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1、2 章章 肝纤维化的分子生物学肝纤维化的分子生物学 大部分是可逆的大部分是可逆的, , 其中其中25%25%40%40%最终发展为最终发展为肝硬化肝硬化及及肝癌肝癌 肝纤维化肝纤维化 是指是指机体对慢性机体对慢性肝肝损伤的修复反应损伤的修复反应,是是肝脏内弥漫性肝脏内弥漫性细胞外基质细胞外基质(特别是胶原特别是胶原)过度沉积过度沉积. 是许多慢性肝病共同的病理过程是许多慢性肝病共同的病理过程. 几乎各种慢性肝病几乎各种慢性肝病(化学毒性、感染性、遗传代谢性、自身免疫性化学毒性、感染性、遗传代谢性、自身免疫性,以及胆以及胆汁淤积性汁淤积性)都可以导致肝纤维化都可以导致肝纤维化.一一.病因病因:病
2、毒性肝炎病毒性肝炎, 血吸虫血吸虫: HBV HCV HDV 易转为慢性易转为慢性 刺激刺激虫卵虫卵, 虫卵肉牙肿等虫卵肉牙肿等 肝纤维化肝纤维化酒精酒精, 药物药物, 毒物毒物: 酒精酒精 刺激刺激 毒物毒物 (CCl4, 农药农药) 药物药物 (大环内酯抗生素大环内酯抗生素, 抗肿瘤药物抗肿瘤药物)肝纤维化肝纤维化 胆汁性胆汁性, 心源性心源性: 肝内小胆管慢性进行性炎症性破坏， 及肝内胆汁淤积 肝脏长期缺氧肝脏长期缺氧, hepatocyte坏死坏死 心力衰竭心力衰竭肝纤维化肝纤维化直接刺激成纤维细胞直接刺激成纤维细胞, HSC等过量表达等过量表达collagen肝脏细胞可分为：肝脏细胞
3、可分为：肝实质细胞即肝细胞肝实质细胞即肝细胞（hepatocyte）；非实质细胞：血窦内皮细胞非实质细胞：血窦内皮细胞 (SEC)、Kupffer细胞细胞(KC)、陷窝细胞、陷窝细胞（pit cell）及肝星状细胞及肝星状细胞 (HSC)。二二. 发生机制发生机制: 多因素作用的结果多因素作用的结果Hepatic sinusoid窦状隙窦状隙 胶原胶原: 主要为主要为型型(肝纤维化晚期多肝纤维化晚期多), 型型(肝纤维化早期多肝纤维化早期多)种类种类 非胶原非胶原糖蛋白糖蛋白: 纤维连结素纤维连结素(FN ) 层粘连蛋白层粘连蛋白(LN)蛋白多糖蛋白多糖:1.胞外基质胞外基质 (extrace
4、llular matrix, ECM) : 是指位于机体是指位于机体细胞外的非胞外的非细胞性的有形或无定形成胞性的有形或无定形成分分 胶原胶原纤维染色照片染色照片说明（明（100） A：正常：正常组，汇管区管区见少量胶原少量胶原.B：造模：造模1wk，汇管区有少量胶原向管区有少量胶原向组织沿伸沿伸.C：造模：造模2wk，肝小叶内有不完全，肝小叶内有不完全纤维间隔形成隔形成.D：造模：造模4wk，完全，完全纤维间隔形成，假小叶明隔形成，假小叶明显.胶原：胶原：三股三股螺旋螺旋结构构ABCD纤维连结素纤维连结素: 参与细胞分化参与细胞分化, 创伤愈合等创伤愈合等, 肝纤维化时肝纤维化时, 促肝细胞
5、分泌胶原促肝细胞分泌胶原.肝组织中肝组织中FN的免役组化的免役组化层粘连蛋白层粘连蛋白: 血管血管,小胆管的小胆管的基底膜成分基底膜成分及及Disse中中蛋白多糖蛋白多糖: 在肝中最多的是硫酸乙酰肝素在肝中最多的是硫酸乙酰肝素 胶原胶原糖蛋白糖蛋白: 纤维连结素纤维连结素(FN ) 层粘连蛋白层粘连蛋白(LN)蛋白多糖蛋白多糖:主要由主要由HSC产生产生 ECM 的过多表达导致肝纤维化的过多表达导致肝纤维化: 肝损伤肝损伤HSC的激活的激活, 增殖增殖ECM 的过多表达的过多表达肝细胞肝细胞, kupffer细胞，细胞，内皮内皮细胞胞 肝细胞受损肝细胞受损(启动启动HSC分化分化)细胞因子促进
