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1、第第 二十二十 章章重组重组DNA技术技术recombinant DNA technique 第第 一一 节节 重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程重组重组DNA技术：又称技术：又称DNA克隆或基因克隆克隆或基因克隆 应用酶学的方法应用酶学的方法，在体外将不同来源的在体外将不同来源的特异基因或特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组它载体分子，构建重组DNA分子，然后将分子，然后将重组重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆克隆”），），筛选出含有目的基因的转化子细
2、胞，再进筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一行扩增、提取获得大量同一DNA分子。分子。l克隆克隆(clone)：通过无性繁殖得到的来自同通过无性繁殖得到的来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。一始祖的相同副本或拷贝的集合。l克隆化克隆化(cloning)：获取这类同一的获取这类同一的DNA分分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。性繁殖。l重组重组DNA(recombinant DNA,或嵌合或嵌合DNA, chimera DNA)：采用克隆技术，把来自不同采用克隆技术，把来自不同生物的外源生物的外源DNA插入载体分子所形成的
3、杂合插入载体分子所形成的杂合DNA分子。分子。重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程 第二节第二节 重组重组DNA技术中常用工具酶技术中常用工具酶 一、一、 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶二、二、 DNA连接酶连接酶三、三、 DNA聚合酶聚合酶四、四、 其它修饰酶其它修饰酶 1. 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 基因工程的基因工程的手术刀手术刀功能：功能： 识别识别双链双链DNA中特异序列，该序列的特中特异序列，该序列的特征为征为4-6个核苷酸的个核苷酸的回文结构回文结构，并在识别序，并在识别序列内或附近列内或附近特异切割特异切割DN
4、A，产生产生黏性末端黏性末端或或平末端平末端。 根据需要在特定的位点精确切割双链根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子。分子。作用：作用：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA， 保保护护自身自身DNA。分类：分类：、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：
5、Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构 (palindrome) 切口切口：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG 作用模式图：作用模式图：（1）产生产生5 突出突出黏性末端黏性末端 (sticky end)EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHP A A T T C* G*5335P OH 作用模式图：作用模式图：（2）产生产生3 突出突出黏性末端黏性末端Pst I*CTGC
6、AG*GACGTC*5355335335OHP*C T G C A*G5335OHPA C G T C*G* 作用模式图：作用模式图：（3）产生产生平末端平末端 (blunt end)Alu I*AGCT*TCGA*53535335OHP*AG*TC5335 OHPCT*GA*同裂酶同裂酶来来源源不不同同但但能能识识别别相相同同序序列列的的酶酶，又又称称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同尾酶同尾酶有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割
7、DNA后后，产产生生相相同同的的黏黏性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的黏黏性性末末端端称称为为配配伍伍未未端端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 可变酶可变酶 识别识别DNA序列中的一个或几个碱基序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过是可变的，并且识别序列往往超过6个个核苷酸。此类酶是核苷酸。此类酶是型限制酶的特例。型限制酶的特例。 如：如：Bstp G GTNACC; Bbl GCC(N)4NGGC2. DNA连接酶连接酶
