微生物学第5章生长与繁殖

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1、微生物学第5章生长与繁殖Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望 第第 一一 节节 微生物的微生物的个体与个体与 群体生长和繁殖群体生长和繁殖 Microbial Growth and Reproduction 微生物的生长与繁殖微生物的生长与繁殖微生物生微生物生长(Growth)：是指：是指细胞物胞物质有有规律地、不可逆增加的生物律地、不可逆增加的生物过程。程。 微生物繁殖微生物繁殖(Reproduction)：是微生物：是微生物生生长到一定到一定阶段由于段由于细胞内各种胞

2、内各种细胞胞结构的复构的复杂和重建和重建导致致产生新的生命个体，生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的整个生物学即引起生命个体数量增加的整个生物学过程。程。微生物的个体生微生物的个体生长和群体生和群体生长个体生个体生长：一个微生物个体：一个微生物个体应具具备生生长和繁殖的和繁殖的全能性。全能性。单细胞微生物如胞微生物如细菌、酵母菌等，一个菌、酵母菌等，一个细胞就是一个个体。胞就是一个个体。单细胞微生物的生胞微生物的生长即使即使细胞的增大胞的增大.在在适适宜宜的的环境境中中，一一种种微微生生物物如如大大肠杆杆菌菌（E.coli），从从一一个个个个体体（细胞胞）出出发，通通过生生长与与繁繁殖殖，

3、逐逐渐形形成成细胞胞总生生物物质量量(biomass)与与数数量量相相应增增加加的的群群体体，这种种现象象与与过程程称称为群群体体生生长。群群体体生生长是是微微生生物物个个体体生生长与与个个体体繁繁殖殖持持续交交替替进行行所所导致致的的结果果。因因此此，群群体体生生长是是以微生物的个体生以微生物的个体生长与繁殖与繁殖为基基础的的。微生物的群体生微生物的群体生长规律律 对微微生生物物群群体体生生长的的研研究究表表明明，微微生生物物的的群群体体生生长规律律因因其其种种类不不同同而而异异，单细胞胞微微生生物物与与多多细胞胞微微生生物物的的群群体体生生长表表现出出不不同同的的生生长动力力学学特特性性。

4、但但就就单细胞胞微微生生物物来来说，在在特特定定的的环境境中中，不不同同种种的的微微生生物物表表现出出趋势相相近近的的生生长动力学力学规律。律。（一）（一）、细菌纯培养生长曲线细菌纯培养生长曲线是将某种是将某种单细胞微生物少量接种到恒定容胞微生物少量接种到恒定容积的液体培养的液体培养基中培养，定基中培养，定时取取样分析。以菌数的分析。以菌数的对数数为纵坐坐标，生，生长时间为横坐横坐标作作图,可得到一条定量描述液体培养基可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线（ growth curve)。生长曲线表现了细菌细胞

5、及其群体在新的适宜的理化环生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。生长境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。生长曲线各个时期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所曲线各个时期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。深入研究各种单细胞微生物生作用与制约的动态变化。深入研究各种单细胞微生物生长曲线各个时期的特点与内在机制，在微生物学理论与长曲线各个时期的特点与内在机制，在微生物学理论与应用实践上都有着十分重大的意义。应用实践上都有

6、着十分重大的意义。 细菌纯培养生长曲线图细菌纯培养生长曲线图细菌生菌生长曲曲线的分期的分期滞留适滞留适应期期(延迟期延迟期 ) 对数生数生长期期 稳定期定期 衰亡期衰亡期1.1.滞留适应期滞留适应期（Lag phase）特点：特点： 1 1）细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓）细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长期末，细胞的平均长度比刚接种时长6 6倍。一般来说处倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；于迟缓期的细菌细胞体积最大；2 2）细胞内）细胞内RNARNA，尤其是，尤其是rRNArRNA含量增高，合成代谢活跃，含量增高，合成代谢活跃，

7、核糖体、酶类和核糖体、酶类和ATPATP的合成加快，易产生诱导酶。的合成加快，易产生诱导酶。3 3） 对外界不良条件反应敏感。对外界不良条件反应敏感。这一时期的细胞，正处于对新的理化环境的适应期，正在这一时期的细胞，正处于对新的理化环境的适应期，正在为下一阶段的快速生长与繁殖做生理与物质上的准备。为下一阶段的快速生长与繁殖做生理与物质上的准备。在这个时期的后阶段，菌体细胞逐步进入生理活跃期，在这个时期的后阶段，菌体细胞逐步进入生理活跃期，少数菌体开始分裂，曲线出现上升趋势。少数菌体开始分裂，曲线出现上升趋势。 延滞期所维持时间的长短，因微生物种或菌株和培养条件的不同而异，实践已知延滞期可从几分

8、钟到几小时、几天，甚至几个月不等；如大肠杆菌的延滞期就比分枝杆菌短得多。同一种或菌株，接种用的纯培养物所处的生长发育时期不同，延滞期的长短也不一样。如接种用的菌种都处于生理活跃时期，接种量适当加大，营养和环境条件适宜，延滞期将显著缩短，甚至直接进入对数生长期。 在微生物发酵工业中，如果有较长的延迟期，则会导致发酵设备的利用率降低、能水耗增加、产品生产成本上升，最终造成劳动生产力低下与经济效益下降。只有缩短延滞期才有可能缩短发酵周期，提高经济效益。因此深入了解延滞期的形成机制，可为缩短或延长延滞期提供指导实践的理论基础，这对于工业、农业、医学、环境微生物学及其应用等均有极为重要的意义。因此，在微

