生物工程下游技术第四章沉淀法课件

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1、第四章第四章 沉淀法沉淀法生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性 与与化化学学产产品品的的分分离离制制备备相相比比较较，生生物物大大分分子子的的制制备备有以下主要特点：有以下主要特点： 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。至几千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离许多生物大分子在生

2、物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。纯化的步骤繁多，流程长。 第一节第一节 概述概述许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、温度、pHpH值、离子强度等各种参数对溶液中各值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。种组成的综合影响，很难准确估计和判断。基本概念基本概念 通过加入某种试

3、剂或改变溶液条件，使生化产物以通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为技术称为固相析出技术固相析出技术。 结晶法结晶法：在固相析出过程中，析出物为：在固相析出过程中，析出物为晶体晶体时称为时称为结晶法。结晶法。 沉淀法沉淀法：在固相析出过程中，析出物为：在固相析出过程中，析出物为无定形固体无定形固体时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法盐析法、有机溶有机溶剂沉淀法剂沉淀法和和等电点沉淀法等电点沉淀法等。等。 沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅

4、用沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。的方法。通过沉淀达到通过沉淀达到浓缩浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；沉淀法的特点和应用沉淀法的特点和应用沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性

5、的，或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀杂质或有有选择地沉淀所需成分。选择地沉淀所需成分。沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初初级分离技术级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的工业实例。淀分离得到目标产品的工业实例。 基本原理：基本原理： 根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的

6、产生是由于溶质分子之间及溶的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pHpH值、离子值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。沉淀的分类沉淀的分类 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种

7、蛋白质和酶：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。的分离纯化。 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及以及生物小分子生物小分子的分离纯化。的分离纯化。 选择性沉淀选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定用于除去某些不耐热的和在一定pHpH值下易变性的杂蛋值下易变性的杂蛋白。白。 等电点沉淀等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。使用。 有机聚合物沉淀有机聚合物

8、沉淀： 是发展较快的一种新方法，是发展较快的一种新方法， 主要使用主要使用PEGPEG聚乙二醇（聚乙二醇（PolyethyenePolyethyene glycol glycol）作为）作为沉淀剂。沉淀剂。n蛋白质组成蛋白质组成 2020种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸性氨基酸和亲水性氨基酸n蛋白质折叠趋势蛋白质折叠趋势 疏水性氨基酸：疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势分布于蛋白质外表面的趋势 n结果结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残在蛋白质三维

9、结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区第二节第二节 蛋白质的表面特性蛋白质的表面特性n蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、荷电区、亲水区亲水区和和疏水区疏水区构成。构成。n蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。构象以及分子周围的环境所决定。n一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。子蛋白质更易溶解。防止蛋白质凝聚沉淀的屏障防止蛋白质

10、凝聚沉淀的屏障蛋白质周围的蛋白质周围的水化层水化层（hydration shell)hydration shell) 可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质分子间蛋白质分子间静电排斥作用静电排斥作用。（存在双电层）。（存在双电层） 胶体的定义胶体的定义n胶体是一种尺寸在胶体是一种尺寸在1 1100 nm100 nm以至以至1000 nm1000 nm的分散体。它既非大块固的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。是具有两相的微不均匀分散体系。 -被遗忘了尺寸的世界Wilhelm Friedrich

11、 Ostwald (1853 1932) 蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性n蛋蛋白白质质可可以以看看作作是是一一个个表表面面分分布布有有正正、负负电电荷荷的的球球体体，这这种种正正、负负电电荷荷是是由由氨氨基基和和羧羧基基的的离离子子化化形形成成的的，换换句句话话说说，该该球球体体是是带带有有均均衡衡电电荷荷分分布布的的胶胶体体颗颗粒粒。因因此此，蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀，实实际际上上与与胶胶体体颗颗粒粒的的凝聚和絮凝现象相似。凝聚和絮凝现象相似。静电斥力静电斥力吸引力吸引力蛋白质蛋白质/ /胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似n蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带