8、 (DNA ligase) 基因工程的基因工程的缝纫针缝纫针 将两条双链将两条双链DNA片段连接起来，实片段连接起来，实现现DNA的的体外重组体外重组。功能：功能： 催化两条催化两条双链双链DNA分子的分子的互补黏性末互补黏性末端端或或平末端平末端的的5 磷酸磷酸基团与基团与3 羟基羟基形形成成磷酸酯键磷酸酯键。 也可将双链也可将双链DNA分子内部分子内部的单个切的单个切口口(无核苷酸空缺无核苷酸空缺)连接起来。还可作用连接起来。还可作用于于RNA，但效率很低。但效率很低。 DNA连接酶催化连接酶催化平末端平末端连接要比连接要比黏性黏性末端末端效率低得多。效率低得多。 DNA连接酶有连接酶有T
9、4 DNA连接酶连接酶和大肠和大肠杆菌杆菌DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶 EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OHDNA连接酶连接酶作用模式图：作用模式图：（1）连接黏性末端黏性末端 作用模式图：作用模式图： （2）连接平末端平末端Alu I*AGCT*TCGA*5353OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*DNA连接酶连接酶 能够把脱氧核糖核苷酸能够把脱氧核糖核苷酸连续地连续地添加到添加到双链双链DNA分子引物链的分子引物链的3-OH末端末端，催，催化核苷酸的聚合作用化核
10、苷酸的聚合作用 类型：类型： 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 Klenow片段片段 Taq DNA聚合酶聚合酶 反转录酶反转录酶 三、三、DNA聚合酶聚合酶 四、其它修饰酶四、其它修饰酶 n末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase） n多核苷酸激酶多核苷酸激酶（polynuleotide kinase） n碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 功能：功能： 催化脱氧核糖核苷酸转移到催化脱氧核糖核苷酸转移到单链单链或或双链双链DNA分子的分子的3-OH末端上。末端上。(1) 底物是底物是单
11、链单链DNA或有或有3突出末端突出末端的的 双链双链 DNA。OH53Mg2+dNTP53( (A、G、C、T) )n nnppi 53OHMg2+dNTPnppi53( (A、G、C、T) )n n末端转移酶末端转移酶 (2) 底物是底物是平端平端或或3凹端凹端的双链的双链DNA。53Co2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi 53Co2+dNTPnppi53OHOH(A、G、C、T)n 用途：用途： （1）主要作用是在载体或目的基因主要作用是在载体或目的基因 3 末端加上同源末端加上同源多聚尾巴多聚尾巴，形成，形成人工人工 黏性末端黏性末端，便于，便于DNA重组。重组。（2）DNA
12、3末端的末端的同位素标记同位素标记。 目的基因进入原核或真核细胞并高效复目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入制和表达蛋白质，需要装入载体载体才能实现。才能实现。载体（载体（vector） 指能携带外源指能携带外源DNA分子进入受体细胞分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具进行扩增和表达的运载工具第三节第三节 重组重组DNA技术中常用载体技术中常用载体 作为基因工程载体所需具备的基本条件作为基因工程载体所需具备的基本条件n能自主复制；能自主复制；n具有具有两个以上两个以上的遗传标记物，便于重组体的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；n有克隆位点有克隆位点(外
13、源外源DNA插入点插入点)，常具有，常具有多个多个单一酶切位点单一酶切位点，称为多克隆位点；，称为多克隆位点；n分子量小分子量小，以容纳较大的外源以容纳较大的外源DNA；n拷贝数高拷贝数高n具有较高的遗传稳定性具有较高的遗传稳定性克隆载体克隆载体 (cloning vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体。设计的载体。表达载体表达载体 (expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。多肽链而特意设计的载体。 n质粒载体质粒载体：最常用的对目的基因最常用的对目的基
14、因克隆克隆 n 噬菌体噬菌体：主要用于主要用于构建构建基因组基因组DNA或或 cDNA文库文库nM13噬菌体噬菌体：专用于专用于Sanger双脱氧双脱氧DNA测序测序 n 粘粒：粘粒：用于用于克隆大片段克隆大片段DNAn 酵母质粒：酵母质粒：用于在用于在酵母酵母中表达目的蛋白中表达目的蛋白n病毒：病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物 毒，用于在毒，用于在真核细胞真核细胞中表达目的蛋白中表达目的蛋白 基因工程载体的种类和用途基因工程载体的种类和用途1. 质粒质粒 (plasmid)载体载体 细菌培养细菌培养质粒扩增并表达蛋白质质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌大肠杆菌