9、生物应用实践中，通常可采取用处于快速生长繁殖中的健壮菌种细胞接种、适当增加接种量、采用营养丰富的培养基、培养种子与下一步培养用的两种培养基的营养养成分以及培养的其它理化条件尽可能保持一致等措施，可以有效地缩短延滞期。 2.对数期对数期（Log phase）单细胞微生物的纯培养物在被接种到新鲜培养基后，单细胞微生物的纯培养物在被接种到新鲜培养基后，经过一段时间的适应，即进入生长速度相对恒定的快经过一段时间的适应，即进入生长速度相对恒定的快速生长与繁殖期，处于这一时期的单细胞微生物，其速生长与繁殖期，处于这一时期的单细胞微生物，其细胞呈几何级数增长，细胞呈几何级数增长，2 2 n n ；这里的指数

10、；这里的指数“ n n ”则则为细胞分裂的次数或增殖的代数。这一细胞增长以指为细胞分裂的次数或增殖的代数。这一细胞增长以指数式进行的快速生长繁殖期称为指数期，也称对数期数式进行的快速生长繁殖期称为指数期，也称对数期 （ logarithmic phase logarithmic phase ） 特点特点 1 1）代时最短，生长速度最快；）代时最短，生长速度最快； 2 2）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例生长，菌体成分均匀；生长，菌体成分均匀； 3 3）酶活性高，代谢稳定，菌体大小基本一致。）酶活性高，代谢稳定，菌体大小基本一致。处于对数生长

11、期的细胞，由于代谢旺盛，生长处于对数生长期的细胞，由于代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，个体形态、化学组成和生理迅速，代时稳定，个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，常用对数期的菌体作种子，它可以缩短延迟期，常用对数期的菌体作种子，它可以缩短延迟期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。益。对数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与对数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特性的极好材料。遗传调控等生物学基本特性的极好材料。 3.稳定期稳定期（Stationary p

12、hase）制约对数生长的主要因素有：制约对数生长的主要因素有： 培养基中必要营养成分的耗尽或其浓度不能满足维持指数生培养基中必要营养成分的耗尽或其浓度不能满足维持指数生长的需要而成为生长限制因子（长的需要而成为生长限制因子（ growth-limited factor growth-limited factor 细胞的排出物在培养基中的大量积累，以致抑制菌体生长细胞的排出物在培养基中的大量积累，以致抑制菌体生长 由上述两方面主要因素所造成的细胞内外理化环境的改变，由上述两方面主要因素所造成的细胞内外理化环境的改变，如营养物比例的失调、如营养物比例的失调、 pH pH 、氧化还原电位的变化等。、

13、氧化还原电位的变化等。虽然这些因素不一定同时出现，但只要其中一个因素存在，细胞虽然这些因素不一定同时出现，但只要其中一个因素存在，细胞生长速率就会降低，这些影响生长因子的综合作用，致使群体生长速率就会降低，这些影响生长因子的综合作用，致使群体生长逐渐进入新增细胞与逐步衰老死亡细胞在数量上趋于相对生长逐渐进入新增细胞与逐步衰老死亡细胞在数量上趋于相对平衡状态，这就是群体生长的稳定期平衡状态，这就是群体生长的稳定期. .特点：特点： 1）生）生长速度速度为零，新生零，新生=死亡，达到死亡，达到动态平衡；平衡； 2）活菌数的）活菌数的总量达到最大量达到最大值； 3）胞内的）胞内的储藏物开始形成（如肝

14、糖粒、脂肪粒等）；藏物开始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）； 4）某些芽）某些芽孢菌的芽菌的芽孢开始形成；开始形成； 5）某些）某些细菌菌过量量积累次累次级代代谢产物，如抗生素、物，如抗生素、维生素等。生素等。稳定生长期时活菌数达到最高水平，如果为了获得大量活菌体，稳定生长期时活菌数达到最高水平，如果为了获得大量活菌体，就应在此阶段收获。在稳定期，代谢产物的积累开始增多，逐就应在此阶段收获。在稳定期，代谢产物的积累开始增多，逐渐趋向高峰。某些产抗生素的微生物，在稳定期后期时大量形渐趋向高峰。某些产抗生素的微生物，在稳定期后期时大量形成抗生素。成抗生素。稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关。生产上常常

15、通过补料，稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关。生产上常常通过补料，调节调节 pH ，调整温度等措施来延长稳定生长期，以积累更多的，调整温度等措施来延长稳定生长期，以积累更多的代谢产物。代谢产物。 一个达到稳定生长期的微生物群体，由于生长环境的继续一个达到稳定生长期的微生物群体，由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率逐渐上升，恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率逐渐上升，以致死亡菌数逐渐超过新生菌数，以致死亡菌数逐渐超过新生菌数， 群体中活菌数下降，群体中活菌数下降，曲线下滑。曲线下滑。衰亡期特点：衰亡期特点：1 1）细菌代谢活性降低；）细菌代谢活性降低；2 2）细菌衰老并

16、出现自溶；）细菌衰老并出现自溶；3 3）许多胞内的代谢产物和胞内酶向外释放等许多胞内的代谢产物和胞内酶向外释放等, ,如氨基酸、如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。转化酶、外肽酶或抗生素等。4 4）菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小）菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应 . .4.衰亡期衰亡期（Death phase）微生物的生长曲线，反映一种微生物在一微生物的生长曲线，反映一种微生物在一定的生活环境中定的生活环境中 ( ( 如试管、摇瓶、发酵如试管、摇瓶、发酵罐罐 ) ) 生长繁

