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1、免疫学检测与免疫学技术免疫学检测与免疫学技术一、抗原抗体的检测技术一、抗原抗体的检测技术二、免疫细胞的检测二、免疫细胞的检测三、细胞因子的检测三、细胞因子的检测四、免疫相关基因分析四、免疫相关基因分析五、免疫标记技术五、免疫标记技术六、免疫六、免疫PCR(IM-PCR)技术技术 七、杂交瘤技术与七、杂交瘤技术与T细胞克隆技术细胞克隆技术八、新型抗体的制备技术八、新型抗体的制备技术九、抗原的制备技术九、抗原的制备技术一、概述一、概述免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手
2、段及分子生物学技术在免疫学研究子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。中的应用。免疫学技术的应用极为广泛免疫学技术的应用极为广泛,疾病的诊断、疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。疗效评价及理论研究等。 二、抗原抗体的检测技术二、抗原抗体的检测技术*根根据据反反应应的的基基本本原原理理与与表表现现主主要要分分为为凝凝集集反应、沉淀反应和补体参与的各种反应反应、沉淀反应和补体参与的各种反应*根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗原原(或抗体或抗体)检测相应物质的标记技术。检测相应物质的标记技术。对对机机体体参参与与免免疫疫应应答答的的细细胞胞进进行行鉴鉴定
3、定,计计数及功能测定数及功能测定(一一)细胞计数细胞计数1.荧光抗体染色荧光抗体染色2.免疫酶染色技术免疫酶染色技术:*ABC法法*APAAP法法3.免疫金银染色法免疫金银染色法(IGSS)4免疫细胞化学法免疫细胞化学法5四聚体法四聚体法6TCR 链测定链测定三、免疫细胞的检测三、免疫细胞的检测(二二)免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定1.T细细胞胞功功能能测测定定：肿肿瘤瘤，病病毒毒感感染染，免免疫疫缺陷，自身免疫病等缺陷，自身免疫病等(1)细细胞胞增增殖殖(转转化化)试试验验：可可分分为为非非特特异异性性丝裂原和特异性抗原两类。丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有丝裂原主要有PHA、C
4、onA和和PWM；*抗抗原原刺刺激激物物有有破破伤伤风风类类毒毒素素、PPD和和白白色色念念珠菌等；珠菌等；*同种同种MHC及抗及抗CD3单抗等单抗等*肿瘤细胞肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养自体淋巴细胞混合培养(2)T细胞介导的细胞毒试验：细胞介导的细胞毒试验：CTL(3)分泌功能检测分泌功能检测(4)T细胞功能的体内检测法细胞功能的体内检测法*接接触触性性超超敏敏反反应应*移移植植物物抗抗宿宿主主反反应应(GVHR)*迟发型超敏反应迟发型超敏反应(DTH) 2.B细胞功能判定细胞功能判定(1)B细胞增殖细胞增殖(转化转化)试验：试验：*PWM、SAC，LPS（对小鼠（对小鼠B细胞）；细胞）；
5、*抗抗IgM抗体及抗体及EB病毒等病毒等(2)溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验(3)反向溶血空斑试验反向溶血空斑试验(4)酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT是一种可是一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。实验方法。*此法的主要优点是此法的主要优点是:稳定、特异，且抗原用量少；稳定、特异，且抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量测定；量测定；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。 3.NK细胞活性测定细胞活性测定体外检
