能以无定形状态或微晶从溶液中析出。所以，要了解蛋白质分离、纯化的条件，注意蛋白质的稳定性、溶解度的信息，注意纯度、浓度和活力等有关信息。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 在摸索晶体生长的过程中，首先是缓冲液的选取，其次是沉淀剂，然后是蛋白质浓度，对有些蛋白质来说，还要考虑到使用特殊的金属离子、防氧化剂、防腐剂，甚至底物和辅酶等，余下的就是经验了。比如，应该了解离子强度

24、对蛋白质的影响，必要时做实验曲线了解“盐析”或“盐溶”的范围。比如，是配制蛋白质的过饱和清液还是使沉淀的蛋白质缓慢溶于饱和蛋白质溶液中？比如，蛋白质无定形沉淀的回收和再使用都是值得探讨的问题。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 3 晶体生长的物理条件这里所说的物理条件是指温度、震动、溶剂的清洁度、试剂的纯度、重力等因素。在生物化学条件合适的情况下，往往就可以得到微晶，物理条件掌握得好，才可以获得大的单晶，因为物理条件控制了晶核形成的速度和晶体生长的速度。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 温度是首先应该注意到的问题。一般情况下，蛋白质皆不能耐受高温，

25、大多数蛋白质在6070下要变性，有些蛋白质只有在低温下才能保持其活力。对不同蛋白质选择一个合适的温度并将温度保持恒定是晶体生长的基本要求。温度的变化会造成蛋白质溶液过饱和的扰动，改变蛋白质的溶解度，这都是对大晶体生长非常不利的。反过来说，基于同样的理由，有一种晶体生长方法是专门利用温度来调节蛋白质溶解度的，其先决条件是温度必须是单向缓慢地变化，即由高温到低温的缓慢变化，使蛋白质溶解度缓慢降低而达到过饱和，这就是有名的热盒子法。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 震动因素也是一个需要考虑的重耍问题。震动往往也会造成蛋白质溶液的局部扰动，加速晶核的形成，所以晶体生长需要防震。

26、一般要在水泥台上进行实验，同时不要因为性急而常常观察。在失重情况下进行蛋白质晶体的生长已有很多实验报道，没有地心引力会使蛋白质溶液更趋于均匀状态，减少晶核的形成，因此在外太空长晶体成功的例子不少。但是震动问题不易控制，因此失败的例子也不少，这也说明了防震的重要性。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 4 技术和方法X射线衍射晶体结构分析用的大晶体生长的技术和方法也在不断地发展之中，整个的趋势是微量化和自动化，这主要是基于原材料少、难于分离提纯的缘故，晶体生长实验由毫升数量级降到微升数量级再降到纳升数量级。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 最简单的方法

27、是分批静置法（batch method ）。将蛋白质的过饱和溶液配好，根据体积大小分装在大小不同的试管中并密封，然后置于培养箱中控制各项物理因素(温度、防震）。晶体将从预先配置好的过饱和溶液中缓慢生长。用这种方法可以使溶液体积小到几微升，这种简单的方法虽然很有效，但用来摸索晶休生长的条件时有一个致命的弱点：很难改变晶体生长的化学条件。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 最常用的方法当属悬滴法。将溶液分成两部分，含有蛋白质的悬滴滴在盖玻片上，不含蛋白质但含有某种盐类的相同溶液放于贮液槽中。由于盐浓度不同，造成悬滴和贮液槽之间的水蒸气压力的不同，从而发生水蒸气的交换，使悬滴中

28、蛋白质浓度逐步变浓，从而达到蛋白质缓慢的过饱和。可想而知，这个过程是缓慢的，而且缓慢的程度还可以随盐浓度的改变而变化。贮液槽中的溶液在实验过程中可调，悬滴的量又可以很小，这些都是这个方法的优点，所以该方法是晶体生长的最常用方法。同时，因为它的上述优点，也使它非常适合于晶体生长的条件摸索实验 。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 5 蛋白质晶体的鉴定在某些情况下，在蛋白质晶体生长过程中，会长出盐或某些沉淀剂的晶体，这需要小心加以鉴别，特别是在微晶状态下。晶体已达到一定线度就可以进行X 射线衍射实验，蛋白质分子量大、晶胞大，所以衍射点密集、分辨率低，而小分子正好相反，并不难辨

29、别。以下提到的一些方法对鉴别蛋白质微晶或许会有帮助。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 蛋白质晶体往往长得没有小分子晶体漂亮，边界常常不完整，很容易形成多晶。在低倍光学显微镜下使用针来触碰微晶，可以感到小分子晶体偏硬，容易碎成两半或几瓣；蛋白质晶体偏软，容易碎成粉。如果溶液变干，蛋白质晶体由于脱水而变坏；小分子晶体则不变化。用湿滤纸触碰，蛋白质粉末会很决溶解；而小分子晶体则溶解很慢。小分子晶体的偏光性强于蛋白质晶体，但使用偏光多用来鉴定晶体或其他非晶态物质，如玻璃碎片、玻璃壁上的小气泡、无定形沉淀等。还可以使用染料甲基蓝等鉴别，因为蛋白质晶体吸收染料的能力极强。蛋白质晶体

30、的密度与母液相当，小心轻放可使其晶体浮于母液表面，小分子晶体则下沉。 二、蛋白质结晶和晶体生长 第一节 X 射线晶体结构分析 首先要充分了解到，一套好的衍射数据是晶体结构分析的基础，衍射数据的好坏直接涉及结果的精度。一套好的衍射数据又与晶体的好坏、X 射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关。所以，层层把关是必要的。数据收集有几大环节，如晶体的收集、选择X射线源和选择数据收集仪器等。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 1 晶体的收集和处理蛋白质晶体暴露于空气中将解体，这是因为蛋白质晶体中含水量相当高（2070% ）。水分子和蛋白质中的解离基团或酰胺基团形成氢键，构成蛋白质结构的一

31、个组成部分，因而，失水的晶体会破坏蛋白质的结构。这也是为什么蛋白质晶体在收集数据前要首先密封于一种特殊的毛细管中的原因。这种毛细管专用于X 射线衍射实验，玻璃的材料是特选的，毛细管壁薄如纸，为的是尽量减少对X 射线的吸收。蛋白质晶体的收集有一整套手工操作的程序，需要经过一定的训练方可掌握。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 现在使用低温冷冻晶体的方法来收集数据已成常规，蛋白质晶体决速冷冻于液氮中，蛋白质结构不受影响，在收集数据的过程中，使晶体处于液氮气体的冷却中，由于低温，蛋白质分子的热运动降低，从而提高了衍射分辨率。收集低温冷冻的晶体不使用毛细管而是使用特殊的小圆环，将晶体连同