17、殖和死亡的规律。它既可作生长繁殖和死亡的规律。它既可作为营养物和环境因素对生长繁殖影响的理为营养物和环境因素对生长繁殖影响的理论研究指标，也可用为调控微生物生长代论研究指标，也可用为调控微生物生长代谢的依据，以指导微生物生产实践。谢的依据，以指导微生物生产实践。 根据发酵目的的不同，确定在微生物发酵根据发酵目的的不同，确定在微生物发酵的不同时期进行收获。微生物生长曲线可的不同时期进行收获。微生物生长曲线可以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得最大的经济效益。优化以获得最大的经济效益。 第二节第二节微生物的培养与生长量测定微生物的培养与生长量测定一、微

18、生物纯培养技术一、微生物纯培养技术纯培养培养(Pure culture)：微生物学中将：微生物学中将在在实验室条件下从一个室条件下从一个细胞或一种胞或一种细胞群繁胞群繁殖得到的后代称殖得到的后代称为纯培养培养。纯培养技术包括两个基本步骤：纯培养技术包括两个基本步骤： 从自然从自然环境中分离培养对象。环境中分离培养对象。 在以培养对象为在以培养对象为唯一生物种类的隔离环境中培养、增殖，获唯一生物种类的隔离环境中培养、增殖，获得这一生物种类的细胞群体。得这一生物种类的细胞群体。针对不同微生物的特点，有许多分离方法。针对不同微生物的特点，有许多分离方法。应用最广的是平板法分离纯培养。应用最广的是平板

19、法分离纯培养。 获得得纯培养的技培养的技术稀稀释平板分离法平板分离法 平皿划平皿划线分离法分离法 单细胞挑取法胞挑取法 利用利用选择性培养基分离法性培养基分离法 富集培养富集培养 二元培养：是二元培养：是纯培养的一种特殊形式，培养的一种特殊形式，主要用于分离寄生微生物的方法。主要用于分离寄生微生物的方法。 富集培养富集培养有些微生物在自然界中生存着，但分离有些微生物在自然界中生存着，但分离和获得纯培养却十分困难，有些甚至至和获得纯培养却十分困难，有些甚至至今没有成功过。对于这些微生物采取富今没有成功过。对于这些微生物采取富集培养的方法，作为纯培养的前处理，集培养的方法，作为纯培养的前处理，或者

20、直接以富集培养物为研究材料。或者直接以富集培养物为研究材料。 富集培养用作为取得纯培养的前处理，富集培养用作为取得纯培养的前处理，使特定的微生物种类在数量上占绝对优使特定的微生物种类在数量上占绝对优势，然后稀释培养在适宜平板培养基上，势，然后稀释培养在适宜平板培养基上，长出的单菌落多数是预期要分离的特定长出的单菌落多数是预期要分离的特定种类。种类。 二元培养二元培养二元培养是纯培养的一种特殊形式。有些寄生微生二元培养是纯培养的一种特殊形式。有些寄生微生物只能在寄主微生物体内寄生，必需将寄生微生物物只能在寄主微生物体内寄生，必需将寄生微生物和寄主微生物培养在和寄主微生物培养在起，同时排除其他杂菌

21、。例起，同时排除其他杂菌。例如噬菌体只能在特定的寄主微生物体内繁殖。首先如噬菌体只能在特定的寄主微生物体内繁殖。首先在平板培养基中繁殖寄主微生物的纯培养在平板培养基中繁殖寄主微生物的纯培养 ( 称为细称为细菌坪菌坪 ) ，再将含噬菌体的稀释液接种在细菌坪上，再将含噬菌体的稀释液接种在细菌坪上，经过培养，在细菌坪上出现许多独立的噬菌斑，反经过培养，在细菌坪上出现许多独立的噬菌斑，反复纯化，得到纯的二元培养体即只有一种寄主细菌复纯化，得到纯的二元培养体即只有一种寄主细菌和一种噬菌体的和一种噬菌体的“纯培养纯培养”。 二、分批培养与二、分批培养与连续培养培养（一）分批培养（一）分批培养 在在一一个个

22、相相对独独立立密密闭的的系系统中中，一一次次性性投投入入培培养养基基对微微生生物物进行接种培养的方式一般称行接种培养的方式一般称为分批培养分批培养(batch culture)。如如在在微微生生物物研研究究中中用用烧瓶瓶作作为培培养养容容器器进行行的的微微生生物物培培养养一一般般是是分分批批培培养养。采采用用分分批批培培养养方方式式时，随随着着培培养养时间的的延延长，由由于于系系统相相对密密闭性性，被被微微生生物物消消耗耗的的营养养物物得得不不到到及及时地地补充充，代代谢产物物未未能能及及时排排出出培培养养系系统，其其它它对微微生生物物生生长有有抑抑制制作作用用的的环境境条条件件得得不不到到及

23、及时改改善善，使使微微生生物物细胞胞生生长繁繁殖殖所所需需的的营养养条条件件与与外外部部环境境逐逐步步恶化化，从从而而使使微微生生物物群群体体生生长表表现出出从从细胞胞对新新环境境的的适适应到到逐逐步步进入入快快速速生生长，而而后后较快快转入入稳定定期期，最最后后走走向衰亡的向衰亡的阶段分明的群体生段分明的群体生长过程。程。 分分批批培培养养由由于于它它的的相相对对简简单单与与操操作作方方便便，在在微微生生物物学学研研究究与与发发酵酵工业生产实践中仍被较为广泛采用。工业生产实践中仍被较为广泛采用。 （二）、连续培养（二）、连续培养连续培养（连续培养（ continuous culture co