6、测体外检测NK细胞活性的方法有形态学检查细胞活性的方法有形态学检查法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光法及流式细胞术等。测定人法及流式细胞术等。测定人NK细胞活性常以细胞活性常以K562细胞株作为靶细胞，测定小鼠细胞株作为靶细胞，测定小鼠NK细胞活性细胞活性常用常用YAC1细胞为靶细胞。细胞为靶细胞。(1)形态学检查法形态学检查法(2)放射性核素释放法：用放射性核素放射性核素释放法：用放射性核素(51Cr、125IUdR)标记靶细胞。标记靶细胞。(3)酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶释放
7、至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。活性。*NAG酶荧光比色法酶荧光比色法:NAG酶是细胞浆中存在的一酶是细胞浆中存在的一种溶酶体酶种溶酶体酶,与其底物作用后与其底物作用后,生成荧光产物生成荧光产物,应应用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于LDH比色法。而且方法简单，结果稳定，重复性好。比色法。而且方法简单，结果稳定，重复性好。(4)化学发光法化学发光法(5)流式细胞术：应用流式细胞术：应用FCM检测检测NK细胞活性是细胞活性是根据根据PI染料排斥法。染料排斥法。PI渗入死亡细胞内与渗入死亡细胞内与DNA和和RNA结合，在结合，在488nm波长激发下产生绿色
8、荧波长激发下产生绿色荧光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以用于总细胞毒活性试验。用于总细胞毒活性试验。*还可利用荧光染料法还可利用荧光染料法,细胞光扫描法，双标记细胞光扫描法，双标记细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。 4吞噬细胞功能测定吞噬细胞功能测定(1)中中性性粒粒细细胞胞趋趋化化功功能能测测定定：一一般般采采用用滤滤膜膜渗渗透法透法(Boyden小室法小室法)或琼脂糖平板法。或琼脂糖平板法。(2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定1)显微镜检法显微镜检法2)NBT试试验验：此此项项试试
9、验验是是测测定定中中性性粒粒细细胞胞吞吞噬噬、杀菌功能的一种简易方法。杀菌功能的一种简易方法。3)化化学学发发光光测测定定法法：中中性性粒粒细细胞胞在在吞吞噬噬过过程程中中出出现现呼呼吸吸爆爆发发,产产生生活活性性氧氧代代谢谢产产物物。此此类类活活性性氧氧化化基基团团与与细细胞胞内内杀杀菌菌作作用用密密切切相相关关，同同时时又又能能激发细胞内某些物质产生化学发光。激发细胞内某些物质产生化学发光。(4)巨巨噬噬细细胞胞细细胞胞毒毒测测定定:通通常常取取小小鼠鼠腹腹腔腔巨巨噬噬细细胞胞，以以 -干干扰扰素素为为激激活活剂剂使使其其活活化化，作作为为效效应应细细胞胞。用用125I-UdR标标记记的的
10、DBA/2小小鼠鼠肥大细胞瘤肥大细胞瘤P815作为靶细胞。作为靶细胞。(3)巨巨噬噬细细胞胞吞吞噬噬功功能能测测定定：中中药药斑斑蝥蝥酒酒精精浸浸液液敷敷贴贴法法诱诱发发无无菌菌性性皮皮炎炎，从从皮皮肤肤水水泡泡渗渗出出液液中中收收集集巨巨噬噬细细胞胞，在在体体外外进进行行鸡鸡红红细细胞胞吞吞噬噬试试验验，计计算算吞吞噬噬率率和和吞吞噬噬指指数数，作作为为判判断断巨噬细胞吞噬功能的指标。巨噬细胞吞噬功能的指标。四、细胞因子的检测四、细胞因子的检测（一）免疫学检测法（一）免疫学检测法免免疫疫学学检检测测的的基基本本原原理理是是将将细细胞胞因因子子作作为为抗抗原原进进行行定定量量检检测测。如如免免
11、疫疫斑斑点点法法、ELISA法法、RIA法法和和免免疫疫印印迹迹法法等等均均已已用用于于细细胞胞因因子子的的检检测测。某某些些细细胞胞因因子子含含量量甚甚微微的的样样品品(如如脑脑脊脊液液)可可用用免免疫疫聚聚合合酶酶链链反反应应(immuno-PCR)进行检测。进行检测。（二）生物学测定法（二）生物学测定法根根据据细细胞胞因因子子对对特特定定的的生生物物学学活活性性,应应用用相相应应的的指指示示系系统统,同同时时与与标标准准品品对对比比测测定定,从从而而得得知知样样品品中中细细胞胞因因子子的的活活性性水水平平,一一般般以以活活性性单位单位(U/ml)表示。表示。靶靶细细胞胞可可直直接接从从组