15、染色质染色质质粒质粒 细菌染色质以外的双链环状细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。能自我复制和表达其携带的遗传信息。 AmprORITetrpBR322质粒质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构与功能：结构与功能：Ampr, Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。Pst I, BamH I：两个单酶切位点用于插入目的基因分子量较小拷贝数较高pUC18/pUC19pUC192686 bpAmprLac ZP(BLA)PlacOriAva I (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)Pst I (440
16、)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCSMCS：Multiple Clonning Site提供多个单酶切位点用于克隆操作提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆蓝白斑筛选阳性克隆其它质粒载体其它质粒载体 n能在体外转录克隆基因的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体 由由pUC系列质粒载体派生而来系列质粒载体派生而来 ，带有来自，带有来自噬菌体噬菌体T7、SP6的启动子的启动子 n穿梭质粒载体（穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 可在两种不同的寄主细胞中存活和
17、复制的可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体质粒载体 nTA克隆载体克隆载体 专为克隆专为克隆PCR产物而设计的产物而设计的 ，在其，在其MCS两两侧的侧的3末端携带有未配对的末端携带有未配对的T碱基碱基 2. 噬菌体噬菌体 (phage)载体载体 噬菌体噬菌体 (phage) M13噬菌体噬菌体 粘粒粘粒 (cosmid) 噬菌体噬菌体n噬菌体感染细菌后，可进入噬菌体感染细菌后，可进入溶菌生命周溶菌生命周期期及及溶源生命周期溶源生命周期 n与质粒载体相比，其突出优点是与质粒载体相比，其突出优点是可插入可插入较大外源较大外源DNA片段片段n噬菌体的感染效率噬菌体的感染效率远高于质粒载体的
18、转远高于质粒载体的转化效率化效率 粘粒粘粒 (cosmid)组成：组成：n 抗性基因；抗性基因；n 质粒复制的起始位点质粒复制的起始位点(ORI)；n 用于插入目的基因的单个酶切位点；用于插入目的基因的单个酶切位点；n 噬菌体的噬菌体的cos位点位点。 可见，可见，cosmid是由质粒和是由质粒和 噬菌体的噬菌体的cos位点位点构建而成。构建而成。M13噬菌体载体噬菌体载体nM13是一种是一种丝状单链噬菌体丝状单链噬菌体，基因组全，基因组全长长6 407bp，为，为闭环闭环单链单链DNA n由于由于M13噬菌体载体克隆的外源噬菌体载体克隆的外源DNA片片段不宜大于段不宜大于1 500bp ，限
19、制了其应用，限制了其应用 M13噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 (含含lacZ基因基因)n M13mp系列系列n pUC系列系列3. 人工染色体载体人工染色体载体 酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)可接受可接受100kb2000kb的外源的外源DNA片段插入，是人类基片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体体包含的调控元件包含的调控元件 ：着丝粒、端粒、复制着丝粒、端粒、复制起始点、限制性酶切位点、选择标记、起始点、限制性酶切位点、选择标记、原核序列及调控元件原核序列及调控元件 4. 病毒载体病毒载体 目前常用的病毒载体有目前常用的病毒载
20、体有整合型整合型和和游离游离型型两类两类 n反转录病毒载体反转录病毒载体 （整合型）（整合型）n腺病毒载体腺病毒载体 （游离型）（游离型）第四节第四节 目的基因的获得和体外重组目的基因的获得和体外重组 一、目的基因的获得一、目的基因的获得 -分分二、目的基因的体外重组二、目的基因的体外重组 -切、接切、接目的基因目的基因 (target DNA)n cDNA (complementary DNA)n基因组基因组DNA (genomic DNA)目的目的: :n 分离获得某一感兴趣的基因分离获得某一感兴趣的基因或或DNA序列序列 n 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋
21、白质）种类种类：（一）（一） 化学合成法化学合成法要求：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产已知目的基因的核苷酸序列或其产 物的氨基酸序列物的氨基酸序列（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)（三）从基因文库中筛选（三）从基因文库中筛选（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取分分* 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片段基因片段克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制