24、ntinuous culture ）是相对于分批培养）是相对于分批培养而言的。而言的。连续培养是指在深入研究分批培养中生长曲线形成的内连续培养是指在深入研究分批培养中生长曲线形成的内在机制的基础上，开放培养系统，不断补充营养液、解在机制的基础上，开放培养系统，不断补充营养液、解除抑制因子、优化生长代谢环境的培养方式。除抑制因子、优化生长代谢环境的培养方式。连续培养的显著特点与优势是，它可以根据研究者的目连续培养的显著特点与优势是，它可以根据研究者的目的，在一定程度上，人为控制典型生长曲线中的某个时的，在一定程度上，人为控制典型生长曲线中的某个时期，使之缩短或延长时间，使某个时期的细胞加速或降期

25、，使之缩短或延长时间，使某个时期的细胞加速或降低代谢速率，从而大大提高培养过程的人为可控性和效低代谢速率，从而大大提高培养过程的人为可控性和效率。率。 连续培养方式培养方式恒恒浊器法器法(Turbidostat)： 恒浊法是以培养器中微生物细胞的密度为监控对象，用恒浊法是以培养器中微生物细胞的密度为监控对象，用光电控制系统来控制流入培养器的新鲜培养液的流速，光电控制系统来控制流入培养器的新鲜培养液的流速，同时使培养器中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基同时使培养器中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基本恒定的流速流出，从而使培养器中的微生物在保持细本恒定的流速流出，从而使培养器中的微生物在保持细

26、胞密度基本恒定的条件下进行培养的一种连续培养方式。胞密度基本恒定的条件下进行培养的一种连续培养方式。用恒浊法连续培养微生物，可控制微生物在最高生长速用恒浊法连续培养微生物，可控制微生物在最高生长速率与最高细胞密度的水平上生长繁殖，达到高效率培养率与最高细胞密度的水平上生长繁殖，达到高效率培养的目的。目前在发酵工业上有多种微生物菌体的生产就的目的。目前在发酵工业上有多种微生物菌体的生产就是根据这一原理是根据这一原理 恒化器法恒化器法(Chemostat)： 指控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营指控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物质及时得到补充，培养基中营养物浓度基本养物质及时得到

27、补充，培养基中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率。恒定，从而保持细菌的恒定生长速率。恒化连续培养往往控制微生物在低于最高生长速恒化连续培养往往控制微生物在低于最高生长速率的条件下生长繁殖。恒化连续培养在研究微生率的条件下生长繁殖。恒化连续培养在研究微生物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。因此，它是微生物营养、生长、繁殖、代谢和基因此，它是微生物营养、生长、繁殖、代谢和基因表达与调控等基础与应用基础研究的重要技术因表达与调控等基础与应用基础研究的重要技术手段。手段。 补料分批培养或半连续培养补料分批培养或半连续培养 无论是基础研究还

28、是在发酵工业生产实践中，为了达到无论是基础研究还是在发酵工业生产实践中，为了达到某种特殊目的或提高培养效率，常常采取两种方法加以综某种特殊目的或提高培养效率，常常采取两种方法加以综合的培养方式。既不是严格意义的分批培养方式，也不是合的培养方式。既不是严格意义的分批培养方式，也不是严格意义的连续培养方式，一般称之为补料分批培养或半严格意义的连续培养方式，一般称之为补料分批培养或半连续培养连续培养 。 如在金霉素、四环素等抗生素发酵生产中，在细胞群体如在金霉素、四环素等抗生素发酵生产中，在细胞群体生长进入稳定期，抗生素开始大量合成时进行补料，适当生长进入稳定期，抗生素开始大量合成时进行补料，适当增

29、加发酵液中合成四环类抗生素的底物量和维持细胞生存增加发酵液中合成四环类抗生素的底物量和维持细胞生存所需要的低微浓度的营养物，使细胞在非生长繁殖状态下所需要的低微浓度的营养物，使细胞在非生长繁殖状态下合成抗生素的持续时间延长，从而达到提高单位发酵液中合成抗生素的持续时间延长，从而达到提高单位发酵液中抗生素总量（效价）之目的。抗生素总量（效价）之目的。半连续发酵方式在当代发酵工业上应用最为广泛。半连续发酵方式在当代发酵工业上应用最为广泛。 分批培养与分批培养与连续培养的比培养的比较1 1） 缩短发酵周期，提高设备利用率；缩短发酵周期，提高设备利用率；2 2） 便于自动控制；便于自动控制；3 3）

30、降低动力消耗及体力劳动强度；降低动力消耗及体力劳动强度；4 4） 产品质量较稳定；产品质量较稳定； 三、同步培养三、同步培养通通过机械方法和机械方法和调控培养条件使某一群体中的所有微生控培养条件使某一群体中的所有微生物个体物个体细胞尽可能胞尽可能处于同一生于同一生长和分裂周期中，从而使和分裂周期中，从而使细胞群体中各个体胞群体中各个体处于分裂步于分裂步调一致的生一致的生长状状态，这种种生生长状状态称称为同步生同步生长(synchronous growth) (synchronous growth) 。 获得微生物同步生得微生物同步生长的方法的方法主要有以下两主要有以下两类： 机械机械筛选法。法

31、。这一方法是利用一方法是利用处于同一生于同一生长阶段段细胞的体胞的体积与大小的同一性，用与大小的同一性，用过滤、密度梯度离心或、密度梯度离心或膜洗脱等方法收集同步生膜洗脱等方法收集同步生长的的细胞。胞。 诱导法。法。这一方法是用理化条件（一方法是用理化条件（药物、物、营养物、养物、温度、光照等）人温度、光照等）人为诱导控制微生物控制微生物细胞群体胞群体处于某于某同一生同一生长发育育阶段，以段，以获得同步生得同步生长细胞。胞。 四、微生物生长量的测定四、微生物生长量的测定1.直接直接计数法（全数法）：数法（全数法）： 2.间接接计数法（活菌数法（活菌计数法）数法） 3.测定定细胞物胞物质量量 1