32、母液用这个小圆环取出来，然后迅速置于液氮中冷冻。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 2. X 射线源的选择无论是阳极靶式（包括封闭管式和旋转阳极靶式），还是同步加速器辐射X 射线辐射光源，都要求X 射线源的辐射流密度要尽量大，即单位面积的光强大。对同一晶体来说，只要蛋白质对辐射有一定的耐受力（否则在收数据的实验过程中需要更换晶体）, X 射线源的强度越高，晶体的衍射线强度也就越大，衍射线强度越大，数据误差就越小。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 2. X 射线源的选择无论是哪种辐射源，还要求射线的发散度尽量小，这又是同步加速器辐射的一大特点。它的辐射功率集中于电子

33、轨道平面附近在沿电子前进方向两侧半张角的一毫弧内，这个范围内集中了辐射功率的85%，因此，它可以在几十米外得到高通量的光源。再加上特殊的弧形晶体镜面的垂直与水平聚焦，射线的准直性就更好了。阳极靶式X 光机没有这个优点。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 3 衍射线记录装置及其使用方法按记录衍射线的方式可将收集数据的装置分为两大类，一类是使用对X 射线敏感的照相底片或图像板（image plate ) ；另一类是计数管或面探测器。按记录装置的运动方式分，又有外森堡相机、徘循相机、回摆相机、四圆衍射仪等之分。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 3 衍射线记录装置及其使用

34、方法X 射线用底片是一个比较好的波松探头，是十几年前用于记录X 射线衍射的主要工具之一，近年来由于面探测器和图像板的使用，底片已经越来越少见。这是20 世纪80 年代以前主要用来收集蛋白质数据的方法。早期使用的外森堡相机和徘循相机是专门设计成使用X 射线底片的相机。这两种相机都要使用层线屏将外层衍射线挡住，只收取一层内的衍射数据，所以效率低。目前这两种相机可能已进入历史博物馆了。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 使用计数管记录衍射线强度的装置主要是四圆衍射仪。计数管多为正比计数管或闪烁计数管，它将X 射线光子强度转换成电信号，信号放大后再转换成数字存入计算机随时调用。四圆中的3

35、 个圆是调节晶体方位的，另一个圆在水平平面上调节计数管方位。4 个圆配合，可在某一特定时刻将某一衍射方向调到与小计数管接收方向一致。因此，四圆衍射仪是采用逐点收集数据方式的全自动衍射数据收集仪器，它的优缺点正好和底片相反。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 四圆衍射仪数据精确，数据重复误差只有2 左右，但因为是逐点收集，所以收集一套数据很费时，这对大晶胞晶体收集数据时间之长是难以忍受的。同时，晶体耐受辐射的时间有限，为了收集一套完整的数据就需要多次更换晶体，从而引入误差降低数据的精度。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 面探测器是由金属丝构成的面板，同样可以将X 射

36、线光子强度转换成电信号，因为它呈面板状，所以构成了一组面探测器，可同时收集到多个衍射点，相当于一张底片，从而使它集计数管记录数据精确和底片同时收集多点的效率两者优点于一身，是不久前实验室内经常用于一般数据收集的仪器。无论四圆衍射仪还是多丝面探侧器都可以在程序带动下完成对一个未知晶体的空间群等初步晶体学参数的鉴定，并随后收集到它的全部衍射强度数据，是自动化很高的数据收集仪。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 近几年开发出的图像板又是在面探测器基础上的一个改进，增加了底片那种非常高的距离分辨的优点，它是集底片和面探测器两者优点于一身的理想的收集数据的方法，目前已被广泛地应用于X 射线

37、晶体结构分析中 。 记录装置的运动方式中最重要的一种方式为回摆法。回摆相机（使用底片）、面探测器和图像板等都是使用这种运动方式来收集数据的。回摆法又称无层线屏周转法，其特点是同时收集衍射空间的三维数据。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 为了不使衍射斑点重叠，必须使晶体每次仅回摆一个很小范围，通常是13角，依晶胞大小而定。为了给衍射方向指标化，使用了部分反射点的信息，即一个衍射斑点被分成两半，分别落在相邻的两个图像的相应位置上。利用部分反射点的信息可以计算出晶体方位与机械坐标之间的偏离（misorientation ) ，从而可以进一步根据晶胞参数算出衍射线的排布，进而对衍射斑点

38、进行扫描并记录它的强度。回摆运动实际上是晶体在测角头上进行旋转的运动，探测器面板垂于入射线在晶体的后方，与晶体的距离可调 。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 4 衍射数据收集的全自动化考虑尽管像图像板、衍射仪这样的收集数据的装置自动化程度已经相当高，但为了满足结构基因组学研究的要求，衍射数据收集的全自动化装置还有进一步考虑的必要。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 4 衍射数据收集的全自动化考虑用于结构基因组学研究的晶体量很大，它们无一例外地要送到同步加速器辐射实验室去。晶体的收集、贮存、标识和运输就是一个大问题。晶体到达同步辐射实验室，又需要将晶体安装到测角头上

39、并调试到衍射仪上。最后还要对晶体衍射质量加以分析，考虑数据收集方法等。这些步骤目前仍处于手工劳动阶段，大大影响了实验进度，完全不符合批量生产结构的要求。幸运的是，已经有些实验室在摸索这方面的全自动化问题。 三、衍射数据收集 第一节 X 射线晶体结构分析 X 射线晶体结构分析的核心问题是位相问题。位相不能直接由实验技术探测到，因而只能通过一些间接的方法推导出来。最基本的方法，也是用于一个未知结构的最有效方法是同晶置换法。在已知结构的基础上，解决不同种属不同来源的突变蛋白或它的复合物结构还可以使用分子置换法和差值电子密度法。由于同步加速器辐射光源的改进，目前多波长的反常散射法（MAD ）已趋成熟，