12、组织织中中分分离离,如如骨骨髓髓细细胞胞的的集集落落形形成成试试验验和和胸胸腺腺细细胞胞(脾脾细细胞胞)的的增增殖殖试试验验,或或用用体体外外培培养养的的依依赖赖细细胞胞因因子子才才能能生生长长的的细细胞胞因因子子依依赖赖株株及及对对细细胞胞因因子子杀杀伤伤敏敏感感的的细细胞胞作作为为靶细胞。靶细胞。1.促进细胞增殖和增殖抑制法促进细胞增殖和增殖抑制法*多多种种IL、表表皮皮生生长长因因子子、转转化化生生长长因因子子、神神经经生生长长因因子子、血血小小板板衍衍生生生生长长因因子子、成成纤纤维维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子*各种各种CSF作用于造血系统的不
13、同细胞作用于造血系统的不同细胞,可可促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆培促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆培养骨髓细胞的集落形成养骨髓细胞的集落形成,故可采用集落形成试故可采用集落形成试验研究验研究CSF的水平的水平*常用的检测细胞增殖的方法有常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括MTT、XTT、MTS和和NAG等方法。等方法。 2.细胞毒活性测定法细胞毒活性测定法许许多多细细胞胞因因子子(TNF)针针对对转转化化的的细细胞
14、胞及及病病毒毒感感染染的的细细胞胞具具有有溶溶细细胞胞或或抑抑制制细细胞生长的活性。胞生长的活性。3.抗病毒活性测定法抗病毒活性测定法常常用用于于检检测测抗抗病病毒毒活活性性的的细细胞胞株株有有WISH,Hep2/c,L929,A549和和 MDBK等等 。 其其 中中WISH和和Hep2/c细细胞胞株株用用以以检检测测人人干干扰扰素素,L929细细胞胞株株用用于于检检测测小小鼠鼠干干扰扰素素,Ratec细细胞胞株株用用于于检检测测大大鼠鼠干干扰扰素素,而而MDBK细细胞胞株株则则可可用用于于检检测多种族的测多种族的IFN-和和IFN-。常常用用于于攻攻击击细细胞胞的的病病毒毒有有滤滤泡泡性性
15、口口炎炎病病毒毒(VSV)、鼠鼠脑脑心心肌肌炎炎病病毒毒(EMCV)以以及及Sindbisvirus等病毒。等病毒。检测抗病毒活性的方法检测抗病毒活性的方法:测定细胞因子抑测定细胞因子抑制病毒的致细胞病变效应制病毒的致细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量等。斑形成或抑制病毒的产量等。 4.趋化活性测定法趋化活性测定法多多种种细细胞胞因因子子具具有有趋趋化化活活性性，分分别别能能诱诱导导中中性性粒粒细细胞胞、单单核核/巨巨噬噬细细胞胞和和淋淋巴巴细细胞胞定定向向迁移迁移趋趋化化因因子子诱诱导导细细胞胞移移动动的的方方式式包包括括趋趋化化性性和化学增活现象。和化学增
16、活现象。趋趋化化性性(chemotaxis)是是指指诱诱导导细细胞胞向向趋趋化化因因子子化化学学浓浓度度高高的的方方向向作作定定向向移移动动,可可采采用用琼琼脂脂糖糖和和微微孔孔小小室室趋趋化化试试验验测测定定细细胞胞因因子子的的趋趋化活性；化活性；化学增活现象化学增活现象(chemokinesis)是指增强是指增强细胞的随机运动细胞的随机运动,可采用琼脂糖小滴化学动力可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。学试验检测。 (三三)分子生物学测定法分子生物学测定法RNA印迹法、核酸酶保护分析、原印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、位杂交、PCR和和RealTimePCR等。亦可等。亦可通过检测细胞内细