32、.1.直接计数法（全数法）直接计数法（全数法）计数器数器计数法：数法： l 血球血球计数板数板 l 细菌菌计数板数板 涂片染色涂片染色计数法数法 比比浊法法：这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的单细胞微生物，其细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，的单细胞微生物，其细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度 ( 或透光度或透光度 ) 或浊度可或浊度可以反映细胞的浓度。以反映细胞的浓度。 此法比较简便，但使用有局限性

33、。菌悬液颜色不宜太深，不能混杂其他物质，此法比较简便，但使用有局限性。菌悬液颜色不宜太深，不能混杂其他物质，否则不能获得正确结果。一般在用此法测定细胞浓度时，应先用计数法作对否则不能获得正确结果。一般在用此法测定细胞浓度时，应先用计数法作对应计数，取得经验数据，并制作菌数对应计数，取得经验数据，并制作菌数对 OD 值的标准曲线方便查获菌数值。值的标准曲线方便查获菌数值。 2. .间接计数法（活菌计数法间接计数法（活菌计数法）平板菌落平板菌落计数法数法： 液体稀液体稀释培养培养测数（数（Most Probable Number method ,MPN法）法）：取定量（取定量（ 1mL 1mL ）

34、的单细胞微生物悬液，）的单细胞微生物悬液，用培养液作定量用培养液作定量 10 10 倍系列稀释，重复倍系列稀释，重复 35 35 次，将不同稀释度的系列稀释次，将不同稀释度的系列稀释管置适宜温度下培养。在稀释度合适的前提下，在菌浓度相对较高的稀释管置适宜温度下培养。在稀释度合适的前提下，在菌浓度相对较高的稀释管内均出现菌生长，而自某个稀释度较高的稀释管开始至稀释度更高的稀管内均出现菌生长，而自某个稀释度较高的稀释管开始至稀释度更高的稀释管中均不出现菌生长，按稀释度自低到高的顺序，把最后三个稀释度相释管中均不出现菌生长，按稀释度自低到高的顺序，把最后三个稀释度相对较高的、出现菌生长的稀释管之稀释

35、度称为临界级数。由对较高的、出现菌生长的稀释管之稀释度称为临界级数。由 3 3 至至 5 5 次重次重复的连续三级临界级数获得指数，查相应重复的最大或然数复的连续三级临界级数获得指数，查相应重复的最大或然数 ( ( 即即 most most probable number probable number ， MPN) MPN) 表求得最大可能数，再乘以出现生长的临界级表求得最大可能数，再乘以出现生长的临界级数的最低稀释度，即可测得比较可靠的样品活菌浓度。数的最低稀释度，即可测得比较可靠的样品活菌浓度。 薄膜薄膜过滤计数法数法：3.3.测定细胞物质量测定细胞物质量干重法干重法 含氮量含氮量测定法

36、定法 DNA测定法定法 其他生理指其他生理指标测定法：定法： l 物物质的消耗的消耗 l 产生量生量 l 对氧的吸收氧的吸收 l 发酵糖酵糖产酸量酸量 l 二氧化碳的二氧化碳的释放量等放量等第第 三三 节节微生物的生长与环境微生物的生长与环境Microbial growth and Environment 一一 些些 基基 本本 术术 语语化化疗(Chemotherapy) 灭菌菌(Sterilization) 抑制抑制(Inhibition) 死亡死亡(Death) 防腐防腐(Antisepsis) 消毒消毒(Dis-infection) 化疗化疗(chemotherapy) 是指利用具有是

37、指利用具有选择性的化学物性的化学物质如磺胺、如磺胺、抗生素等抗生素等对生物体内部被微生物感染的生物体内部被微生物感染的组织或病或病变细胞胞进行治行治疗，以，以杀死死组织内的病原微生物或病内的病原微生物或病变细胞，但胞，但对机体机体本身无毒害作用的治本身无毒害作用的治疗措施措施。 灭菌灭菌（sterilization) 是指利用某种是指利用某种杀死物体中包括芽死物体中包括芽孢在在内的所有微生物的一种措施内的所有微生物的一种措施. 抑制抑制(inhibition) 是在是在亚致死致死剂量因子作用下量因子作用下导致微生致微生物生物生长的停止，但在移去的停止，但在移去这种因子后生种因子后生长仍可以恢复

38、的生物学仍可以恢复的生物学现象。象。 死亡死亡(death) 是在致死是在致死剂量因子或量因子或亚致死致死剂量因子量因子长时间作用下，作用下，导致微生物生致微生物生长能力不能力不可逆可逆丧失，即使失，即使这种因子移去后生种因子移去后生长仍仍不能恢复的生物学不能恢复的生物学现象。象。 防腐防腐（antisepsis) 是在某些化学物是在某些化学物质或物理因子作用下，或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生能防止或抑制微生物生长的一种措施，的一种措施，它能防止食品腐它能防止食品腐败或防止其它物或防止其它物质霉霉变。 消毒消毒（disinfection) 是利用某种方法是利用某种方法杀死或死或灭活物活