6、细胞因子促进HSC激活激活细胞因子细胞因子自分泌自分泌促进促进HSC激活激活ECM 过多表达过多表达 ECM 的降解的降解: 基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶 (MMP)作用于作用于 相应的相应的ECM组分组分, 使使ECM 的降的降 解与合成处于平衡解与合成处于平衡. MMP抑制因子抑制因子: TIMP2. MMP (基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶 ) 及及 TIMP(金属蛋白酶组织抑制因子金属蛋白酶组织抑制因子 )MMPsECMECM降解降解TIMPs特异或非特异抑制特异或非特异抑制1) MMP: 为含为含Zn+蛋白酶，蛋白酶，人体已人体已发现的的MMP有有20种种，降解相应的降解相应的ECM组
7、分组分 MMP可分可分为4类：间质胶原胶原酶(主要包括主要包括MMP-1, MMP-8, MMP-13)主主要作用要作用,型胶原型胶原基基质溶解素溶解素（主要包括主要包括MMP-3, MMP-10,MMP-11及及MMP-7）主要作用于主要作用于蛋白多糖蛋白多糖等等明胶明胶酶（主要包括主要包括MMP-2及及MMP-9）主要作用于主要作用于型胶原与型胶原与变性胶原及性胶原及弹力蛋白力蛋白膜型金属蛋白膜型金属蛋白酶(含含MT-MMP1及及MT-MMP2)，位于位于细胞的表面，主要与胞的表面，主要与MMP-2的激活有关的激活有关结构结构: 信号肽结构域信号肽结构域 前肽结构域前肽结构域 催化域催化域
8、 羧基端域羧基端域MMPs可在多水平上受到多种方式的可在多水平上受到多种方式的调节 表达表达的调控的调控: MMPs调节调节:细胞因子、激素、生胞因子、激素、生长因子、化学因子、化学药物、生理物、生理应激、激、 （TNF-、PDGF、IL-1）MMPs 基因的表达基因的表达增增强干干扰素素抑制抑制MMPs以无活性的以无活性的酶原形式分泌到原形式分泌到细胞外胞外活活性的调控性的调控: 纤溶溶酶活性活性的的MMPs(t-PA or uPA)纤溶溶酶原原纤溶溶酶激活因子激活因子组织组织, 尿激酶型尿激酶型TIMPs TIMPs在肝在肝脏中来源中来源及功能及功能：为为组织中中MMP的主要内的主要内源性
9、抑制因子源性抑制因子.2) TIMPs:MMPsTIMPs不可逆结合不可逆结合2-巨球蛋白巨球蛋白主要主要为HSC, KC, 少量来源于少量来源于 HC抑制抑制抑制抑制 TIMPs合成调节合成调节: 正常细胞中调节正常细胞中调节MMPs合成的部分因子同样调节合成的部分因子同样调节TIMPs的的表达表达种种类：类：TIMP， TIMP， TIMP，TIMP(TIMP-1MMP-1、MMP-3)TNF-、EGF、FGF增增强TIMP 1表达表达3) MMPs, TIMPs与肝纤维化与肝纤维化: 主要主要HSC kuppfer Cell Hepatocyte SEC MMP, 9降解降解促促肝纤维化
10、肝纤维化纤维化早期纤维化早期MMPs: 主要来源于主要来源于HSC 降解降解纤维胶原纤维胶原 正常结缔组织正常结缔组织阻止阻止肝纤维化肝纤维化MMP细胞与细胞及基质的正常作用细胞与细胞及基质的正常作用uPAMMP2正常结缔组织正常结缔组织-影响细胞间影响细胞间,细胞与细胞与 基质间的正常关系基质间的正常关系 降解降解促肝纤维化促肝纤维化HSCMMP1表达下降表达下降纤维化发展纤维化发展: MMP1表达下降表达下降, MMP 2, 9表达上升表达上升. MMP, 9表达上升表达上升, TIMPs表达上升表达上升,大部分大部分MMPs的酶原水平下降的酶原水平下降30%-40%. TIMPs: 抑制