40、大有取代同晶置换法的可能，使解决位相问题大大简化，这对结构基因组学的研究至关重要。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 晶胞的大小和形状（包括对称性）决定了晶体的衍射方向；反过来，通过衍射点的位置可以推算出晶胞参数和空间群，这叫做初步晶体学参数的测定。但晶胞中的原子种类以及它在晶胞中的分布位置决定了衍射线强度；反过来，通过衍射线强度和一些方法，可以了解位相信息，从而通过富里衰加和获得电子密度函数，从而获得原子在晶胞中的分布位置，这就是晶体结构测定的目的和结果。在收集数据后，还需对多套数据进行统一、还原才可正式用于结构分析。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 1 数据的统一和还

41、原为了解出一个晶体结构，往往需要使用许多晶体收集到该蛋白质的多套数据，其中包括母体数据以及一个以上的重原子衍生物的数据。这些数据的强度需要校正极化因子和劳伦兹因子（LP 校正）、校正吸收因子、校正温度因子，最后再将所有数据统一在一个水平上，才可进行下一步的运算 。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 2 同晶置换法 同晶置换法是由Peruz于20 世纪50 年代发现的可以用于解决位相信息的方法。当蛋白质晶体中引进了适当的重原子后，就造成该晶体衍射线强度的差别，从衍射强度的差别就有可能推出位相信息。下面按顺序介绍重原子衍生物的制备、帕特逊分析、同晶置换法的基本原理。 四、确定位相 第一节

42、 X 射线晶体结构分析 ( l ）制备重原子衍生物 使用同晶置换法测定蛋白质结构，原则上需要制备一个以上的同晶重原子衍全物，同晶重原子衍生物越多，越有可能消除位相双解和实验误差。如果重原子有较强的反常散射，一个重原子衍生物加上反常散射信息也可解决位相的双解问题。最近发展起来的多波长反常散射（MAD ）法解晶体结构，应该看做是同晶置换法的特例。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 所谓重原子衍生物是指在蛋白质晶体中通过某种方式引入原子序数远大于碳、氮、氧的重原子而构成的晶体。视蛋白质分子量的大小，周期表中原子序数高于碘的元素及其化合物在引入晶体后都有可能提供位相信息。这些重原子对X 射线

43、的散射强，有可能改变由碳、氮、氧组成的蛋白质晶体的X 射线衍射斑点的强度。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 根据衍射强度的变化，首先可以借助于帕特逊分析算出重原子的位置，从而获得重原子的结构振幅和位相的信息，因为根据实验可以直接测得重原子衍生物和母体的结构振幅（从强度），所以可以建立矢量三角形（圆）来推出母体的位相。所引进的重原子必须对晶体没有大的破坏，即不改变原来晶体中蛋白质分子的结构和周期排列。与此同时，重原子必须在晶胞中占有一个或几个固定的位置，而且和蛋白质分子有相同的周期排列。这种不改变蛋白质周期排布而又在固定位置引入重原子的方法就叫做“同晶置换”，这种晶体又称为同晶置换重

44、原子衍生物。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 在蛋白质中引进所需要的重原子化合物一般有三种方法：蛋白质经化学修饰后再长晶体、共晶生长晶体和晶体浸泡法。通过一些化学反应使蛋白质某个基团与重原子化合物发生化学反应，使它们之间形成共价键的连接，然后进行晶体生长。这种方法本来很费时费力，已不多用，但最近由于方法技术的改进又死灰复燃，用于多波长散射中很有效。将重原子化合物与蛋白质在溶液中混合在一起生长晶体，称为共晶生长。这种方法也不很有效，已不多用。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 简单而又实用的方法就是浸泡法，特别是有了一定经验之后，花一段时间，总可以找到一些合用的衍生物。浸泡

45、法是将蛋白质晶体浸泡到含有重原子化合物的溶液中去，溶液中的重原子化合物分子通过扩散接近蛋白质分子，通过某种化学反应（电价络合、共价络合）或物理因素（空间效应）使重原子化合物固定在蛋白质分子的某一部位。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 在制备重原子衍生物的过程中，要不断对衍生物进行鉴定，直到获得满意的重原子位置为止。 最初是肉眼观察，晶体发白或产生裂纹是晶体发生变化的信号。最根本的鉴定还是通过X射线衍射实验，观察衍射斑点的情况。衍生物的最终鉴定还要依靠帕特逊分析，即找到重原子的位置，位置找不对，会得出完全错误的结果。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 (2)重原子位置确定

46、帕特森（Patterson）分析 这是一个以帕特森名字命名的函数，在数学上称为卷积，用它来计算原子间的矢量。帕特森分析对位置少、占有率高的重原子可以给出较满意的结果，但对位置多、占有率低的重原子则很难分析。如果已经获得了一个较好的重原子衍生物，用它的同晶加上反常散射信息就可计算出一套母体位相，然后使用母体位相，较差的重原子衍生物与母体的结构振幅之差为系数进行富里哀加和，这种图上可以直接显示重原子位置，应该比帕特森分析简单而且更灵敏。母体位相可通过联合概率法来计算。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 3 分子置换法如果一个蛋白质分子与另一个已知结构的蛋白质分子近似，这种近似粗略地可以从

47、一级结构（蛋白质的氨基酸顺序）加以判断，比如说至少有50的近似性，就可以考虑使用分子置换法解决位相问题从而解出未知结构。同一种蛋白但来源于不同种属，如人和动物之间的同一种蛋白，往往能满足这一要求。对天然蛋白质的改造和修饰甚至借助于天然分子骨架构建新的蛋白质，也有望使用这种方法解出结构。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 分子置换法的完成有两个大步骤，一是旋转，一是平移。使用分子置换法解结构无需制备重原子衍生物，只需衍射强度数据就可以了，大大地节约了时间和精力。由于分子置换法的计算技术不断改进和高精度衍射强度数据的使用，现在12 天解一个相似结构的情况已很普通，是突变蛋白结构解析的主要

48、方法。So，分子置换法已逐步获得广泛的应用，是同晶置换法的一个重要助手。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 4 差值电子密度法这是解决位相问题的最简单方法，但应用范围也最小。个别时候不同种属的蛋白质长出的晶体和已知结构的该蛋白质晶型一样（少有！) ，更多的时候是在结晶状态下，该蛋白质（酶）和它的底物发生反应，相对蛋白质来说，底物的大小是微不足道的，或者免疫蛋白抗体和抗原决定簇(小肽)的结合这种不改变结晶状态的情况下，已知母体的结构，若想求得酶和底物结合生成的络合物结构，使用差值电子密度法是最好不过了。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 差值电子密度法直接使用母体结构的位相计