39、物质或物或物质中所有病原微生物的一种措施中所有病原微生物的一种措施,它可以起它可以起到防止感染或到防止感染或传播的作用播的作用.一、温度一、温度最低生最低生长温度温度: 指微生物能指微生物能进行繁殖的最低温度界限。行繁殖的最低温度界限。 最适生最适生长温度：温度： 指使微生物达到最大生指使微生物达到最大生长速度的温度速度的温度 。 最高生最高生长温度：温度： 指微生物能生指微生物能生长繁殖的最高温度界限。繁殖的最高温度界限。 致死温度：致死温度： 是指能使是指能使 微生物死亡的最低温度界限。微生物死亡的最低温度界限。 致死致死时间： 在一定温度下在一定温度下杀死微生物所需要的最短死微生物所需要

40、的最短时间。各类微生物生长的温度范围各类微生物生长的温度范围 微生物微生物 类型类型 最低温度最低温度 oC 最适温度最适温度 oC 最高温度最高温度 oC 高温型高温型 30 4555 6075 中温型中温型 5 2537 4550 低温型低温型 0 1015 2030温度温度对微生物生微生物生长速率影响的速率影响的规律律 利用高温灭菌的方法利用高温灭菌的方法干干热灭菌菌 湿湿热灭菌菌 巴斯德巴斯德灭菌菌干热灭菌干热灭菌干干热灭菌法菌法：160处理理12h。适用于。适用于玻璃器皿、金属用具等耐玻璃器皿、金属用具等耐热物品的物品的灭菌。菌。优点：可保持物品的干燥点：可保持物品的干燥。灼灼热灭菌

41、法菌法：常用于金属性接种工具、：常用于金属性接种工具、污染物品及染物品及实验材料等材料等废弃物的弃物的处理。理。煮沸消毒法：煮沸消毒法：100 ，15min以上。以上。 间隙隙灭菌法：用流通蒸汽反复多次菌法：用流通蒸汽反复多次处理的理的灭菌法。菌法。巴斯德消毒法：用巴斯德消毒法：用较低的温度（如低的温度（如6263 ，30min）处理牛奶、酒理牛奶、酒类等等饮料，以料，以杀死其中的死其中的病原菌如病原菌如结核杆菌、核杆菌、伤寒杆菌等，同寒杆菌等，同时又不又不损害害营养与养与风味的方法味的方法。高高压蒸汽蒸汽灭菌法：菌法：1.05kg/cm2（15b/in）的蒸汽）的蒸汽压，121处理理1530

42、min。湿湿 热热 灭灭 菌菌巴斯德巴斯德灭菌菌即用即用较低的温度低的温度( (如用如用62626363，处理理30min30min、若以若以7171则处理理15min)15min)处理牛奶、酒理牛奶、酒类等等饮料，料，以以杀死其中的病原菌如死其中的病原菌如结核杆菌、核杆菌、伤寒杆菌等，寒杆菌等，但又不但又不损害害营养与养与风味。味。处理后的物品理后的物品应迅速迅速冷却至冷却至1010左右即可左右即可饮用。用。这种方法只能种方法只能杀死死大多数腐生菌的大多数腐生菌的营养体而养体而对芽芽孢无无损害。此法害。此法是基于是基于结核杆菌的致死温度核杆菌的致死温度为626215min15min而而规定定

43、的。的。这种消毒法系巴斯德种消毒法系巴斯德发明，故称巴斯德消明，故称巴斯德消毒法。毒法。 现不不断断提提高高灭菌菌温温度度缩短短灭菌菌时间，以以提提高高生生产效率。效率。100多多几秒几秒钟。湿热比干热灭菌更好：湿热比干热灭菌更好：1 1）更易于传递热量；）更易于传递热量；2 2）更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构；）更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构； 湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：1 1）多数细菌和真菌的营养细胞：在）多数细菌和真菌的营养细胞：在6060左右左右处理处理5-105-10分钟；分钟；2 2）酵母菌和真菌的孢子：用）酵母菌和真菌的孢子：

44、用8080以上温度处以上温度处理；理；3 3）细菌的芽孢：）细菌的芽孢：121121处理处理1515分钟以上；分钟以上； 三、三、pHpH对微生物生长的影响对微生物生长的影响 微生物的生命活动受环境酸碱度的影响较大。每种微微生物的生命活动受环境酸碱度的影响较大。每种微生物都有最适宜的生物都有最适宜的 pH pH 值和一定的值和一定的 pH pH 适应范围。适应范围。 大多数细菌、藻类和原生动物的最适宜大多数细菌、藻类和原生动物的最适宜 pH pH 为为 6.5 6.5 7.5 7.5 ，在，在 pH4.0 pH4.0 10.0 10.0 之间也能生长。之间也能生长。 放线菌一般在微碱性，放线菌

45、一般在微碱性， pH7.5 pH7.5 8.0 8.0 最适宜。最适宜。 酵母菌和霉菌在酵母菌和霉菌在 pH5 pH5 6 6 的酸性环境中较适宜，但的酸性环境中较适宜，但可生长的范围在可生长的范围在 pHl.5 pHl.5 10.0 10.0 之间。之间。 有些细菌可在很强的酸性或碱性环境中生活，例如有有些细菌可在很强的酸性或碱性环境中生活，例如有些硝化细菌则能在些硝化细菌则能在 pH11.0 pH11.0 的环境中生活，氧化硫硫杆菌的环境中生活，氧化硫硫杆菌能在能在 pHl.0 pHl.0 2.0 2.0 的环境中生活。的环境中生活。 pH 值影响微生物生长的机制主要有以下几点：值影响微生

