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1、铜绿假单胞菌的分离及鉴定铜绿假单胞菌的分离及鉴定组员：张冲组员：张冲 郭泽郭泽 王平王平铜绿假单胞菌实验目的n了解铜绿假单胞菌的微生物学特性了解铜绿假单胞菌的微生物学特性n掌握微生物实验技术基本原理及操作掌握微生物实验技术基本原理及操作n熟悉铜绿假单胞菌的分离鉴定程序及熟悉铜绿假单胞菌的分离鉴定程序及 方法方法概述 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌惯称绿脓杆菌，为革兰惯称绿脓杆菌，为革兰氏阴性杆菌，属假单胞菌属。它在自然界氏阴性杆菌，属假单胞菌属。它在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力比
2、其他菌强，抗干燥的能力也强。比其他菌强，抗干燥的能力也强。生物学特性n 形态：形态：革兰氏阴性杆革兰氏阴性杆菌菌，菌体菌体长短不一长短不一 ；单端单鞭单端单鞭毛毛；动力动力阳性；阳性；无芽胞无芽胞。n特性：专性需氧特性：专性需氧；生长生长温度范围是温度范围是2542， 最适生长温度最适生长温度35，4不生长。不生长。生物学特性n抗原抗原性性: :O O抗原抗原 H H抗原抗原粘液抗原粘液抗原R R抗原抗原菌毛抗原菌毛抗原n产生荧光素和水溶性的绿脓素，培养物呈蓝产生荧光素和水溶性的绿脓素，培养物呈蓝绿色。绿色。生物学特性n在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属光
3、泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜味；光泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜味；n在在普通平板、普通平板、血平板、麦康凯平板上可形血平板、麦康凯平板上可形成成5 5种不同形态的菌落种不同形态的菌落典型型典型型粘液型粘液型侏儒型侏儒型粗糙型粗糙型大肠菌样型大肠菌样型生物学特性n菌落呈灰绿色菌落呈灰绿色，大小大小 不一不一, ,扁平湿润扁平湿润，边缘边缘不规则呈伞状伸展不规则呈伞状伸展，表表面常可见金属光泽面常可见金属光泽。典型型（麦康凯平板）典型型（麦康凯平板）生物学特性n产绿脓素产绿脓素琼脂染成黄绿色琼脂染成黄绿色典型型（普通平板）典型型（普通平板）生物学特性n菌落光滑凸起菌落光滑凸起 成粘液状
4、成粘液状粘液型（血平板）粘液型（血平板）粘液型（麦康凯平板）粘液型（麦康凯平板）生物学特性n菌落中央凸起菌落中央凸起 边缘扁平边缘扁平 表面粗糙表面粗糙粗糙型粗糙型（麦康凯平板）（麦康凯平板）生物学特性n菌落圆形凸起菌落圆形凸起 似大肠埃希菌菌落似大肠埃希菌菌落大肠型（麦康凯平板）大肠型（麦康凯平板）n细小，无光泽细小，无光泽 半透明菌落半透明菌落侏儒型（麦康凯平板）侏儒型（麦康凯平板）生化特性n 氧化酶：氧化酶：+ +n 葡萄糖的氧化（葡萄糖的氧化（O/FO/F）：）：O On 枸橼酸盐利用：枸橼酸盐利用：+ +n 精氨酸双水解：精氨酸双水解：+ +n 明胶液化：明胶液化：+ +n 硝酸盐还
5、原：硝酸盐还原：+ +n 乙酰胺酶：乙酰胺酶：+ + n 吲哚试验：吲哚试验：- -微生物学检验脓液脓液 痰痰 尿液等尿液等直接涂片、革兰染色、镜检直接涂片、革兰染色、镜检分离培养分离培养（血平板、麦康凯）（血平板、麦康凯）18-24h35可疑菌落（金属光泽、可疑菌落（金属光泽、-溶血、产绿色素、特殊气味）溶血、产绿色素、特殊气味）初步鉴定初步鉴定最终鉴定最终鉴定色素色素鉴定鉴定生化生化反应反应42生长生长分型分型 （血清学（血清学 噬菌体）噬菌体）革兰阴性革兰阴性杆菌，氧杆菌，氧化酶阳性化酶阳性菌落特征菌落特征气味气味绿脓素绿脓素报告报告检验程序药敏试验药敏试验试验材料n病料病料：痰液标本：
6、痰液标本n试剂试剂：氧化酶纸片：氧化酶纸片，明胶，明胶、革兰染色液、革兰染色液、药敏药敏纸片、纸片、无菌生理盐水及生化管配套试剂无菌生理盐水及生化管配套试剂等等 n培养基培养基：普通平板、普通平板、血平板、血平板、麦康凯麦康凯平板、半平板、半 固体培养基、非发酵菌微量生化管等固体培养基、非发酵菌微量生化管等n其它其它 ：显微镜、培养箱、小试管、载玻片、：显微镜、培养箱、小试管、载玻片、 接种针、接种环、酒精灯、火柴、接种针、接种环、酒精灯、火柴、平皿平皿等等分离培养n标本采集标本采集：脓液、浓痰（无菌拭子）：脓液、浓痰（无菌拭子）n痰液标本的前处理痰液标本的前处理加入等量的加入等量的PH 7.