49、算值作为位相，使用结构振幅3F络合物2F母体作为系数进行富里哀加和（F络合物是络合物晶体衍射的结构振幅，F母体是母体结构振幅的计算值）。结构经修正后可以精确地显示酶与底物的结合，其中包括底物的结构和酶结合后的结构变化，是一种最简单的解结构的方法。所以在解酶与底物结合的络合物结构时，应首先考虑到在结晶状态下形成络合物的可能性，不要失去这一机会。酶与底物的络合是动态进行的，底物形成产物后会脱离酶，所以如何稳化“酶-底物”或“酶-产物”络合物是实验的关键。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 5 多波长反常散射法多波长反常散射法（MAD ）是一种有可能快速批量测定蛋白质晶体结构的有效方法，它

50、是在DNA 重组蛋白定位制备重原子衍生物等实验技术和第三代同步加速器辐射的广泛应用的基础上发展起来的。应用这一方法，只需一个晶体就可以收集到全部衍射数据并解出结构，这对结构基因组学研究的大批量解析蛋白质晶体结构的需求，无疑是一个最重要的方法。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 多波长反常散射法解结构主要是利用同步辐射波长连续可变这一优势，从而可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据，每一套数据都提供了解决位相的信息，所以可以使用一个重原子衍生物，甚至把它当做母体，用一个晶体就可以解出结构。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 多波长反常散射法解结构成为可能首先与第三代同步

51、加速器辐射的发展和应用分不开，而第三代同步加速器辐射又以其光强度的提高和光束的更细聚焦为特点。在此基础上开发常规法制备重原子衍生物以适用于所有的蛋白质晶体的方法就成了当务之急，这也是结构基因组学研究的需要。可喜的是，在过去的10余年中，已经发展出了一些可以应用的方法。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 首先考虑到的是使用硒基蛋氨酸（Se-Met ）对蛋白质进行修饰。在这种情况下，一个重原子衍生物或者更简单地说一个晶体就可以解结构了。而且，对用细菌表达的蛋白质，特别是蛋白质中就含有蛋氨酸，这是不难办到的。但反过来，如果蛋白质不是由细菌表达的，而本身又不含有蛋氨酸，那就会遇到麻烦。 四、

52、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 硫(S)原子在很多蛋白质中都存在（胱氨酸、半胱氨酸），硫原子的反常散射应该充分利用，最近有几个蛋白质已经利用S 原子的反常散射同时使用多波长反常散射法解析出了结构。一个很有发展前途的方法是使用卤族元素在晶体低温冷冻的过程中浸泡，如溴或碘，已经有几个结构通过这种浸泡获得了重原子衍生物，再使用MAD法解出了结构。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 这类重原子衍生物有很多优点，它使用简单的溴盐或碘盐就可以了，溴盐或碘盐在液氮中很快进入蛋白质晶体的溶剂通道，与晶体被低温冷冻的同时（往往在l min 以内），形成重原子衍生物，溴占有了溶剂水的位置，所以这

53、种衍生物不需要任何化学反应或配位，它与蛋白质的接触只是靠范德华引力或氢键（与精氨酸、赖氨酸侧链或酰氨基团或水）。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 虽然占有率不高，但这一弱点恰恰被第三代同步加速器的高能量、细聚焦的优点所弥补，收集高精度的反常散射数据可以使它提供位相信息。溴还有一个很重要的优点，它的吸收边是在0.092 nm ，这个波长是同步辐射很容易调到的波长，光通量也大，实在是非常理想的适用于所有晶体的衍生物。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 惰性气体氙和氪可以在常温下加压于毛细管中，使毛细管中的晶体结合这些惰性气体并生成重原子衍生物。氙更喜欢定位于蛋白质的疏水袋中，

54、虽然也可结合到各种各样的地方，但和一般重原子衍生物的结合位不同，所以早已被使用来制备重原子衍生物了，起码不失为一种浸泡法的补充。这种重原子衍生物同晶度非常好，而且占有率和占有位可以受压力的控制。最近几年，经大量使用者的统计，氙几乎可以和大约50的各类晶体结合。氪的应用尚不多，但已有了初步印象，它和氙占有同类位置，但为了达到相同占有率，压力要求偏高。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 6 全自动化数据处理和位相计算所谓数据处理就是本节第一部分所涉及的数据的统一还原和它前一步的空间群测定。现有的程序已经相当好，自动化程度已相当高，使用方便，速度也很决。目前最常使用的程序是MOSFLM、

55、XDS、 D*TREX、 DPS 、 POW等 ， 但HKL2000(DENZO)看起来最好，虽然目前尚不普及。这些程序全都能辨识各种探头探侧的数据格式，可以在收集数据的现场进行数据扫描和处理数据。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 在全自动化收集并处理数据的过程中（一体化），还应考虑一个很重要的内容，就是实时（at-the-time ）数据质量的评估，如晶体逐渐的衰败、晶体形状因子的校正。目前的软件还只能使用第一个衍射图像来评估预测晶体的几何形状等因素。虽然针对不同要求，也可以选择使用最佳数据处理方式，以获得高质量的数据，但显然还不能完全满足质量评估的要求。在求解位相这一步，有个叫

56、SOLVE 的程序已经可以用来全自动解位相。 四、确定位相 第一节 X 射线晶体结构分析 已知衍射线的结构振幅（强度）和位相，通过富里哀加和就可能计算电子密度图。电子密度图是晶体结构分析的直接结果，它包含了结构的全部信急，如何从一套电子密度图分析出这些信息，尚有一系列问题需要解决。首先，实验的每一步都有误差，最后所有的误差都会表现在电子密度上，在解释电子密度图之前就有一些方法和原则改善电子密度图，称为电子密度图的修饰。在未计算电子密度图之前还要考虑电子密度图的分辨率，不同的分辨率对结构的表现不同，解释的方法也不同。在有了一定结构信息的基础上，还可以不断将结构信息输入以改善位相信息从而改善电子密