12、电的原因主要蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。吸引力n颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用n颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。nVan Van derder Waals Waals 力力nKeesonKeeson 引力（偶极力）引力（偶极力）nDebye Debye 引力引力 （诱导力）（诱

13、导力）nLondon London 引力引力 （色散力）是最重要的一种引力，因（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。的。DLVODLVO理论理论n颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势，可看为一个凝聚的势垒；在垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能为吸引位能。沉淀策略及

14、方法沉淀策略及方法n策略策略 破坏蛋白质周围的水化层破坏蛋白质周围的水化层 降低双电层厚度降低双电层厚度（电位）电位）n沉淀方法沉淀方法 改变溶液改变溶液pH值值加入无机盐或改变无机盐种类加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂添加脱水剂 定义：定义：n蛋白质在高离子强度的溶液蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的中溶解度降低、发生沉淀的现象称为现象称为“盐析盐析”。第三节第三节 盐析法盐析法两种现象：两种现象：盐溶盐溶：低盐情况，盐离子强：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度度的增高，蛋白质溶解度增大。增大。盐析盐析：高盐，盐离子强度增：高盐

15、，盐离子强度增加，蛋白质加，蛋白质溶解度减小溶解度减小。应用：应用：n蛋白质和酶分离提纯蛋白质和酶分离提纯n多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分离离q20204040饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀淀q4343饱和度的硫酸铵可以使饱和度的硫酸铵可以使DNADNA和和rRNArRNA沉淀，而沉淀，而tRNAtRNA保留在上清。保留在上清。一、盐析法的原理及特点一、盐析法的原理及特点原理原理n形成形成离子对离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。作用减弱而能相互靠拢，

16、聚集起来。n中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜水化膜，使其沉淀。，使其沉淀。 Cohn方程式n现在常用现在常用 CohnCohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间的关系：的关系：n S= S= s s n式中式中S S蛋白质的溶解度蛋白质的溶解度，g/L;g/L;n I I一离子强度等于一离子强度等于 I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2; ;n m mi i离子离子 i i的摩尔浓度；的摩尔浓度；n ZiZi所带电荷；所带电荷；n n常数，与盐的种类无关，但与温度、常数，与盐的种类无

17、关，但与温度、pHpH和蛋白质种类有和蛋白质种类有关关; ;nKsKs盐析常数盐析常数，与温度和与温度和PHPH无关，但与蛋白质和盐的种类有无关，但与蛋白质和盐的种类有关。关。用盐析法分离蛋白质的二种方法用盐析法分离蛋白质的二种方法在一定的在一定的 pHpH值及温度条件下，改变盐的浓度（即值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为离子强度）达到沉淀的目的，称为“s s”分级盐分级盐析法。析法。（KsKs盐析盐析：固定：固定pH, pH, 温度，改变盐浓度）温度，改变盐浓度）在在一一定定的的离离子子强强度度下下，改改变变溶溶液液的的pHpH值值及及温温度度，达达到沉淀的目的，

18、称为到沉淀的目的，称为“”分级盐析法。分级盐析法。（盐析：盐析：固定离子强度，改变固定离子强度，改变pHpH及温度。）及温度。）当离子强度较高时，溶解度的对数与离子当离子强度较高时，溶解度的对数与离子当离子强度较高时，溶解度的对数与离子当离子强度较高时，溶解度的对数与离子强度呈线性关系强度呈线性关系强度呈线性关系强度呈线性关系 成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用，对许多生物活性物质具有稳定作用，不易引起蛋不易引起蛋白质变性白质变性 优点优点缺点缺点盐析法分辨率不高，适合于生化物质粗提纯盐析法分辨率不高，

19、适合于生化物质粗提纯阶段，需和其它方法交替使用。阶段，需和其它方法交替使用。二、影响盐析的因素二、影响盐析的因素（一）离子强度和类型（一）离子强度和类型n一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 n盐析能力：半径小的高价离子