17、胞因子的基因组成或通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量，推算出细胞因子的合成量。量，推算出细胞因子的合成量。 (四四)单个细胞产生细胞因子测定法单个细胞产生细胞因子测定法常常用用的的方方法法有有反反向向溶溶血血空空斑斑试试验验(RHPA)和反向和反向ELISA斑点试验斑点试验(1)反反向向溶溶血血空空斑斑试试验验(RHPA):RHPA是是一一种种体体外外检检测测抗抗体体分分泌泌细细胞胞的的试试验验,亦亦可可用于检测细胞因子。用于检测细胞因子。(2)酶酶联联免免疫疫斑斑点点试试验验(ELISPOT):所所用用的的包包被被抗抗体体与与酶酶标标抗抗体体应应分分别别针针对对细细胞胞因子的不同抗
18、原决定簇因子的不同抗原决定簇(五五)细胞内细胞因子的检测细胞内细胞因子的检测采采用用FCM免免疫疫荧荧光光技技术术可可从从单单细细胞胞水水平平检检测测不不同同细细胞胞亚亚群群中中的的细细胞胞因因子子,用用两两种种标标记记的的荧荧光光抗抗体体可可在在一一种种细细胞胞内内同同时时测定两种不同的细胞因子。测定两种不同的细胞因子。细胞因子受体检测的基本技术细胞因子受体检测的基本技术细胞因子的广泛生物学活性是通过与细胞因子的广泛生物学活性是通过与各自相应的受体结合而发挥的。因此细各自相应的受体结合而发挥的。因此细胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，已成为基础理论和临床
19、免疫学研究的一已成为基础理论和临床免疫学研究的一个重要内容。个重要内容。 五、粘附分子的检测五、粘附分子的检测某某些些粘粘附附分分子子除除表表达达于于细细胞胞膜膜表表面面外外，还还以以可可溶溶性性形形式式存存在在于于体体液液中中。粘粘附附分分子子的的检检测测方方法法目目前前大大多多采采用用免免疫疫学学技技术术检检查查其其在在细细胞胞膜膜上上的的分分布布和和测测定定某某些些样样品中的含量。品中的含量。六、免疫相关基因分析六、免疫相关基因分析*包包括括各各种种类类型型的的杂杂交交技技术术，如如转转印印杂杂交交、斑斑点杂交、原位杂交等以及点杂交、原位杂交等以及PCR技术等。技术等。杂杂交交技技术术主
20、主要要工工具具是是核核酸酸探探针针，它它是是指指一一段段用用放放射射性性核核素素或或其其他他标标记记物物(生生物物素素、荧荧光光素素、地地高高辛辛等等)标标记记，并并与与目目的的基基因因互互补补的的DNA片片段段或或单单链链DNA、RNA。分分为为cDNA探探针针、寡寡核核苷酸探针、基因组苷酸探针、基因组DNA探针及探针及RNA探针等。探针等。*核核酸酸探探针针技技术术的的操操作作主主要要包包括括：质质粒粒DNA的的提提取取；靶靶DNA片片段段的的分分离离；靶靶DNA片片段段的的标标记记；待待测测样样品品mRNA的的提提取取；标标记记cDNA探探针针与与待待测测样样品品进进行行杂杂交交；放放射
21、射自自显显影或显色分析。影或显色分析。(一一)细胞因子基因组细胞因子基因组DNA或或mRNA的检测的检测1.Northern杂交分析杂交分析2.斑点杂交法斑点杂交法3.原位杂交法原位杂交法4.PCR扩扩增增产产物物杂杂交交分分析析是是将将细细胞胞因因子子的的mRNA经经过过逆逆转转录录为为cDNA，用用特特异异性性细细胞胞因因子子引引物物进进行行PCR扩扩增增，通通过过Southernblot后后，再用标记探针检测特异细胞因子再用标记探针检测特异细胞因子DNA的水平。的水平。5Southern印迹杂交印迹杂交6.斑斑点点及及狭狭缝缝印印迹迹杂杂交交:将将DNA变变性性后后直直接接点样于硝酸纤维
22、膜上再进行杂交点样于硝酸纤维膜上再进行杂交7.细胞因子细胞因子mRNA表达的测定还可采用表达的测定还可采用RT-PCR、原位杂交与原位、原位杂交与原位PCR,RNA半寿期的半寿期的检测检测,进行中的转录分析等。进行中的转录分析等。(二二)BCR及及TCR克隆性基因重排分析克隆性基因重排分析1Southern印印迹迹杂杂交交法法：仅仅适适用用于于科科研研，而不适用于临床诊断。而不适用于临床诊断。2.PCR扩扩增增技技术术:正正常常多多克克隆隆淋淋巴巴细细胞胞群群DNA的的扩扩增增产产物物含含有有不不同同长长度度的的片片段段，电电泳泳检检查查呈呈现现弥弥漫漫涂涂片片状状结结构构或或多多条条带带。而