22、性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞存在于转化细胞内由克隆载体所携带内由克隆载体所携带的所有基因组的所有基因组DNA的的集合集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源
23、DNA 片段片段 基因文库基因文库mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 反转录酶反转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T 基因组文库：基因组文库：G-文库文库cDNA文库：文库：c-文库文库 (常用常用)方法：方法：基因文库基因文库 用目的基因上的一段用目的基因上的一段DNA做成做成探针探针与文库中的与文库中的DNA作作核酸杂交核酸杂交，从基因，从基因文库中文库中“钓出钓出”有目
24、的基有目的基因的克隆。因的克隆。目目 录录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接接接1. 黏性末端连接黏性末端连接方式方式：(1) 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2) 不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 配伍末端配伍末端连接连接 非配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体目的基因自连目的基因自连载体自连载体自连同同一一限限制制
25、酶酶切切位位点点连连接接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2. 平末端连接平末端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的粘限制性内切酶切割产生的粘端补齐或切平形成的平端端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体
26、载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3. 人工接头人工接头(linker)连接连接 由平端加上新的酶切位点，再用由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生黏性末端，而进行粘限制酶切除产生黏性末端，而进行粘端连接。端连接。 人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 录录4. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段片段3末端加上同聚末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再进行粘端物序列、制造出黏性末端，再进行粘端连接。连接
27、。5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 5-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5. T-A克隆克隆是直接将是直接将PCR产物插入到载体中的方产物插入到载体中的方法。法。TaqDNA聚合酶（具有末端转移酶活聚合酶（具有末端转移酶活性）在扩增目的基因片段时，可不依赖其性）在扩增目
28、的基因片段时，可不依赖其模板，可在模板，可在PCR产物产物3端自动加上碱基端自动加上碱基A。为此，在为此，在T4 DNA连接酶催化下，实现质连接酶催化下，实现质粒载体（载体酶切切口具有游离粒载体（载体酶切切口具有游离T）和）和PCR产物的直接连接，实现产物的直接连接，实现DNA片段重组片段重组33AATTpMD 19-T VectorEcoR V酶切酶切大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞第五节第五节 重组分子的导入和筛选与鉴定重组分子的导入和筛选与鉴定一、重组一、重组DNA分子的导入分子的导入 转转二、重组二、重组DNA分子的筛选与鉴定分子的筛选与鉴定筛筛一、重组一、重组DNA分子的导入分子
29、的导入宿主细胞应具备的条件宿主细胞应具备的条件n处于感受态处于感受态n对载体无严格限制对载体无严格限制 n限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷n不对外源不对外源DNA进行修饰进行修饰 n能表达重组体所提供表型特征能表达重组体所提供表型特征重组重组DNA分子分子的导入方式的导入方式转化转化 (transformation) 以质粒作为为载体将重组以质粒作为为载体将重组DNA分子导入细菌（原核分子导入细菌（原核细胞）的过程。细胞）的过程。转染转染 (transfection) 以噬菌体、病毒或脂质体作为载体将重组以噬菌体、病毒或脂质体作为载体将重组DNA分子分子导入真核细胞的过程。导入真核细胞的过