20、在盐析时的作用盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，较强，阴离子的盐析效果比阳离子好阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以，尤其以高价阴离子更为明显。高价阴离子更为明显。n PO4 3-SO42-CH3COO-Cl-NO3-I-nNH4+K+Na+Li+n盐析用盐要考虑几个因素：常用盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵硫酸铵( (二）溶质（蛋白质等）种类的影响二）溶质（蛋白质等）种类的影响（三）蛋白质浓度的影响（三）蛋白质浓度的影响 在相同的盐析条件下，在相同的盐析条件下，蛋蛋白质浓度越大越易沉淀白质浓度越大越易沉淀，但蛋，但蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也

21、愈强，从而使分的共沉作用也愈强，从而使分辨率降低，辨率降低，一般常将蛋白质浓度控制在一般常将蛋白质浓度控制在2 23 3为宜。为宜。相当于相当于25 mg/25 mg/mLmL30mg/mL30mg/mL。（四）温度的影响：（四）温度的影响： 温度的变化会影响温度的变化会影响 值。值。在无盐或稀盐溶液中，大在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在度升高而增大的，但在高高盐溶液中常相反盐溶液中常相反。 对于某些对温度敏感的酶，要求在对于某些对温度敏感的酶，要求在0044下下操作，以避免活力丧失。但有的蛋白质（如血红蛋操作，以避免活力丧失。但有的蛋白质

22、（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（2525）比）比0 0时溶解度低，更容易盐析。时溶解度低，更容易盐析。（五）（五）PHPH的影响：的影响： 蛋白质所带净电荷越多，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变它的溶解度就越大。改变pHpH值可改变蛋白质的带电性质，值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解因而就改变了蛋白质的溶解度。度。在等电点处溶解度小（在等电点处溶解度小（ 值最小）值最小）。 因此用中性盐沉淀蛋白质时，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pHpH值常选在该值常选在该蛋白质的等电点附近蛋白质的等电点附近三、盐析常用的盐三、盐析常用

23、的盐 常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾等。氯化钠、磷酸钠、磷酸钾等。（NHNH4 4）2 2SOSO4 4 最常用：最常用： 溶解度大溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0 044）进行。由下表可以看到，（）进行。由下表可以看到，（NH4NH4）2SO42SO4在在00时仍有时仍有70.670.6的溶解度，远远高

24、于其它盐类：的溶解度，远远高于其它盐类： 几种盐在不同温度下的溶解度（克几种盐在不同温度下的溶解度（克/100/100毫升水）毫升水）02080100(NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101 分离效果好分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去一步就可以除去7575的杂蛋白，纯度提高了四倍。的杂蛋白，纯度提高了四倍。 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用有的酶或蛋白质用2 23mol/L3mol/L

25、的（的（NH4NH4）2SO42SO4保存保存可达数年之久。可达数年之久。 价格便宜，废液不污染环境。价格便宜，废液不污染环境。n但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液的的pHpH值在值在4.54.55.55.5之间，使用时多用浓氨水之间，使用时多用浓氨水调整到调整到pH7pH7左右。左右。四、盐析操作（以硫酸铵为例）四、盐析操作（以硫酸铵为例） 盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：（1 1）加硫酸铵的饱和溶液：）加硫酸铵的饱和溶液：在实验室和小规模生产中，在实验室和小规模生产中，或或(NH(NH4 4) )2 2SOS

26、O4 4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它可浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。（2 2）直接加固体硫酸铵：）直接加固体硫酸铵：工业上常采用这种方法，加工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；全溶解和防止局部浓度过高； 常用常用“饱和度饱和度”来表征硫酸铵在溶液中来表征硫酸铵在溶液中的最终浓度，的最终浓度，2525时时(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4的饱和浓度为的饱和浓度为4.1 mol4

27、.1 molL L，定义它为，定义它为100%100%饱和度饱和度。 盐析曲线的制作盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：体操作方法如下： 取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至离样品溶液，冷至0055，调至该蛋白质稳定的，调至该蛋白质稳定的pHpH值。值。 计算饱和度达到计算饱和度达到20%-100%20%-100%所需加入的硫酸铵量，所需加入的硫酸铵量，边搅拌边