23、而单单克克隆隆性性基基因因重重排排经经PCR扩扩增增后后，产产生生明明显显相相同同长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构*应应用用PCR扩扩增增技技术术进进行行基基因因诊诊断断具具有有特特异异、敏敏感感(1/1041/105克克隆隆性性细细胞胞)、快快速速(24h可完成可完成)等优点。等优点。*用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以及白血病治疗后微小残留病灶的检测。以及白血病治疗后微小残留病灶的检测。 (三三)HLA基因分型技术基因分型技术1 序序 列列 特特 异异 性性 寡寡 核核 苷苷 酸酸 探探 针针 PCR(PCR-
24、SSOP)或或PCR-ASO:PCR-SSOP是是目目前前应应用用最最多多的的一一种种简简单单、快快速速而而又又精精确确的的HLA-类类抗抗原原分分型型方方法法，能能鉴鉴定定所所有有已已知知序序列列的的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精确地分析等位基因，精确地分析DNA的多态性。的多态性。2限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性(PCR-RFLP)技技术术：此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。3单单链链构构象象多多态态性性PCR（PCR-SSCP）：藉藉此可鉴别编码此可鉴别编码HLA-类抗原基因的多态性。类抗原基因的多态性。应应用用PCR-S
25、SCP可可以以直直接接比比较较供供、受受体体之之间间HLA-类类基基因因是是否否完完全全一一致致，且且可可精精确确到到1 2个个碱碱基基之之差差，具具有有相相对对简简捷捷而而精精确确的的特特点点。在在异异基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。4序序列列特特异异性性引引物物PCR技技术术(PCR-SSP)：该该法法操操作作简简单单、快快速速、实实验验结结果果容容易易判判断断，杂杂合合子子也也很很易易检检出出。不不足足之之处处在在于于，为为检检出出所所有有的的等等位基因必须用多个引物进行扩增。位基因必须用多个引物进行扩增。5指指纹纹图图谱谱(PCR-finge
26、rprinting)技技术术|：进进行行HLA-基基因因分分型型鉴鉴定定时时，将将供供、受受体体的的DNA扩扩增增产产物物混混合合，电电泳泳后后得得出出一一指指纹纹图图，再再与与二二者者各各自自的的PCR指指纹纹图图谱谱进进行行比比较较，从从中中选选择择出出指纹图一致的供、受体进行移植。指纹图一致的供、受体进行移植。*PCR指指纹纹图图谱谱在在选选择择非非亲亲缘缘关关系系的的供供、受受体体进进行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。6. SNP(单个核苷酸多态性单个核苷酸多态性)分析分析(四四)补体基因分析补体基因分析(五五)抗体基因分析抗体基因分析
27、(六六)细胞膜分子基因分析细胞膜分子基因分析七、免疫标记技术七、免疫标记技术(一一)免疫荧光技术免疫荧光技术(二二)放射免疫分析法放射免疫分析法(三三)酶免疫技术酶免疫技术(四四)发光免疫测定发光免疫测定八、免疫八、免疫PCR(IM-PCR)技术技术免免疫疫PCR是是将将抗抗原原抗抗体体的的特特异异性性反反应应与与PCR技技术术结结合合起起来来,用用以以检检测测微微量量蛋蛋白白质质的的方方法法。免免疫疫PCR是是用用DNA分分子子标标记记特特异异性性抗抗体体，利利用用PCR可可大大量量扩扩增增DNA片片段段的的特特点点，从从而而将将检检测测灵灵敏敏度度大大大大提提高高，最最低低检检测测值值可可
28、达达10-21mol/L。1.直直接接免免疫疫PCR是是将将抗抗原原包包被被在在固固相相载载体体上上,用用特特异异性性单单抗抗结结合合此此抗抗原原,再再用用生生物物素素化化抗抗体体通通过过亲亲合合素素连连接接生生物物素素化化DNA,然然后后将将后后者进行者进行PCR2.间接免疫间接免疫PCR系将所测物的单抗包被系将所测物的单抗包被在固相载体上在固相载体上,然后使所测抗原与之结合然后使所测抗原与之结合,再将再将特异性抗体生物素化特异性抗体生物素化,并通过亲合素连结生物并通过亲合素连结生物素化素化DNA分子而将后者进行分子而将后者进行PCR 九、新型抗体的制备技术九、新型抗体的制备技术(一一)对鼠