57、度图，并通过修正扩充位相信息而使分辨率提高。 五、电子密度图诠释 第一节 X 射线晶体结构分析 1. 电子密度修饰最通常使用的电子密度修饰方法是溶剂平滑法（solvent flattering)，它基于由误差扰动产生的蛋白质溶剂区应该到处都一样的原理。使用这个方法的关键是要找出蛋白质和“溶剂”区的交界面，并预先告知程序晶体的含水量，一种全自动的程序可以做到抹平“溶剂”区。这一步骤可通过程序反复多次，直到计算电子密度图的位相收敛为止。经过抹平的图有时会有重大的改善，便于解释。还有一种广泛用于二维图像和照片的修饰方法称为网格图（histogram ）修饰法，也可用于电子密度图的修饰。 五、电子密度

58、图诠释 第一节 X 射线晶体结构分析 2 分辨率X 射线衍射所能达到的最高分辨率是/2，是波长（根据布拉格公式），对Cu靶K辐射来说，=0.154 nm，所能达到的最高分辨率就是0.077 nm 左右。蛋白质原子间距离在0.15 nm 上下，所以在这个分辨率下的图原则上就达到了原子分辨率水平。但因蛋白质结构复杂，并不是所有相同分辨率的图都能得到相同水平的结果。此外，结构测定中所指的分辨率主要是说明在富里哀加和中所包含的衍射点的数目，但说明衍射点质量的参数并不多，这一点必须明白。 五、电子密度图诠释 第一节 X 射线晶体结构分析 一般来说，0.5 nm分辨率左右的图大致可把握住分子边界，但有些蛋

59、白质的二级结构非常丰富，如肌红蛋白，约含70的 螺旋，在这个分辨率下就可以跟踪肽链走向了。对一般结构来说，0.3 nm分辨率以上的图才有可能分析出肽链走向，特别是有一级结构的信息，这项工作容易进行，侧链往往也能加上。但是，早期的统计显示，在这个分辨率下，错误的图导致错误的分析占结构分析的20。0.2 nm 左右分辨率的图往往可以正确解出蛋白质结构并给出原子模型，并且可以分析晶体中有序水的结构。在这个基础上可以对结构（原子坐标）进行修正使其精化。 五、电子密度图诠释 第一节 X 射线晶体结构分析 3 分析电子密度图首先应对图做一个评估，考察数据和位相是否足够精确到能产生一张可分析的电子密度图。电

60、子密度图的分析和建立结构模型总是和修正原子坐标改善位相，从而改进图的质量并给出更多的原子结构的信息这样一个过程分不开，反复进行，从而获得最后的解。当获得了部分原子结构模型时，往往利用这部分信息计算位相，或加入这种位相（与实验位相结合）去计算电子密度图。 五、电子密度图诠释 第一节 X 射线晶体结构分析 4 全自动化程序发展前景 由同晶置换法和分子置换法获得的位相误差很大，因而电子密度图是很粗糙的，所以需要人的大量干预并不断重建原子的模型，这一过程很费时、费力。 但有了位相以后，全自动化建立一个精确的结构模型仍是一个巨大的挑战。 五、电子密度图诠释 第一节 X 射线晶体结构分析 通过电子密度图分

61、析获得的结构模型，需要进行原子坐标精化，反映结构精确性的一个参数是R因子。R因子是结构振幅观测值和计算值一致性的一个度量。结构精化主要使用的是限制性最小二乘修正。 六、结构模型精化第一节 X 射线晶体结构分析 路漫漫其修远兮l核磁共振的方法与技术作为分析物质的手段 ，由于其可深入物质内部而不破坏样品 ，并具有迅速、准确、分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用 ，已经从物理学渗透到化学、生物、地质、医疗以及材料等学科 ，在科研和生产中发挥了巨大作用 。l核 磁 共 振 是 1946年 由 美 国 斯 坦 福 大 学 布 洛 赫(F.Block)和哈佛大学珀赛尔(E.M.Purcell)各自独立发

62、现的，两人因此获得1952年诺贝尔物理学奖。50多年来，核磁共振已发展成为一门有完整理论的新学科。第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析 Hemoglobin以核磁共振解析蛋白质构造Bovine trypsin inhibitor粗细线条代表蛋白质骨架的可能位置核磁共振同时可以看出蛋白质分子的振动情形 (并非固定)Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.208Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.181多维核磁共振波谱技术是目前唯一能够用以测定蛋白质（或核酸）溶液三维

63、结构的方法。自1983 年瑞士苏黎世高工Wthrich 教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液构象，并在1985 年运用二维同核核磁共振方法确定了蛋白醉抑制剂a 的溶液三维结构以来，至2001 年4 月PDB 库中已有2 293 个蛋白质溶液三级结构。第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析 13位因对核磁共振的杰出贡献而获得诺贝尔奖科学家 1944年 I.Rabi 1952年 F.Block 1952年 E.M.Purcell 1955年 W.E.Lamb 1955年 P.Kusch 1964年 C.H.Townes 1966年 A.Kastler 1977年

64、 J.H.Van Vleck 1981年 N.Bloembergen 1983年 H.Taube 1989年 N.F.Ramsey 1991年 R.R.Ernst 2002年 Wthrich2002年诺贝尔化学奖颁给对发展生物巨分子的鉴定与结构分析之方法有重大贡献 的 John B. Fenn、 田 中 耕 一 和 Kurt Wthrich 。前两者发展出生物巨分子的质谱分析，后者发展出解蛋白质结构的NMR。通常，二维同核核磁共振方法已可以解析氨基酸残基数在100 以下的蛋白质的溶液三维结构。所谓二维同核核磁共振实验，就是检测组成蛋白质的元素成分之一，即氢原子核的二维核磁共振信号。所以，二维同

65、核核磁共振实验只要求稳定的、可溶于水的自然丰度蛋白质样品。对于类型的蛋白质，或二级结构单元主要是折叠的蛋白质，则运用二维同核核磁共振方法可以确定分子量在一万左右的此类蛋白质的溶液结构。第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析 对于分子量远高于10 kDa 的蛋白质，或二级结构单元主要为螺旋的多肽，则需运用多维（三维、四维）异核核磁共振方法进行结构解析。异核核磁共振方法除了要求蛋白质可溶性和高稳定性外，蛋白质分子必须要进行13C和15N同位素富集，也就是核磁共振样品必须是13C和15N稳定同位素双标记的蛋白质。多维异核核磁共振实验主要是检测蛋白质中1H、13C、15N核之间的相关共振信号，用以提取确定