30、程。感染感染 (infection) 以噬菌体或病毒作为载体构建的重组以噬菌体或病毒作为载体构建的重组DNA，经体外包，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒或病毒颗粒后导入装成具有感染性的噬菌体颗粒或病毒颗粒后导入细菌或细菌或真核细胞的过程。真核细胞的过程。非转化子非转化子转化子转化子非重组子非重组子重组子重组子鉴定鉴定单抗生素筛选单抗生素筛选非转化子非转化子( (不能生长）不能生长）转化子转化子阳性重组子阳性重组子自身环化载体自身环化载体未酶解完全载体未酶解完全载体非目的基因插入载体非目的基因插入载体二、重组二、重组DNA分子的筛选与鉴定分子的筛选与鉴定 直接选择法直接选择法n 抗药性标记选择
31、抗药性标记选择n 标志补救标志补救 (marker rescue)n 分子杂交法分子杂交法 原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹 免疫学方法免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等重组子的筛选与鉴定方法重组子的筛选与鉴定方法 AmprTerr1.插入失活插入失活: 例例1：在：在Tetr中插入目的基因中插入目的基因在质粒固有的功能基因内插入目的基因，则该基因不能表达有功能的蛋白质。 AmpTet1 2 34 5 63和5 是阳性克隆1 2 34 5 6例例1：( (插插入入失失活活法法) )抗抗药药性性标标记记选选择择例例2： ApmrMCSLacZ例例3
32、: 在在Laz中插入目的基因中插入目的基因 X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因例例3：蓝白斑筛选：蓝白斑筛选 2. 菌落原位杂交菌落原位杂交覆盖滤膜取下沾有菌落的滤膜 裂解、 变性、固定等与探针杂交放射性自显影1 2 34 5 63和和5是阳性克隆是阳性克隆重组重组DNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源
33、基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交第六节第六节 外源基因的表达外源基因的表达表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化 外源基因的表达涉及目的基因外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯
34、化等过程质产物的加工及分离纯化等过程 一、外源基因在原核细胞中的表达一、外源基因在原核细胞中的表达 原核表达系统主要有大肠杆菌、芽原核表达系统主要有大肠杆菌、芽孢杆菌及链霉菌系统等孢杆菌及链霉菌系统等 ，其中，其中大肠杆大肠杆菌（菌（E.coli）表达体系最为常用，其表达体系最为常用，其优点是培养方法简单、迅速、经济而优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产又适合大规模生产 （一）对外源目的基因的要求（一）对外源目的基因的要求1外源真核基因不能带有外源真核基因不能带有5端非编码区和内端非编码区和内 含子结构，必须用含子结构，必须用cDNA或化学合成基因或化学合成基因2外源基因必须置于原
35、核细胞的强启动子和外源基因必须置于原核细胞的强启动子和 SD序列等元件控制下序列等元件控制下3重组载体必须形成正确的开放阅读框架重组载体必须形成正确的开放阅读框架4外源基因转录生成的外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并必须相对稳定并 能被有效翻译，所表达的蛋白质产物稳定，能被有效翻译，所表达的蛋白质产物稳定， 不能对宿主菌有毒害作用不能对宿主菌有毒害作用（二）对原核表达载体的要求（二）对原核表达载体的要求1具有强启动子及其两侧的调控序列具有强启动子及其两侧的调控序列2含有含有SD序列，而且序列，而且SD序列与起始序列与起始 密码子密码子AUG之间要有合适的距离之间要有合适的距离 3带有转录
36、终止序列带有转录终止序列 4含多接头克隆位点含多接头克隆位点 （三）外源基因在原核细胞中的表达方式（三）外源基因在原核细胞中的表达方式1. 融合型表达融合型表达是指将外源目的基因与另一基因（可以是是指将外源目的基因与另一基因（可以是原核原核DNA或其他或其他DNA序列）相拼接构建成序列）相拼接构建成融合基因进行表达融合基因进行表达。这种由外源目的蛋白与原核生物多肽或具这种由外源目的蛋白与原核生物多肽或具有其他功能的多肽结合在一起的蛋白，即有其他功能的多肽结合在一起的蛋白，即为融合蛋白。为融合蛋白。可通过酶解法或化学降解法切除融合蛋白可通过酶解法或化学降解法切除融合蛋白中的其他多肽成分而获得外源
37、目的蛋白。中的其他多肽成分而获得外源目的蛋白。特点：表达效率高，较稳定，可抵御细菌特点：表达效率高，较稳定，可抵御细菌蛋白酶的水解，带有特殊标记，易于进行蛋白酶的水解，带有特殊标记，易于进行亲和纯化。亲和纯化。（三）外源基因在原核细胞中的表达（三）外源基因在原核细胞中的表达2. 非融合型表达非融合型表达指外源目的基因不与其他基因融合，直接指外源目的基因不与其他基因融合，直接从起始密码从起始密码AUG开始在原核调控元件控制开始在原核调控元件控制下表达蛋白质。下表达蛋白质。特点：具有类似天然蛋白质的结构，其生特点：具有类似天然蛋白质的结构，其生物学功能与天然蛋白更为接近，但其缺点物学功能与天然蛋白