28、加入，放置边搅拌边加入，放置1h1h以上，使沉淀达到平衡以上，使沉淀达到平衡盐析操作盐析操作- -溶解度曲线确定溶解度曲线确定离心分离心分离沉淀物离沉淀物并重新溶并重新溶解测定其解测定其中总蛋白中总蛋白和目标蛋和目标蛋白的浓度白的浓度 以饱和以饱和度为横坐度为横坐标，上清标，上清液中总蛋液中总蛋白和目标白和目标蛋白浓度蛋白浓度为纵坐标，为纵坐标，得到蛋白得到蛋白质溶解度质溶解度曲线曲线第三节第三节 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n定义：向水溶液中加入一定量定义：向水溶液中加入一定量亲水性亲水性的有机溶的有机溶剂，降低溶质的剂，降低溶质的溶解度溶解度，使其沉淀析出的分离，使其沉淀析出的分离纯化方法

29、。纯化方法。一、有机溶剂沉淀法的原理和特点一、有机溶剂沉淀法的原理和特点n原理原理1 1）加入有机溶剂后，会使水溶液的）加入有机溶剂后，会使水溶液的介电常数介电常数降低降低 ，导，导致蛋白质分子之间的致蛋白质分子之间的静电引力增加静电引力增加，从而使蛋白质发生，从而使蛋白质发生聚集沉淀。聚集沉淀。 2 2）由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。，因而发生沉淀作用。 蛋白质在有机溶剂中的沉淀蛋白质

30、在有机溶剂中的沉淀特点特点n分辨率高于盐析；分辨率高于盐析；n乙醇等有机溶剂沸点低，易挥发除去，不会残留于成乙醇等有机溶剂沸点低，易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净；品中，产品更纯净；n沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易。沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易。n但有机溶剂沉淀法易使蛋白质等生物大分子变性，操但有机溶剂沉淀法易使蛋白质等生物大分子变性，操作需在作需在低温低温下进行；需要耗用大量有机溶剂，成本较下进行；需要耗用大量有机溶剂，成本较高高; ;有机溶剂一般易燃易爆，所以贮存比较困难或麻有机溶剂一般易燃易爆，所以贮存比较困难或麻烦。烦。二、二、 有机溶剂的选择和浓度的计算有机溶剂

31、的选择和浓度的计算n用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。 进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：算： V = V0 (S2 V = V0 (S2 S1) S1) (100(100S2)S2) 式中：式中： V = V

32、= 需加入需加入100100浓度有机溶剂的体积浓度有机溶剂的体积 V0 = V0 = 原溶液体积原溶液体积 S1 = S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度所要求达到的有机溶剂的浓度 100100是指加入的有机溶剂浓度为是指加入的有机溶剂浓度为100100，如所加入的有机溶剂的浓度为，如所加入的有机溶剂的浓度为9595，上式的，上式的(100(100S2) S2) 项应改为项应改为 (95(95S2)S2) 。n上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时

33、剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。 三、常用的有机溶剂三、常用的有机溶剂 常用于生物大分子沉淀的有机溶剂有乙醇、丙酮和甲常用于生物大分子沉淀的有机溶剂有乙醇、丙酮和甲醇等。其中乙醇是最常用的沉淀剂，因为它具有沉淀作用醇等。其中乙醇是最常用的沉淀剂，因为它具有沉淀作用强、沸点适中、无毒等优点。强、沸点适中、无毒等优点。 四、有机溶剂沉淀法的影响因素四、有机溶剂沉

34、淀法的影响因素 1 1、温度、温度 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用。另外，温度还会影响有机溶剂对蛋白质的变性作用。另外，温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。因此，在使沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。因此，在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行温下进行 。2 2、pHpH值值 有机溶剂沉淀适宜的有机溶剂沉淀适宜的pHpH值，要选择在样品稳值，要选择在