7、6 的的1% 胰酶溶液，放置胰酶溶液，放置35、90 min使痰液均质化使痰液均质化。n直接涂片，直接涂片，革兰氏革兰氏染色染色，镜检镜检n分别分别接种接种普通普通平板平板、血平板血平板和麦康凯和麦康凯平板平板，培培养养1824h ，进一步进行鉴定。进一步进行鉴定。初步鉴定n选出可疑菌落选出可疑菌落 金属光泽、金属光泽、-溶血、产绿色素、特殊气味溶血、产绿色素、特殊气味等等n初步鉴定初步鉴定染色镜检染色镜检：取可疑菌落，进行革兰氏染色、镜检。：取可疑菌落，进行革兰氏染色、镜检。氧化酶试验氧化酶试验：挑取可疑菌落于滤纸片上，滴加一：挑取可疑菌落于滤纸片上，滴加一滴新配制的滴新配制的5%二甲基对苯
8、二胺试剂，二甲基对苯二胺试剂，15-30min内，内，出现出现红色至紫红色红色至紫红色，为，为阳性阳性；若不变色，为阴性。；若不变色，为阴性。绿脓菌素试验绿脓菌素试验：选取可疑菌落：选取可疑菌落2-32-3个，置于绿脓菌个，置于绿脓菌素测定用培养基，于素测定用培养基，于3737培养培养24h24h，加入氯仿、色素，加入氯仿、色素后，再加入盐酸后，再加入盐酸 ，上层稀盐酸液内出现，上层稀盐酸液内出现红色为阳性红色为阳性，表示菌落中含有绿脓菌素。表示菌落中含有绿脓菌素。初步鉴定最终鉴定n明胶液化试验：明胶液化试验：选取可疑菌落的纯培养物，穿刺选取可疑菌落的纯培养物，穿刺接种于明胶培养基内，接种于明
9、胶培养基内，3737培养培养24h24h，取出后放入冰，取出后放入冰箱箱10-30min10-30min，如若溶解，如若溶解，即试验呈即试验呈阳性阳性；如凝固不；如凝固不溶，试验呈阴性。溶，试验呈阴性。n硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验：选取可疑菌落的纯培养物，接：选取可疑菌落的纯培养物，接种于硝酸盐培养基，置于种于硝酸盐培养基，置于3737培养培养24h24h，如若培养基，如若培养基中的小倒管内中的小倒管内有气体，有气体，试验呈试验呈阳性阳性。最终鉴定n吲哚试验吲哚试验：选取可疑菌落的纯培养物：选取可疑菌落的纯培养物接种于蛋白胨接种于蛋白胨水水，培养培养8h-24h8h-24h后，加后，加Kov
10、acsKovacs（靛基质靛基质）试剂约试剂约3 3mmmm高高，如若如若在液层界面发生在液层界面发生红色红色，即为，即为阳性阳性反应反应。n4242生长试验生长试验：选取纯被检物，接种于普通琼脂斜：选取纯被检物，接种于普通琼脂斜面培养基上，于面培养基上，于4242培养培养4h4h，铜绿假单胞菌能，铜绿假单胞菌能生长为生长为阳性阳性反应。反应。血清学鉴定n血清群鉴定：血清群鉴定：取洁净玻片，滴加多价取洁净玻片，滴加多价O血清于玻片，血清于玻片，再接种此菌的纯培养物少许混匀，再接种此菌的纯培养物少许混匀，2min观察凝集现象，观察凝集现象，鉴定。鉴定。n血清学分型：血清学分型：按血清分型试剂盒操
11、作说明进行操作：按血清分型试剂盒操作说明进行操作：将待检测菌在将待检测菌在LB琼脂培养基中过夜培养，取少许与琼脂培养基中过夜培养，取少许与30L阳性血清混合，一分钟观察结果。阳性血清混合，一分钟观察结果。n判定标准：判定标准：有凝集块出现，且生理盐水空白对照组有凝集块出现，且生理盐水空白对照组不凝集者为阳性。不凝集者为阳性。药敏试验n扩散法（扩散法（K-BK-B法）法）选用抗菌药物，对分离的细菌进行敏感性试验选用抗菌药物，对分离的细菌进行敏感性试验：药敏片药敏片：庆大霉素、环丙沙星、头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、环丙沙星、头孢噻肟、链霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、头孢哌酮、青霉素恩诺沙星、诺氟沙星、头孢哌酮、青霉素；根据抑菌圈的大小判断病原菌对药物的敏感程度。根据抑菌圈的大小判断病原菌对药物的敏感程度。