11、抑制 MMPs活性活性, 因而抑制因而抑制ECM降解降解.主要来源于激活的主要来源于激活的HSCTIMP1 TIMP2等等大量合成大量合成纤维化肝中纤维化肝中促肝纤维化促肝纤维化抑制抑制 MMPs活性活性 MMP1活性活性TIMP1 TIMP2等等 表达下降表达下降抑肝纤维化抑肝纤维化可逆性可逆性肝纤维化的早期肝纤维化的早期：HSC短暂表达某些基质金属蛋白酶（短暂表达某些基质金属蛋白酶（如如 MMP1）和尿激酶型纤溶酶原激活物，并表现为降和尿激酶型纤溶酶原激活物，并表现为降解基质解基质肝纤维化进展期肝纤维化进展期：HSC的金属蛋白酶组织抑制物的金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs)的表达增加，抑制
12、的表达增加，抑制MMPs的活性，的活性，肝纤维化恢复期肝纤维化恢复期：TIMPs迅速下调，迅速下调，MMPs活性增加。活性增加。肝基质降解，导致肝纤维化消退。肝基质降解，导致肝纤维化消退。？HSC是如何是如何调节自身自身变化以促化以促进基基质沉沉积及降解双及降解双重作用重作用 ，目前尚无定，目前尚无定论小结小结:3.与肝纤维化有关的细胞与肝纤维化有关的细胞 (HSC, HC, SEC, KC)1)HSC (hepotic stellate cell): 储脂储脂质质, 维生素维生素A酯酯. 肝脏星状细胞肝脏星状细胞占肝细胞总体数目的占肝细胞总体数目的5-8% . 它们存在于它们存在于Disse
13、腔中，腔中，紧贴紧贴SEC和和HC, HC, 呈梭形或多边形，呈梭形或多边形， 胞浆内胞浆内有多个富含维生素有多个富含维生素A的脂滴的脂滴. 静止态静止态HSC不表达不表达平滑平滑肌肌动蛋白（肌肌动蛋白（SMA），），增殖活性低增殖活性低.静止态静止态HSC主要功能主要功能:(1) 参与细胞外基质的合成和降解参与细胞外基质的合成和降解 :ECM的主要来源的主要来源( (胶原胶原: 表达低表达低, 且合成且合成胶原胶原胶原胶原胶原型胶原型; FN、LN等糖蛋白成分，以及硫酸软骨素和透明质等糖蛋白成分，以及硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖酸等蛋白多糖) ). 正常情况下，肝脏正常情况下，肝脏ECM的
14、合成和分解是处在一个的合成和分解是处在一个动态平衡中动态平衡中, , HSC能分泌多种能分泌多种MMP降解各种细胞外降解各种细胞外基质基质 , ,TIMP-1防止胶原过度降解防止胶原过度降解. . (2) 参与参与Vit A的代谢和贮存的代谢和贮存（体内（体内40%-70%的视黄醛的视黄醛类都存在于其中类都存在于其中) 视黄醛在小肠内酯化后由乳糜微粒视黄醛在小肠内酯化后由乳糜微粒 淋巴管淋巴管 肝细胞摄取乳糜微粒的视黄醛酯，与特异的视黄醛结合蛋白结合肝细胞摄取乳糜微粒的视黄醛酯，与特异的视黄醛结合蛋白结合 转运转运 邻近的邻近的HSC( (维生素维生素A A为脂溶性维生素，包括视黄醇、视黄醛、
15、视黄酸为脂溶性维生素，包括视黄醇、视黄醛、视黄酸) )(3) 表达细胞因子及受体表达细胞因子及受体: :正常情况下，正常情况下，HSC可以分泌一可以分泌一些细胞因子些细胞因子 (肝细胞生长因子肝细胞生长因子HGF HGF , TGF-, , PDGF, TGF- 1、型受体型受体, , PDGF受体的受体的 亚单位亚单位 )(4) 参与肝窦血流调节参与肝窦血流调节: :直接调节肝血窦的微循环，从而直接调节肝血窦的微循环，从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力影响着肝脏的血流分布和门静脉压力 静止态静止态HSC激活态激活态HSC (myofibroblast, MFB) -SMA, ECM (主要