35、样品稳定的定的pHpH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的最低的pHpH值，通常是选在等电点附近，从而提值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。高此沉淀法的分辨能力。 3 3、样品浓度、样品浓度 样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以。一般认为蛋白质的初浓度以0.50.52 2为好，粘多糖则以为好，粘多糖则以1 12 2较合适。较合适。4 4、中性盐浓度、中性盐浓度 较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白较低浓度的中性盐存在

36、有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以质变性。一般在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以0.010.010.05mol/L0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。钠等。 5 5、某些金属离子、某些金属离子 一些金属离子如一些金属离子如CaCa2+2+、ZnZn2+2+等可与某些成阴离子等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。用量。利用蛋白质沉淀大规模

37、提纯利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺白蛋白与免疫球蛋白的工艺 这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。常用的有离提纯，称为选择性变性沉淀法。常用的有热变性热变性、选择性酸碱变性选择性酸碱变性和和有机溶剂变性有机溶剂变性等。等。第四节第四节选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法 热变性热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热

38、升利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。的初期分离纯化。 n酵母干粉中加入酵母干粉中加入0.066 mol/L0.066 mol/L磷酸氢二钠溶液，磷酸氢二钠溶液，3737水浴保温水浴保温2 h2 h，室温搅拌，室温搅拌3 h3 h，离心收集上清液，离心收集上清液，升温至升温至5555，保温，保温20 min20 min后迅速冷却

39、离心去除热变后迅速冷却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。性蛋白，上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。 表面活性剂和有机溶剂变性表面活性剂和有机溶剂变性n分离蛋白质和酶分离蛋白质和酶：对于表面活性剂和有机溶剂的敏感：对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性杂蛋白变性沉淀，而目的物仍留在溶液中。在冰浴性杂蛋白变性沉淀，而目的物仍留在溶液中。在冰浴或冷室中进行。或冷室中进行。n分离核酸分离核酸：在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿- -戊醇或氯仿戊醇或氯仿- -辛辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿- -水的界面上形水的界面上形成沉淀而被除去，核酸

40、仍然留在水溶液中。成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。 在在DNADNA、RNARNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀淀DNADNA，而，而RNARNA留在溶液中。留在溶液中。 选择性酸碱变性选择性酸碱变性 利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同pHpH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。骤。 等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，

41、易发生沉淀，从而质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想。想。第五节第五节等电点沉淀法等电点沉淀法在调节等电点时，如果采用盐在调

42、节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使蛋白变性。为了使pHpH缓慢变动，也可用乙缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除此法主要用于在分离纯化流程中去除杂杂蛋白蛋白，而不用于沉淀目的物。，而不用于沉淀目的物。n（1 1）适用于疏水性强的蛋白质）适用于疏水性强的蛋白质n（2 2

43、）中中性性盐盐浓浓度度增增大大时时，等等电电点点向向偏偏酸酸方方向向移移动动，同时最低溶解度会有所增大。同时最低溶解度会有所增大。n（3 3）无机酸通常价格便宜，无毒）无机酸通常价格便宜，无毒n（4 4）蛋白质对低）蛋白质对低pH pH 敏感，易失活敏感，易失活等电点沉淀法工业生产胰岛素工业生产胰岛素(pI5.3)： 胰岛素胰岛素 pH8pH8 除去碱性杂蛋白除去碱性杂蛋白 pH3pH3 除去酸性杂蛋白除去酸性杂蛋白n碱性磷酸酯酶的碱性磷酸酯酶的pIpI沉淀提取沉淀提取：发酵液调：发酵液调pH pH 4.04.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。

44、用集沉淀物。用pH 9.0pH 9.0的的0.1 mol/L 0.1 mol/L Tris-HClTris-HCl缓缓冲液重新溶解，加入冲液重新溶解，加入202040%40%饱和度的硫酸铵饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀分级，离心收集的沉淀Tris-HClTris-HCl缓冲液再次沉缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。第六节第六节 其它沉淀法其它沉淀法一、有机聚合物沉淀法一、有机聚合物沉淀法n有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近最早应用于提纯免疫球蛋白和