29、源性抗体的改造对鼠源性抗体的改造1人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体(chimericantibody)：鼠源性单抗的：鼠源性单抗的V区，人免疫球区，人免疫球蛋白的蛋白的C区。区。 2人人源源化化抗抗体体将将鼠鼠抗抗体体的的互互补补决决定定区区(CDR)与人与人IgFR和和C连接构建连接构建“人源化抗体人源化抗体”。(1)模模板板替替换换:使使用用与与鼠鼠对对应应部部分分有有较较大大同同源源性性的的人人FR替替换换鼠鼠FR区区, 例例如如可可通通过过CDR移移植植构建构建“改型抗体改型抗体”(2)表表面面重重塑塑:对对鼠鼠CDR及及FR表表面面残残基基进进行行重重塑塑或或镶镶饰饰,使使之之类类似似于于
30、人人抗抗体体CDR的的轮轮廓廓或或人人FR的型式。的型式。(3)补补偿偿变变换换:在在人人FR选选择择与与CDR有有互互补补作作用用、与与抗抗体体的的亲亲和和力力有有密密切切关关系系或或对对FR空空间间结结构构折折叠叠起起关关键键作作用用的的残残基基进进行行改改变变,以以补补偿偿完完全全的的CDR移植移植(4)定定位位保保留留:通通过过计计算算机机模模建建从从现现有有的的人人源源抗抗体体保保守守序序列列中中搜搜寻寻与与鼠鼠FR区区最最类类似似的的序序列列,根根据据最最简简位位置置模模板板确确定定鼠鼠可可变变区区的的关关键键位位置置残残基基,并并保保留留所所有有这这些些位位置置而而将将其其余余部
31、部分分进进行行人人源源化。化。3.小分子抗体小分子抗体(1)ScFv：由由VH和和VL中中间间连连以以14 15个个小小肽肽,常用的连接肽为常用的连接肽为(Gly4Ser)3(2)VH与与VL适适当当部部位位各各引引入入一一个个半半胱胱氨氨酸酸形形成以二硫键固定的成以二硫键固定的Fv段而构成的段而构成的DsFv(3)将将ScFv中中两两个个可可变变区区之之间间的的接接头头缩缩短短,使使两两分分子子间间VH和和VL配配对对形形成成双双价价小小分分子子抗抗体体(Diabody)(4)将将两两种种不不同同特特异异性性的的V基基因因交交叉叉配配对对,则则可可得到双特异性得到双特异性Diabody(5)
32、在在ScFv的的一一端端加加上上一一个个双双聚聚化化结结构构亦亦可可构构建建不不同同类类型型的的双双价价或或双双特特异异性性小小分分子子抗抗体体,如如Minibody等等(二二)抗体库技术抗体库技术(三三)产产生生嵌嵌合合抗抗体体的的小小鼠鼠和和产产生生人人抗抗体体的小鼠的小鼠利利用用基基因因打打靶靶和和取取代代的的方方法法以以及及转转基因技术产生嵌合抗体。基因技术产生嵌合抗体。通过转基因、基因缺失及杂交和选通过转基因、基因缺失及杂交和选择等一系列过程，获得双转染基因择等一系列过程，获得双转染基因(人人H、 链基因链基因)的纯合小鼠。其脾、淋巴结、的纯合小鼠。其脾、淋巴结、骨髓中的骨髓中的B细
33、胞可表达人的细胞可表达人的链。链。 (四四)细胞内抗体细胞内抗体*细细胞胞内内抗抗体体是是指指在在细细胞胞内内合合成成并并作作用用于于细细胞胞内内组分的抗体组分的抗体,亦称为内抗体亦称为内抗体(intrabody)。*若若在在抗抗体体基基因因的的N端端或或C端端加加入入引引导导序序列列就就能能使使抗抗体体表表达达定定位位亚亚细细胞胞部部位位,如如胞胞浆浆、线线粒粒体体、内质网或细胞核部位。内质网或细胞核部位。*若若在在细细胞胞内内表表达达特特异异识识别别与与肿肿瘤瘤发发生生有有关关的的癌癌基基因因编编码码的的抗抗体体,即即可可抑抑制制癌癌基基因因编编码码产产物物的的表表达达,可用于肿瘤的治疗。
34、可用于肿瘤的治疗。*细胞内免疫用于病毒性疾病的治疗细胞内免疫用于病毒性疾病的治疗*抗抗EGFR胞外区的胞外区的ScFv-RIR,并在并在ScFv-RIR的的C-末端连接末端连接KDEL肽肽,提供提供ER滞留滞留 (五五)基因工程抗体衍生技术基因工程抗体衍生技术1双双特特异异性性抗抗体体(BsAb)或或称称双双功功能能抗抗体体(BfA)。2.抗抗体体的的抗抗原原化化技技术术：借借助助人人源源化化抗抗体体的的构构建建方方法法，以以抗抗体体V区区作作为为分分子子载载体体来来表表达达生生物物学学相相关关的的多多肽肽或或外外源源性性抗抗原原表表位位，即即抗抗原原化化抗体抗体(antigenizedant