16、主要 type collage)HSC 增殖增殖肝细胞受损肝细胞受损丝裂原丝裂原KCSEC, 血小板血小板巨嗜巨嗜 cell 等等TGF- PDGF等等表达表达Na+大量进入大量进入促促HSC增殖增殖单核细胞区化因子单核细胞区化因子(MCP-1)表达增加表达增加胞浆胞浆Ca+增加增加HSC激活激活TGF- , PDGF等等及相应多种受体及相应多种受体 Vit A脂滴脂滴消失消失, ,胞突伸胞突伸展展, ,细胞星状细胞星状 细胞大量增生，向肝损伤部位迁徙细胞大量增生，向肝损伤部位迁徙 释放释放HSCHSC活化通路活化通路: : 活化是活化是HSCHSC与与KC、HCHC、SECSEC相互作用的结
17、果相互作用的结果 PDGF (最强大的促进最强大的促进HSC分裂和增生的细胞因子分裂和增生的细胞因子 )RasPDGF的的 受体受体 细胞外信号调节的激酶细胞外信号调节的激酶 (ERK )激活激活激活激活C-fos表达增加表达增加 启动启动HSC的增生的增生 干扰干扰ERK的激活可的激活可以阻断以阻断PDGF引引起的起的HSC活化活化 磷脂酰肌醇磷脂酰肌醇-3激酶激酶(PI-3K) 转录信号传递激活因子转录信号传递激活因子( (STAT) PDGF信号途径信号途径 TGF- 信号途径信号途径TGF- ( (已知最强大的促进已知最强大的促进HSC激活激活和和分泌分泌ECMECM的细胞因子的细胞因
18、子) ) T R Smad 向细胞核内转移向细胞核内转移 随后发生转录反应随后发生转录反应 Ras/ERK 2) Hepatocyte (HC, 70%-80%)在肝纤维化中的作用在肝纤维化中的作用: (1) 过量表达过量表达 collagenFN: 启动肝纤维化作用启动肝纤维化作用LN: 肝窦的毛细血管化肝窦的毛细血管化() 表达表达MMP-3的能力下降的能力下降() 表达：表达：TGF- (最强的最强的collage合成刺激因子合成刺激因子) LTBP (ECM成分成分, 激活激活TGF- )() 表达表达ECM受体，受体，为为ECM受体（整合素受体（整合素integrin)的的 主要来源
19、主要来源细胞外基质细胞外基质-整合素整合素-细胞骨架细胞骨架 (与胞内信号途径相连与胞内信号途径相连)通过通过Ras途径激活丝裂原活化蛋白激酶途径激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)MAPK激活后通过调节基因表达等改变细胞行为激活后通过调节基因表达等改变细胞行为,参与参与HSC的增殖、收缩、粘附及迁移的调节的增殖、收缩、粘附及迁移的调节.跨膜受体整合素在肝纤维化发生发展跨膜受体整合素在肝纤维化发生发展中的作用已成为当前研究的一个热点中的作用已成为当前研究的一个热点() HC裂解裂解 tPA（纤溶酶原激活物）（纤溶酶原激活物）: 抑制抑制ECM降解降解. 纤溶酶原激活物纤溶酶原激活物 包括组织型和
20、尿激酶型（包括组织型和尿激酶型（PA tPA 和和 uPA） t PA主要参与纤溶过程主要参与纤溶过程() 表达表达细胞胞间黏附分子黏附分子-1 (ICAM-1, 炎症反应中最重要因子炎症反应中最重要因子) : ICAM-1LFA-1 (淋巴淋巴细胞胞功能相关性抗原功能相关性抗原)炎性细胞炎性细胞聚集聚集 结合结合3) 窦内皮细胞窦内皮细胞 (SEC) SEC型型 collagen, FN释放炎性因子释放炎性因子(PDGF, HGF, )激活激活HSC4)Kupffer cell (KC)：最大的巨嗜细胞最大的巨嗜细胞HC损伤损伤激活激活HSC 释放细胞因子释放细胞因子(PDGF, TGF-