46、物生长的机制主要有以下几点： 由于由于氢离子与离子与细胞膜上的胞膜上的酶相互作用相互作用,氢离子也离子也影响影响细胞壁中的胞壁中的酶活性活性; pH值影响培养基中有机化合物的离子化影响培养基中有机化合物的离子化,从而从而间接影响微生物接影响微生物; pH值影响影响营养物养物质的溶解度的溶解度; pH影响代影响代谢产物的物的积累累; 可利用微生物对可利用微生物对 pH pH 要求的不同，促进有益微生要求的不同，促进有益微生物的生长或控制杂菌污染。物的生长或控制杂菌污染。 湿度一般是指湿度一般是指环境空气中含水量的多少，有境空气中含水量的多少，有时也也泛指物泛指物质中所含水份的量。中所含水份的量。

47、一般的生物一般的生物细胞含水量在胞含水量在7090%。湿。湿润的物的物体表面易体表面易长微生物，微生物，这是由于湿是由于湿润的物体表面常的物体表面常有一有一层薄薄的水膜，微生物薄薄的水膜，微生物细胞胞实际上就生上就生长在在这一水膜中。一水膜中。放放线菌和霉菌基内菌菌和霉菌基内菌丝生生长在水溶液或含水量在水溶液或含水量较高的固体基高的固体基质中，气生菌中，气生菌丝则曝露于空气中，因曝露于空气中，因此，空气湿度此，空气湿度对放放线菌和霉菌等微生物的代菌和霉菌等微生物的代谢活活动有明有明显的影响。的影响。 三、湿度、渗透三、湿度、渗透压和水活度和水活度 如基质含水量不高、空气干燥，胞壁较薄的气如基质

48、含水量不高、空气干燥，胞壁较薄的气生菌丝易失水萎蔫，不利于甚至可终止代谢活动，生菌丝易失水萎蔫，不利于甚至可终止代谢活动，空气湿度较大则有利于生长。空气湿度较大则有利于生长。 细菌在空气中的生存和传播也以湿度较大为合细菌在空气中的生存和传播也以湿度较大为合适。因此，环境干燥，可使细胞失水而造成代谢停适。因此，环境干燥，可使细胞失水而造成代谢停止乃至死亡。止乃至死亡。 人们广泛应用干燥方法保存谷物、纺织品与食人们广泛应用干燥方法保存谷物、纺织品与食品等，其实质就是夺细胞之水，从而防止微生物生品等，其实质就是夺细胞之水，从而防止微生物生长引起的霉腐。长引起的霉腐。 氧氧根据氧与微生物生根据氧与微生

49、物生长的关系可将微生物分的关系可将微生物分为： 好氧性微生物好氧性微生物 微好氧性微生物微好氧性微生物 氧的忍耐型微生物氧的忍耐型微生物 兼性兼性厌氧性微生物氧性微生物 专性性厌氧性微生物氧性微生物四、氧和氧化还原电位四、氧和氧化还原电位 专性好氧菌专性好氧菌 （ obligate or strict aerobes ）这类微生物具有完整的呼吸链，以分子氧作为最终电子受体，只能在较高浓度分子氧（一 0.2Pa ）的条件下才能生长，大多数细菌、放线菌和真菌是专性好氧菌。 兼性厌氧菌兼性厌氧菌 (facultative anaerobes ） 兼性厌氧菌也称兼性好氧菌（ facultative a

50、erobes ）。这类 微生物的适应范围广，在有氧或无氧的环境中均能生长。 一般以有氧生长为主，有氧时靠呼吸产能；兼具厌氧生长能力，无氧时通过发酵或无氧呼吸产能。如大肠杆菌（ E . coli ）、产气肠杆菌（ Enterobacter aerogenes ）等肠杆菌科 ( Enterobacteriaceae ）的成员，地衣芽孢杆菌（ Bacillus lichenifornus ）、酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）等 微好氧菌微好氧菌 （ microserophilic bacteria ） 这类微生物只在非常低的氧分压，即 0.010.03 Pa 下才能生

51、长（正常大气的氧分压为 0.2Pa ）。它们通过呼吸链，以氧为最终电子受体产能。如发酵单胞菌属（ Zymontonas ）、弯曲菌属（ Gampylobacter ）、氢单胞菌属（ Hy drogenomonas ）、霍乱弧菌（ Vibrio cholerae ）等属种成员。 耐氧菌耐氧菌 （ aerotolerant anaerobes ） 它们的生长不需要氧，但可在分子氧存在的条件下行发酵性厌氧生活，分子氧对它们无用，但也无害，故可称为耐氧性厌氧菌。氧对其无用的原因是它们不具有呼吸链，只通过发酵经底物水平磷酸化获得能量。一般的乳酸菌大多是耐氧菌. 厌氧菌厌氧菌 （ anaerobes ）

52、分子氧对这类微生物有毒，氧可抑制生长（一般厌氧菌）甚至导致死亡（严格厌氧菌）。因此，它们只能在无氧或氧化还原电位很低的环境种生长。常见的厌氧菌有梭菌属（ Clostridium ）成员.氧对厌氧微生物产生毒害作用的机理氧对厌氧微生物产生毒害作用的机理氧气对厌氧性微生物产生毒害作用的机理主要是厌氧微生物在有氧条件下生长时，会产生有害的超氧基化合物和过氧化氢等代谢产物，这些有毒代谢产物在胞内积累而导致机体死亡。 好氧微生物与兼性厌氧细菌细胞内普遍存在着超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。而严格厌氧细菌不具备这两种酶。耐氧性微生物只具有超氧化物歧化酶，而不具有过氧化氢酶，因此在生长过程中产生的超氧基化合物被