45、沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。年来广泛用于核酸和酶的纯化。n应用最多的是应用最多的是聚乙二醇聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)( 4)( Polyethylene Glycol Polyethylene Glycol 简写为简写为 PEG )PEG )，它的亲水性强，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为200D200D20KD20KD的的 PEG

46、PEG。 nPEGPEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液量有关，同时还受离子强度、溶液pHpH和温度和温度等因素的影响。等因素的影响。n在一定的在一定的pHpH值下，盐浓度越高，所需值下，盐浓度越高，所需PEGPEG时时浓度越低，溶液的浓度越低，溶液的pHpH越接近目的物的等电点，越接近目的物的等电点，沉淀所需沉淀所需PEGPEG的浓度越低。在一定范围内，的浓度越低。在一定范围内，高分子量和浓度高的高分子量和浓度高的PEGPEG沉淀的效率高。沉淀的效率高。n理论依据：理论依据：n认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作认为沉

47、淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。用。n由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。发生沉淀。n聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。物，在重力作用下形成沉淀析出。n通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。在一起而发生沉淀。优点：优点： 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEGPEG即可以沉淀相即可

48、以沉淀相当多的生物大分子。当多的生物大分子。 无毒无毒 沉淀后有机聚合物难去除，需用超滤和液液沉淀后有机聚合物难去除，需用超滤和液液萃取出去；价格较昂贵萃取出去；价格较昂贵缺点：缺点：二、成盐沉淀法二、成盐沉淀法（1 1）金属离子沉淀法）金属离子沉淀法 ：蛋白质在碱性溶液中带负电荷，：蛋白质在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成金属复合盐沉淀能与金属离子形成金属复合盐沉淀 。常用的金属离子。常用的金属离子ZnZn2+2+ 、CaCa2+2+ 、PbPb2 2 （2 2）有机酸沉淀法）有机酸沉淀法 含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功

49、能团形成复合物而沉淀析出。子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。 常发生不可逆的沉淀反应，故用于制备蛋白质时，常发生不可逆的沉淀反应，故用于制备蛋白质时，需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。（3 3）无机酸沉淀法：磷钨酸、磷钼酸等能）无机酸沉淀法：磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，从而使蛋白质沉淀析出的复合盐，从而使蛋白质沉淀析出三、亲三、亲 和和 沉沉 淀淀n亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。品的有效方法。

50、初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位体络和形成沉淀；的亲合配位体络和形成沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。沉淀生成动力学n溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由互相碰撞并产生

51、聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：下面几种运动引起：q热运动，热运动，BromnianBromnian运动；运动；q对流运动，由机械搅拌产生；对流运动，由机械搅拌产生；q差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。沉淀过程n为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述个步骤：程分成下述个步骤：q(1) (1) 初始混合初始混合q(2) (2) 新相生成新相生成q(3) (3) 布朗运动凝集布朗运动凝集q(4) (4) 机械碰撞凝集机械碰撞凝集q(5) (5) 絮体破碎絮体破碎q(6) (6) 聚集体陈化，在陈化过程中，絮体取得聚集体陈化，在陈化过程中，絮体取得 大小和阻力的平衡。大小和阻力的平衡。标标准准沉沉淀淀法法回回收收柠柠檬檬酸酸流流程程图图1.1.名词解释：名词解释： 盐盐析析法法，有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法，选选择择性性变变性性沉沉淀淀法法，等电点沉淀法，盐溶，盐析，等电点沉淀法，盐溶，盐析，盐析，盐析，KsKs盐析盐析2.2.盐析的机理及影响因素盐析的机理及影响因素3.3.盐析操作过程盐析操作过程 4.4.有机溶剂沉淀的机理及影响因素有机溶剂沉淀的机理及影响因素 本章思考题本章思考题