35、ibody,AbAg)。3抗体重组免疫毒素抗体重组免疫毒素4.催化抗体催化抗体(catalyticantibody)或抗体酶或抗体酶(abzyme)：将催化活性引入抗体的结合部位：将催化活性引入抗体的结合部位,产生一种具有抗体和酶双功能的蛋白质产生一种具有抗体和酶双功能的蛋白质,称为称为抗体酶或程序性酶抗体酶或程序性酶(programmableenzyme)。 十、杂交瘤技术与十、杂交瘤技术与T细胞克隆技术细胞克隆技术一一、杂交瘤技术杂交瘤技术1.B细胞杂交瘤技术与单抗的制备细胞杂交瘤技术与单抗的制备2.T细胞杂交瘤技术与其功能的研究细胞杂交瘤技术与其功能的研究二二、T细胞克隆技术细胞克隆技术
36、*按按其其特特异异性性分分为为抗抗原原特特异异性性和和非非特特异异性性T细细胞克隆。胞克隆。*按按其其功功能能则则可可分分为为辅辅助助性性和和细细胞胞毒毒性性T细细胞胞克隆。克隆。(一一)抗原特异性抗原特异性T细胞克隆细胞克隆(二二)抗原非特异性抗原非特异性T细胞克隆的制备细胞克隆的制备(三三)同种反应性同种反应性TH和和CTL克隆的制备克隆的制备(四四)肿瘤抗原特异性肿瘤抗原特异性CTL克隆克隆 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测一、概述一、概述细细胞胞凋凋亡亡(apoptosis,Apo)是是生生物物体体内内无无用用的的、老老化化的的一一些些损损伤伤细细胞胞自自动动死死亡亡的的一一种种形形式式，
37、是是指指在在一一定定的的生生理理和和病病理理情情况况下下,机机体体为为维维护护内内环环境境的的稳稳定定,通通过过基基因调控而使细胞自动消亡的过程。因调控而使细胞自动消亡的过程。二、细胞凋亡与细胞坏死的区别二、细胞凋亡与细胞坏死的区别*细细胞胞坏坏死死是是细细胞胞膜膜,线线粒粒体体膜膜结结构构、流流动动性性、渗渗透透性性及及受受体体等等均均受受损损,进进而而细细胞胞溶溶解解、坏坏死死；而细胞凋亡时上述结构和功能均保持不变；而细胞凋亡时上述结构和功能均保持不变；*细细胞胞坏坏死死时时,ATP和和蛋蛋白白质质合合成成抑抑制制及及终终止止;细细胞胞凋凋亡亡时时,ATP、mRNA和和蛋蛋白白质质合合成成
38、依依旧旧,细细胞胞第二信号系统仍活动第二信号系统仍活动;*细细胞胞坏坏死死时时,细细胞胞DNA随随机机降降解解,电电泳泳不不呈呈梯梯状状图图谱谱;细细胞胞凋凋亡亡时时,DNA多多降降解解成成180200bp或或其其倍数的梯状片段倍数的梯状片段,电泳呈梯状图谱电泳呈梯状图谱;*细细胞胞坏坏死死时时,细细胞胞内内容容物物外外溢溢,引引起起局局部部炎炎症症反反应应或或组组织织损损伤伤;细细胞胞凋凋亡亡时时,细细胞胞内内容容物物不不外外溢溢,所以不引起炎症反应或局部损伤所以不引起炎症反应或局部损伤;*细胞坏死时细胞坏死时,往往是成团细胞死亡往往是成团细胞死亡;细胞凋亡时细胞凋亡时,在组织中呈分散状态分
39、布。在组织中呈分散状态分布。 三、研究细胞凋亡的意义三、研究细胞凋亡的意义1.细细胞胞凋凋亡亡在在肿肿瘤瘤形形成成和和治治疗疗中中具具有有重重要要作作用。用。*凋亡基因与抗凋亡基因突变凋亡基因与抗凋亡基因突变易形成肿瘤；易形成肿瘤；*免疫效应细胞表达免疫效应细胞表达FasL,肿瘤细胞表达肿瘤细胞表达Fas诱导肿瘤细胞凋亡诱导肿瘤细胞凋亡抗肿瘤抗肿瘤*肿瘤细胞高表达肿瘤细胞高表达FasL诱导免疫细胞凋亡诱导免疫细胞凋亡抑制免疫功能抑制免疫功能逃避免疫监视逃避免疫监视*肿瘤细胞低表达或不表达肿瘤细胞低表达或不表达Fas逃避免疫监视逃避免疫监视 2.细胞凋亡与免疫学的关系细胞凋亡与免疫学的关系*细胞
40、凋亡与细胞凋亡与T细胞在胸腺的发育细胞在胸腺的发育*细胞凋亡与成熟细胞凋亡与成熟T细胞：细胞：AICD*细胞凋亡与与细胞凋亡与与B细胞细胞*细胞凋亡与胞毒效应细胞凋亡与胞毒效应3.细胞凋亡参与自身免疫病的发生细胞凋亡参与自身免疫病的发生4.细胞凋亡与病毒感染细胞凋亡与病毒感染*抗病毒免疫防御抗病毒免疫防御*细胞凋亡与细胞凋亡与AIDS*细胞凋亡与病毒性肝炎细胞凋亡与病毒性肝炎细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法一、形态学方法一、形态学方法1普通光学显微镜检测法普通光学显微镜检测法2荧光显微镜检测法荧光显微镜检测法材料：材料：石蜡切片石蜡切片;冰冻切片冰冻切片;细胞学涂片。细胞学涂片。方方法法一