53、分解去毒，过氧化氢则通过细胞内某些代谢产物进一步氧化而解毒，这是决定耐氧性微生物在有氧条件下仍可生存的内在机制。 氧化还原电位势氧化还原电位势(Eh)好氧微生物：好氧微生物： +0.1 V；最适；最适+0.3+0.4V； 厌氧微生物：氧微生物：75 嗜嗜亚高温菌高温菌(中度好中度好热菌菌): 5575高温菌耐高温机理高温菌耐高温机理酶对热稳定定 核酸核酸G+Cmol%较高高,Tm值较大大 细胞膜胞膜长链脂肪酸含量高脂肪酸含量高,主要是一些分主要是一些分支的支的长链饱和脂肪酸和脂肪酸(17, 18和和19碳原子碳原子) 保保护因子因子,如金属离子如金属离子(Mg2+,Ca2+等等)和一和一些低分

54、子物些低分子物质如多胺等如多胺等（三）、微生物对极端（三）、微生物对极端pHpH的抗性的抗性极端极端pH条件条件: pH9.0 机理机理: 还不完全了解。一般不完全了解。一般认为是由于是由于细胞胞膜膜对氢离子的不透性所引起。而离子的不透性所引起。而对于嗜碱菌于嗜碱菌则认为是通是通过主主动分泌分泌OH -离子的方式保持离子的方式保持细胞内胞内pH在中性范在中性范围。不论是嗜酸细菌还是嗜碱细菌，细胞壁与细不论是嗜酸细菌还是嗜碱细菌，细胞壁与细胞膜在维持胞内胞膜在维持胞内 pH 的稳定上都起着重要作的稳定上都起着重要作用。用。 （四）、微生物对重金属离子毒（四）、微生物对重金属离子毒害的抗性害的抗性

55、 微生物一般微生物一般对重金属的需要量极重金属的需要量极为微量，微量，在在0.1mg/L或更少即可或更少即可满足，并有一定的刺激足，并有一定的刺激生生长的作用。的作用。过量量产生毒害。生毒害。 但也有某些微生物可生但也有某些微生物可生长在在浓度已大大超度已大大超过对生物生物产生毒性的高含量重金属的生毒性的高含量重金属的环境中。境中。 在高在高浓度度环境中藻境中藻类、真菌、原生、真菌、原生动物、物、和和细菌都有抗高菌都有抗高浓度重金属的种度重金属的种类。微生物对重金属离子毒害微生物对重金属离子毒害的抗性机理的抗性机理改改变细胞膜透性，阻止金属离子胞膜透性，阻止金属离子进入入细胞胞 产生某种螯合生

56、某种螯合剂如胞外多糖，抵抗金属如胞外多糖，抵抗金属离子的毒害离子的毒害 通通过酶促反促反应，使有毒物，使有毒物质转变成无毒成无毒化合物化合物第第五五节 微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏一、微生物菌种的保藏要求一、微生物菌种的保藏要求微生物菌种保藏的要求：微生物菌种保藏的要求： 是广泛收集各种研究、教学和生是广泛收集各种研究、教学和生产性菌种，性菌种，满足各方面需求；足各方面需求； 高高质量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、活性不衰老、特性不活性不衰老、特性不变异、分异、分类不紊乱；不紊乱； 随随时可提供保持有原始特性的菌种用于可提供保持有原始特性的菌种用于交交换和使

57、用。和使用。菌种保藏原理菌种保藏原理菌种保藏的基本原理是将微生物菌种保存在菌种保藏的基本原理是将微生物菌种保存在不利于微生物活不利于微生物活跃生生长和代和代谢的不良的不良环境中，境中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养养饥饿等等，等等，使微生物代使微生物代谢速率极速率极为缓慢或慢或处于休眠状于休眠状态。而一旦恢复所保存菌种生而一旦恢复所保存菌种生长的正常的正常环境和境和营养条件，即可养条件，即可获得具有高生理活性和保持原得具有高生理活性和保持原种种优良性状的菌种培养物。良性状的菌种培养物。二、微生物菌种保藏的常用方法二、微生物菌种保藏的常用方法菌菌种种保保藏藏的的方方法法

58、有有多多种种多多样，常常用菌种保藏方法的比用菌种保藏方法的比较如下如下: :常用菌种保藏方法的比常用菌种保藏方法的比较方法方法原理原理适宜菌种适宜菌种保藏时间保藏时间特点特点冰箱低温（冰箱低温（4）低温低温各大类微生物各大类微生物36个月个月简便简便石蜡油封藏石蜡油封藏低温、缺氧低温、缺氧各大类微生物各大类微生物12年年简便简便砂土保藏砂土保藏干燥、无营养干燥、无营养产产芽芽孢孢细细菌菌、产产孢孢子子的的放线菌、霉菌放线菌、霉菌110年年简便有效简便有效冷冻干燥保藏冷冻干燥保藏干干燥燥、低低温温、无无氧氧各大类微生物各大类微生物515年以上年以上繁而高效繁而高效三、保藏菌种的活化三、保藏菌种的活化保藏菌种的活化是使用保藏菌种的第一步。保藏菌种的活化是使用保藏菌种的第一步。活化的要求是使保藏菌种恢复旺盛的生命活活化的要求是使保藏菌种恢复旺盛的生命活动和和显示其原有的代示其原有的代谢和生和生产性能。性能。 保藏菌种的活化必保藏菌种的活化必须使用保藏菌种使用保藏菌种时使用的相同使用的相同培养基和培养条件，或以保藏菌种生培养基和培养条件，或以保藏菌种生长和和代代谢最佳的培养基和培养条件，最佳的培养基和培养条件，以使保藏菌种能迅速恢复其原有的代以使保藏菌种能迅速恢复其原有的代谢速率和速率和生理特性生理特性. .