21、1)KC激活激活4. 细胞因子细胞因子 概念概念: 由细胞分泌的调节细胞功能的多肽由细胞分泌的调节细胞功能的多肽. 影响肝纤维化发生发展的影响肝纤维化发生发展的细胞因子细胞因子: PDGF， TGF- 1, TNF- , IL-1, IFN1)TGF- : 2)TGF- : 调节细胞的增殖、分化、粘附、移行和凋亡，调节细胞的增殖、分化、粘附、移行和凋亡， 在生物发育及组织修复过程中起重要作用的在生物发育及组织修复过程中起重要作用的多多肽. 在肝纤维化中的作用在肝纤维化中的作用: : 它可促进细胞外基质的合成和它可促进细胞外基质的合成和分泌，减少细胞外基质的降解，且与病理上肝纤维化分泌，减少细胞
22、外基质的降解，且与病理上肝纤维化程度相平行。程度相平行。 哺乳动物组织中哺乳动物组织中TGF-TGF-种类种类: : TGF- TGF- 1 1 （活性最强活性最强 ）, TGF-, TGF- 2 2 , TGF-, TGF-3 3 . . TGF- 1 合成合成: 肝肝中中 KC SEC 无活性的前体蛋白 酶解 2个多肽，通过二硫键相连，形成成熟分子。丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶活性的型和型TGF-受体来进行信号转导，其不同的浓度可介导TGF-不同的生物活性. HC HSC 在肝纤维化中的部分作用机制在肝纤维化中的部分作用机制细胞外基质的合成细胞外基质的合成促进促进减少减少细胞外
23、基质的降解细胞外基质的降解 TGF- 1抑制抑制MMP合成合成 TIMP合成合成促进促进TGF- 型型 受体受体激活KC, HSC引起炎症引起炎症反应反应胶原酶活性胶原酶活性抑制抑制TGF- 1临床意床意义有研究表明有研究表明测定血清定血清TGF- 1 能判断慢性肝炎是能判断慢性肝炎是“无肝无肝纤维化化”、“处于肝于肝纤维化化阶段段”或或“肝硬化肝硬化”，从而作出早期，从而作出早期诊断，早期治断，早期治疗。应用应用: 由于由于TGF-与肝与肝纤维化密切相关，采用化密切相关，采用TGF-抗抗体和反体和反义基因治基因治疗、预防和延防和延缓器官器官纤维化已取化已取得了一定得了一定进展展 , 临床意床
24、意义重大。重大。2) TNF- : TNF- : HSC增殖与增殖与激活促进促进3) 白细胞介素白细胞介素(IL-1, 2, 6)主要由单核巨嗜细胞主要由单核巨嗜细胞IL-1促进促进产生产生HSC合成合成 collagen病毒性肝炎病毒性肝炎IL-6促进促进产生产生HSC增殖增殖SEC, KC, 单核巨嗜细胞单核巨嗜细胞抑制抑制胶原酶活性胶原酶活性4) PDGF: 强效丝裂原强效丝裂原, 趋化因子趋化因子, 与发育与发育, 修复修复, 愈合有关愈合有关.血小板血小板, 单核细胞单核细胞, SEC, KC, HSC释放释放PDGF- AA, BB, AB结合结合PDGFR在在肝肝纤维化化中中:酪
25、氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶 RAS/ERK 途径途径PI3K途径途径HSC增殖增殖 TIMP-1,TIMP-1,抑制胶抑制胶原酶的作用原酶的作用 上调上调 5) 干扰素干扰素 (IFN) : 唯一确切有唯一确切有抗抗肝纤维化的细胞因子 (抑制type I, III collagen的合成与分泌)5. 肝纤维化治疗消除病因消除病因 (肝炎肝炎, 药物药物, 酒精酒精, 自身免疫疾病自身免疫疾病)为最有效的措施为最有效的措施消除病因消除病因 (肝炎肝炎, 药物药物)肝纤维化collagen氮杂环丁烷乙羧酸氮杂环丁烷乙羧酸抑制合成抑制合成腺嘌呤核苷腺嘌呤核苷胶原酶活性胶原酶活性促进促进HSC激活PDGF/TGF- 抗体抗体抑制抑制