41、一：PI染染液液：碘碘化化丙丙啶啶(propidiumiodide,PI)；DAPI染液；染液；AO染液：染液：*荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察。PI染染色色选选用用600nm的的激激发发光光,DAPI选选用用460500nm的的激激发发光光,AO染染色色选用选用520nm的激发光。的激发光。*HE染染色色核核DNA呈呈蓝蓝色色,而而PI染染色色呈呈红红色色,DAPI染染色色呈呈蓝蓝白白色色,AO染染色色呈呈黄黄绿绿色色。凋凋亡亡细细胞胞呈呈现现核核浓浓缩缩,染染色色加加深深,或或核核染染色色质质呈呈新新月月形形聚聚集集于于核核膜膜一一边边;晚晚期期凋凋亡亡细细胞胞表表现现为为核核碎碎裂裂成
42、成大小不等的圆形小体被细胞膜包绕大小不等的圆形小体被细胞膜包绕,即凋亡小体。即凋亡小体。方法二：方法二：Hoechst33342/PI双标记法双标记法*在在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察，凋凋亡亡细细胞胞的的蓝蓝色色荧荧光光比比活活细细胞胞和和非非凋凋亡亡细细胞胞都都要要强强，其其光光散散射射能能力力则则降降低低，将将二二者者结结合合起起来来，可可以以很很好好地地鉴鉴定定凋凋亡亡细细胞胞。坏坏死死细细胞胞则则由由于于PI复复染染，呈呈红红色色荧荧光光。是是目目前前细细胞胞凋亡最满意的形态学分析方法。凋亡最满意的形态学分析方法。*样样品品来来源源培培养养细细胞胞或或离离体体细细胞胞制制成成的单
43、个细胞悬液。的单个细胞悬液。方方法法三三：碘碘化化丙丙啶啶（PI）和和Hoechst33342(HO)双染法双染法PI和和HO均均可可使使用用紫紫外外光光激激发发，其其荧荧光光分分别别为为红红光光和和蓝蓝光光。对对照照活活细细胞胞的的HO蓝蓝色色荧荧光光最最强强，而而早早期期凋凋亡亡细细胞胞由由于于其其DNA降降解解和和丢丢失失，其其HO蓝蓝色色荧荧光光较较弱弱，也也有有很很弱弱的的PI红红色色荧荧光光。晚晚期期凋凋亡亡细细胞胞PI红红色色荧荧光光增增强强，坏坏死死细细胞胞PI红红色色荧荧光光最强，而最强，而HO蓝色荧光较弱。蓝色荧光较弱。3凋凋亡亡小小体体的的电电镜镜观观察察小小体体系系由由
44、细细胞胞膜膜卷卷曲曲、脱脱落落形形成成的的小小泡泡,其其内内包包含含有有完完整的细胞器及核片段。整的细胞器及核片段。二、生物化学方法二、生物化学方法电泳法电泳法DNA梯带梯带(DNAladder)。三、免疫学方法三、免疫学方法(ELISA法法)*细细胞胞凋凋亡亡的的发发生生,是是由由于于内内源源性性核核酸酸内内切切酶酶的的激激活活,核核小小体体间间区区双双链链DNA解解开开,产产生生单单/低低聚聚核核小小体体片片段段,而而核核小小体体DNA由由于于与与组组蛋蛋白白H2A、H2B、H3和和H4形形成成紧密复合物而不被核酸内切酶裂解。紧密复合物而不被核酸内切酶裂解。采用双抗体夹心酶免疫法采用双抗体
45、夹心酶免疫法,应用小鼠抗应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体与核小体片段形成夹心结构片段形成夹心结构,可特异性检测细胞溶可特异性检测细胞溶解物中的单解物中的单/低聚核小体。低聚核小体。 四四、原原位位末末端端转转移移酶酶标标记记技技术术 (TdT或或TUNEL)凋凋亡亡细细胞胞由由于于内内源源性性核核酸酸内内切切酶酶的的激激活活,核核DNA被被切切割割成成许许多多双双链链DNA片片段段以以及及高高分分子子量量DNA单单链链断断裂裂点点(缺缺口口),暴暴露露出出大大量量3羟羟基基末末端端,如如用用(TdT)将将标标记记的的-dUTP进进行行缺缺口口末末端端标标记记,则则可原位特异地显示出凋亡细胞。可原位特异地显示出凋亡细胞。(一一)荧光标记法荧光标记法*采采用用美美国国Oncor公公司司ApopTagTM试试剂剂盒盒，或或德德国国Boehringer Mannheim公公司司In Situ CellDeathDetection试剂盒试剂盒(二二)酶标记法酶标记法*采用美国采用美国Oncor公司公司ApopTagTM-Peroxidase试剂盒试剂盒