66、蛋白质溶液三级结构的基本信息。第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析 多维核磁共振方法是通过各种类型的多维脉冲程序所执行的核磁共振实验，间接提取蛋白质的结构信息，进而用于计算机完成结构运算而获得蛋白质的溶液三维结构。多维核磁共振方法已广泛用于蛋白质溶液三级结构的确定。其基础在于该方法是在组成蛋白质的元素，即碳、氢和氮原子水平上检测蛋白质的结构信息。这些原子的原子核犹如核磁共振波谱技术的探针，提供了各类原子在蛋白质分子中所处的二级结构信息，局域构象信息以及微环境信息。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析所以，对蛋白质溶液样品进行各种类型的同核或异核核磁共振实验，处理并

67、分析这些实验数据，由核磁共振的波谱参数提取相应的蛋白质的结构信息，建立用于蛋白质溶液三级结构计算的数据文件，最后运用相应的结构计算软件导出被测定的蛋白质的溶液空间结构，就是多维核磁共振方法确定蛋白质溶液三维结构的基本步骤。其中，核磁共振的波谱信息可以正确反映蛋白质的结构信息是确定蛋白质溶液三级结构的关键。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析1 蛋白质的结构信息2 核磁共振的波谱信息在组成蛋白质分子的基本元素H、C、N、O中，原子核自旋量子数I=1/2的核1H、13C、15N是多维核磁共振检测的主要对象。在外加静磁场（恒定超导磁场）H0的作用下，这些核自旋量子数不

68、为零的核能级发生分裂。如果同时将射频磁场H1作用到原子核系统上，当射频场频率满足关系式：=H0，原子核将吸收射频场能量从低能级跃迁到高能级。这种共振跃迁现象就是核磁共振现象。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析核磁共振波谱的谱峰包含有相当丰富的与蛋白质分子结构信息相关的波谱信息，它们由波谱参数表示。直接用于确定蛋白质分子溶液三维结构的主要波谱参数为NOE信号强度、J 耦合常数。此外，化学位移等参数也用于结构的优化。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析(1) NOE(核欧沃豪斯效应)信号强度 NOE是偶极耦合核自旋之间交叉弛豫所引起

69、的一种现象，是原子核磁矩之间直接的偶极相互作用的结果。不同核之间的偶极-偶极弛豫，分子内部运动以及化学交换过程都可产生核自旋间的交叉弛豫。交叉弛豫将导致核自旋之间的磁化强度转移，从而引起NOE的发生。偶极耦合核自旋对之间的交叉弛豫不仅依赖于诱发弛豫的分子运动过程，同时也与偶极耦合核自旋对之间的距离密切相关。NOE信号的强度可以提供蛋白质中氢原子对之间的距离，是蛋白质分子溶液三维结构计算中最重要的距离参数。此外，蛋白质分子中氢键的确定可以提供形成氢键的供体与受体原子之间的距离。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析(2) J 耦合常数 也称为自旋-自旋耦合常数，它反

70、映了原子核磁矩间通过围绕在核外的电子云的间接传递作用而产生的能量藕合。核自旋-自旋耦合是两个由化学键连接的原子核的磁矩通过核外围电子间的磁相互作用而产生的标量耦合，分子内部原子核的这种磁相互作用影响了原子核在核能级间的共振跃迁能量（或共振频率），使得核具有不同的跃迁能量，导致核共振谱峰分裂为多重峰。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析多重峰谱线分量之间的距离表示核磁矩标量耦合的强弱，定义为J耦合常数，单位为赫（Hz ）。J 耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分布的因素，如单键或双键，立体化学等与分子结构有着密切关系的因素有关

71、，而与外加磁场的大小无关。在蛋白质分子中，15N-1H、13C-1H、13C-13C等异核之间的单键J 耦合常数都具有较大值，这是异核多维核磁共振方法的基础。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析(3)化学位移 在给定的射频频率下，引起原子核共振跃迁的磁场强度H 并不等于外加磁场H0，而是受核外电子云的屏蔽作用影响。核外电子在外加磁场的作用下，可以产生感应磁场，对外加磁场起了一个屏蔽作用。如果是抗磁性屏蔽作用，则原子核实际感受到的磁场将小于外加磁场H0，于是产生核磁共振谱线的化学位移。化学位移的大小与外加磁场强度成正比。现在，核磁共振波谱的化学位移用无量纲量表示。

72、 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析对子蛋白质分子而言，同一类型的氨基酸残基在蛋白质一级结构中的序列位置不尽相同，因而将位于不同的二级结构单元以及肽链三级折叠的不同空间位置上。氨基酸残基的lH、13C和15N核的化学位移将取决于核所处的具体结构环境而拥有不同数值。所以，蛋白质分子的1H、13C和15N共振谱线的化学位移反映了蛋白质的三维结构及局域微环境结构情况。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析3 由波谱参数提取蛋白质的结构信息 核磁共振波谱谱峰提供的波谱参数包含着如实反映分子结构的丰富信息。由上述波谱参数提取的蛋白质分子的结构

73、信息，可用以正确地解析蛋白质的二级结构单元和三级空间折叠。由波谱参数需要提取蛋白质的如下结构信息(1)反映结构特征的质子对间距离 由NOE信号强度可以导出蛋白质的质子对间的距离，这是计算蛋白质溶液三维结构的最主要的实验依据。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析3 由波谱参数提取蛋白质的结构信息 按照产生NOE 信号的两个质子之间相隔的氨基酸残基数将NOE 分类，有相邻氨基酸残基间的短程NOE ；相隔14 个氨基酸残基间的中程NOE ；相隔5 个以上氨基酸残基间的远程NOE 。NOE 信号强度也相应地分为强NOE 、中NOE 和弱NOE 。由于蛋白质分子的螺旋、折

74、叠片层以及转角等二级结构具有显著的不同结构特征，在这些二级结构单元中质子对所给出的NOE 信号强度也具有相应的不同特征。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析3 由波谱参数提取蛋白质的结构信息 (2)反映主链和侧链构象的扭转角 蛋白质主链和侧链上的核磁矩之间通过3 个单键的J 耦合常数是确定蛋白质骨架和侧链溶液构象的最主要的实验数据。(3)反映主链规则排布的二级结构单元 多维核磁共振的化学位移参数可以直接提供蛋白质的二级结构信息，并已用于直接判断构成螺旋及折叠等二级结构单元的氨基酸肽段。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核磁

75、共振数据计算蛋白质的三级结构由核磁共振实验数据计算蛋白质溶液三维结构的流程示于图5-11中。首先，将核磁共振波谱提供的NOE 强度信息和J 耦合常数数据转换为用于结构计算的lH对之间的距离和二面角约束文件，其中也包括形成氢键的受体与供体原子对之间的距离约束。基于所输入的蛋白质氨基酸序列以及距离和二面角约束数据，相应的结构计算软件将构建出蛋白质分子的初始结构，然后由分子动力学进行能量最小化计算，由此得到一组收敛的蛋白质三维结构的空间坐标。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构(1)建立核磁共振波谱数据的约束文件 在计算蛋白质三维

76、结构时，由NOE 信号强度导出的氢原子对之间的距离以及由J 耦合常数导出的扭转角不是简单地直接输入计算程序，而是以距离或角度的上限（upper bound ）和下限（lower bound ）的格式输入。这就构成了距离约束文件和二面角约束文件。距离约束文件包含有两方面，一是由NOE 提供的NOE距离约束，另一个是由氢键提供的距离约束。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构(1)建立核磁共振波谱数据的约束文件 通常NOE 距离约束的下限取两个质子的范德华半径之和0.18 nm。而距离约束的上限则需全面洞察NOE信号强度的总体情况

77、进行分类，一般可分成强、中、弱三类NOE，分别对应距离0.250.27 nm、0.300.35 nm和0.5 nm 。对于一些分子量相对较大的蛋白质，还可定义一类上限值更大，如0.65 nm 的很弱NOE 。对上限值大于0.5 nm 的NOE 距离，可将相应的下限值定为0.30 nm ，这样既可节省计算时间，又可提高计算精度。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构(2)获得蛋白质三维结构的一组构象集合 目前已有多种计算蛋白质溶液三维结构的程序，可以归纳为三大类计算方法。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶

78、液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构第一类是基于度量矩阵的距离几何法。在这一方法中，核磁共振的NOE 实验数值以及蛋白质的立体化学数据都以距离约束的格式表示。由于NOE 实验数据并不能完全提供蛋白质中每两个质子间的距离值，所以度量矩阵(metric matrix)距离几何法是根据蛋白质分子的键长、键角等经验数据，由NOE 距离上、下限值推算出未知的质子问距离约束。然后在距离约束的上、下限空间范围内，基于已得到的完整距离矩阵，进行蛋白质结构的不同空间构象的采样。这一算法的计算程序有DISGEO、DG和CNS。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核

79、磁共振数据计算蛋白质的三级结构第二类是变目标函数计算方法。这是在二面角空间进行运算，而且在整个运算过程中始终维持蛋白质共价结构（键长、键角和手性等）的一种算法。其计算结构的基本思想是，由残基内的约束开始，将“目标尺寸”逐步增加至多肽链全长，使随机的蛋白质初始结构逐步符合由核磁共振实验推断的构象约束。这一算法的主要计算程序是DI-ANA。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构第三类是分子动力学模拟退火方法。这一计算方法是解牛顿运动方程以得到分子轨迹。牛顿运动方程中的作用力是由笛卡儿坐标系的势能函数而来，势能函数中除包含有用以维持

80、蛋白质结构的共价几何的能量项以外，还包括有距离和二面角约束能量项。这一算法中使用最广泛的计算程序是CNS 。另有一种算法（DYANA ）是在二面角空间进行分子动力学模拟。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构蛋白质结构的计算结果，是要获得与核磁共振导出的距离约束、二面角约束、手性等结构数据以及与蛋白质分子提供的共价几何数据相符合的分子构象。无论运用哪一类计算程序，都将涉及距离约束和二面角约束等实验数据。然而，核磁共振实验只能提供数量有限的距离和二面角约束数据。因此，通过计算所建立的蛋白质三维结构模型的许多结构几何不是由核磁共振

81、数据确定，而是由计算程序推算而来。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构所以，在具体的蛋白质结构运算中，需要计算一个拥有几十个结构的集合，以便在允许的构象空间中，作尽可能大范围的空间构象的取样。对整个构象集合进行分析后，可以找到存在于集合内所有结构中的一种蛋白质结构特征。如果这一结构特征在所有结构中都不违背核磁共振导出的距离和二面角约束，同时随着在计算过程中加入集合的结构数增加，这一结构特征没有显著的变化，那么可以认为已获得了由核磁共振实验数据导出的蛋白质溶液三维空间结构。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱

82、的溶液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构(3)蛋白质三维结构的分析 在分析蛋白质结构的集合时，通常运用均方根偏差( RMSD ）值来衡量蛋白质骨架重原子（13C、13C、15N）、骨架上全部原子（即还包括1HN、lH）、蛋白质分子的全部重原子等原子空间坐标相互偏离的程度，或者是相对于蛋白质平均结构坐标的偏离程度。然后，抽去那些由于局域结构不理想，或者仍有违背距离和二面角约束而部分偏离较大的结构，从而获得比较精确的蛋白质结构的集合。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析4 由核磁共振数据计算蛋白质的三级结构( 3 ）蛋白质三维结构的分析但是，由此得出的蛋

83、白质结构计算的精确性并不等于蛋白质结构的正确性。由核磁共振导出的蛋白质溶液结构的正确性不仅仅与计算方法有关，即计算方法能否正确再现结构，而且主要取决于原子间距离和J 耦合常数实验值的正确性，同时还取决于实验所提供的原子间距离（尤其是远程距离）以及J 耦合常数值的数量。 一、概述蛋白质溶液三级结构测定 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析多维核磁共振实验方法涉及多种类型的、用以获得不同蛋白质结构信息的实验脉冲程序。取决于脉冲程序的设计，多维核磁共振波谱的共振信号可以是两个、三个或四个频率变量的函数，相应于二维、三维和四维核磁共振波谱。二维同核核磁共振波谱的两维频率坐标轴都是1H共振频率；二维异核核

84、磁共振波谱中的一个坐标轴是lH 共振频率，而另一坐标轴是13C 或15N 共振频率；三维或四维异核核磁共振波谱的坐标轴则取决于所需提供的信息而具有lH 、13C 和巧N 共振频率的不同组合。 二、基本的多维核磁共振实验 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析各种多维核磁共振实验脉冲程序的射频脉冲序列设置不同，相应地提供不同的特定信息。然而，这些射频脉冲序列的设计都是基于一个共同的基本原理：在射频脉冲的作用下，互相耦合的核自旋之间发生核磁化强度的转移（magnetization transfer ) ，其转移机制分为两类。一类是磁化强度的相干转移（coherent transfer) ，即核自旋之间

85、通过成键电子介导的标量藕合（自旋-自旋耦合），产生磁化强度的转移而交换信息。 二、基本的多维核磁共振实验 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析另一类是磁化强度非相干转移(incoherent transfer)，这是由于核自旋之间通过偶极-偶极相互作用(dipole-dipole interaction)而产生的磁化强度转移。因此，在相互耦合的核自旋体系中，转移磁化强度的核自旋的共振频率、幅度和相位调制了被转移的核自旋的共振信号。在实验中，检测后者的共振信号也就间接检测了前者的共振信号。在多维核磁共振方法中，绝大多数的脉冲程度都是基于磁化强度的相干转移机制，用以建立lH、13C 和15N之间的化

86、学位移相关以及提供J 耦合等信息。只有少数的脉冲程序是基于磁化强度的非相干转移机制，用以建立NOE 相关，但这恰是确定蛋白质三维空间结构所必需的重要实验脉冲程序。 二、基本的多维核磁共振实验 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析在研究蛋白质溶液三维结构中有如下的主要多维核磁共振实验。1. 二维同核（1H-1H ）核磁共振实验 2. 二维异核（1H-15N/13C）核磁共振实验3. 三维异核（1H-13C-15N）核磁共振实验4. 四维异核（1H-13C-15N）核磁共振实验5. TROSY类型的多维核磁共振实验TROSY (Transverse relaxation-optimized spec

87、troscopy)方法是用于在多维核磁共振实验中抑制横向(T2)弛豫 二、基本的多维核磁共振实验 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析基于对二维平面波谱的分析，可由多维核磁共振实验提取确定蛋白质结构的波谱信息。在二维核磁共振波谱中，核磁共振的交叉峰都是以等高线形式表示，信号的强弱则由等高线数目表示，等高线的中心点指示了共振峰的频率位置。在解析三维核磁共振波谱时，需要综合分析按13C或15N共振频率展开的各二维切面提供的信息。四维核磁共振波谱的分析较复杂，每个二维切面是由两个异核的共振频率所决定，因而在综合分析各二维切面所提供的信息时，就需要借助于相应的软件。 三、多维核磁共振波谱解析简介 第二节

88、 核磁共振波谱的溶液结构解析由核磁共振基本原理可知，一个分子量为1万Da左右的蛋白质，在核磁共振波谱中就能产生成千上百个共振交叉峰。要从多维核磁共振波谱中提取蛋白质各原子核的化学位移、核间的J耦合常数以及所产生的NOE等信息，首先必须确认各共振交叉峰的归属。也就是在化学位移相关谱中，需要确认每一交叉峰属于哪一类氨基酸（即共振峰的自旋系统归属），该氨基酸在蛋白质一级序列中的位置（即共振峰的序列识别）。在NOE相关谱中，不仅仅要正确测定NOE交叉峰强度，还需要判别建立NOE交叉峰的两个氢原子的归属，即建立NOE 相关的两个氢原子所属的原子基团、氨基酸种类及序列位置。因而，对多维核磁共振波谱的正确解

89、析，是获得正确而又精确的蛋白质三维溶液结构的基础。 三、多维核磁共振波谱解析简介 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析多维核磁共振波谱解析包括如下几个重要方面：1.核磁共振谱峰的序列指认 2.立体定向(stereospecific)指认3.NOE交叉峰的指认及峰强度的正确测定 三、多维核磁共振波谱解析简介 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析2. 立体定向(stereospecific)指认在运用核磁共振方法确定蛋白质的三维空间结构中，蛋白质主链即骨架的空间结构可以正确而又较精确地获得，然而蛋白质总体三维空间结构的正确性与精确性在一定程度上还与蛋白质局域结构的测定正确度和精度有关。影响蛋白质局域结

90、构测定的因素是多样性的，其中蛋白质氨基酸残基侧链两个-亚甲基lH，以及缬氨酸和亮氨酸的两个甲基基团1H 共振的主体定向（或手性）信息的正确提供较为关键。 三、多维核磁共振波谱解析简介 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析1.核磁共振适合于液体、固体。如今的高分辨技术，还将核磁用于了半固体及微量样品的研究。核磁谱图已经从过去的一维谱图（1D）发展到如今的二维（2D）、三维（3D）甚至四维（4D）谱图，陈旧的实验方法被放弃，新的实验方法迅速发展，它们将分子结构和分子间的关系表现得更加清晰。 四、四、核磁共振的核磁共振的应用用第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析2.在世界的许多大学、研究机构和企业集团，

91、都可以听到核磁共振这个名词，包括我们在日常生活中熟悉的大集团。而且它在化工、石油、橡胶、建材、食品、冶金、地质、国防、环保、纺织及其它工业部门用途日益广泛。3.在中国，其应用主要在基础研究方面，企业和商业应用普及率不高，主要原因是产品开发不够、使用成本较高。但在石油化工、医疗诊断方法应用较多。 四、四、核磁共振的核磁共振的应用用第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析分子结构的测定化学位移各向异性的研究金属离子同位素的应用动力学核磁研究质子密度成像T1T2成像化学位移成像其它核的成像指定部位的高分辨成像元素的定量分析有机化合物的结构解析表面化学有机化合物中异构体的区分和确定大分子化学结构的分析 四、

92、四、核磁共振的核磁共振的应用用一些实际的应用第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析生物膜和脂质的多形性研究脂质双分子层的脂质分子动态结构生物膜蛋白质脂质的互相作用压力作用下血红蛋白质结构的变化生物体中水的研究生命组织研究中的应用生物化学中的应用在表面活性剂方面的研究原油的定性鉴定和结构分析沥青化学结构分析涂料分析农药鉴定食品分析药品鉴定 四、四、核磁共振的核磁共振的应用用一些实际的应用第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析GAME OVERTHE END吴老师讲课 练得身形似鹤形，千株松下两函经。我来问道无馀说，云在青霄水在瓶。选得幽居惬野情，终年无送亦无迎。有时直上孤峰顶，月下披云啸一声。T Th ha an nk ks s! !