38、更为接近，但其缺点是容易被细菌蛋白酶水解。是容易被细菌蛋白酶水解。（三）外源基因在原核细胞中的表达（三）外源基因在原核细胞中的表达3. 分泌型表达分泌型表达是利用分泌型表达载体将表达的蛋白质由是利用分泌型表达载体将表达的蛋白质由细胞质跨膜分泌到细胞周质中，需要在信细胞质跨膜分泌到细胞周质中，需要在信号肽的帮助下进行号肽的帮助下进行。分泌型表达载体必须在分泌型表达载体必须在SD序列下游携带有序列下游携带有一段信号肽序列。分泌型蛋白可以是融合一段信号肽序列。分泌型蛋白可以是融合蛋白或非融合蛋白。蛋白或非融合蛋白。特点：可防止宿主蛋白酶对外源蛋白的水特点：可防止宿主蛋白酶对外源蛋白的水解，减轻大肠杆
39、菌代谢负荷，便于蛋白质解，减轻大肠杆菌代谢负荷，便于蛋白质在细胞外正确折叠和提纯，但分泌型蛋白在细胞外正确折叠和提纯，但分泌型蛋白的表达量往往较低，且有时信号肽不能被的表达量往往较低，且有时信号肽不能被切除或在错误的位置上被切除。切除或在错误的位置上被切除。（三）外源基因在原核细胞中的表达（三）外源基因在原核细胞中的表达4. 包涵体包涵体 当大肠杆菌高效表达外源基因时，所表达当大肠杆菌高效表达外源基因时，所表达的蛋白质致密地集聚在细胞内，或被膜包的蛋白质致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体结构称为包涵体。特点：利于表
40、达产物的分离纯化，可在一特点：利于表达产物的分离纯化，可在一定程度上保持表达产物的稳定，也能使宿定程度上保持表达产物的稳定，也能使宿主细胞表达对其有毒或有致死效应的目的主细胞表达对其有毒或有致死效应的目的蛋白，但丧失了原有的生物学活性，因此蛋白，但丧失了原有的生物学活性，因此必须通过有效的变性复性操作以恢复其生必须通过有效的变性复性操作以恢复其生物活性。物活性。（四）原核表达系统的不足（四）原核表达系统的不足 只适合表达克隆的只适合表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因，不宜表达真核基因组组DNA 表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进行表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进行糖基化、磷酸化、乙酰化
41、等修饰糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰 真核蛋白常以无生物活性的包涵体形式存在真核蛋白常以无生物活性的包涵体形式存在 难以实现大量表达分泌性蛋白难以实现大量表达分泌性蛋白 真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解 原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素 真核表达系统真核表达系统是指在真核细胞中表是指在真核细胞中表达外源基因的体系达外源基因的体系主要有：主要有：酵母、哺乳动物、昆虫细胞酵母、哺乳动物、昆虫细胞（杆状病毒）系统和高等植物系统（杆状病毒）系统和高等植物系统二、外源基因在真核细胞中的表达二、外源基因在真核细胞中的表达（一）真核表
42、达系统的优缺点（一）真核表达系统的优缺点优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA或真核基因组或真核基因组DNA 可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，使表达蛋白形成正确的天然构象使表达蛋白形成正确的天然构象 某些真核细胞可将外源基因表达产物直某些真核细胞可将外源基因表达产物直接分泌至细胞培养基中接分泌至细胞培养基中 缺点：缺点：操作技术难、费时、费钱操作技术难、费时、费钱（二）真核表达载体（二）真核表达载体 真核表达载体大多是真核表达载体大多是穿梭载体穿梭载体，既含，既含有原核克隆载体的有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因复制子、抗性筛选基因和和MCS等序
43、列，利于在原核细胞中进行目等序列，利于在原核细胞中进行目的基因的重组和载体的扩增；又含有真核的基因的重组和载体的扩增；又含有真核细胞的细胞的启动子、增强子、剪接信号、转录启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号和终止信号和PolyA化信号及遗传选择标记化信号及遗传选择标记等组件，便于在真核细胞中高效、正确表等组件，便于在真核细胞中高效、正确表达目的基因达目的基因 （三）外源基因导入真核细胞（三）外源基因导入真核细胞外源基因导入真核细胞的方法外源基因导入真核细胞的方法 病毒感染（天然方法病毒感染（天然方法 ） 载体转染载体转染 （化学或物理方法（化学或物理方法 ）（四）转染细胞的筛选（四）转染细胞
44、的筛选常用的筛选方法有常用的筛选方法有1. 新霉素抗性新霉素抗性(neor)选择系统选择系统 2. 胸苷激酶基因胸苷激酶基因(tk)选择系统选择系统 3. 二氢叶酸还原酶基因二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统选择系统 （四）外源基因在真核细胞中的表达（四）外源基因在真核细胞中的表达表达方式主要有两大类表达方式主要有两大类n瞬时表达（不与宿主染色体整合瞬时表达（不与宿主染色体整合 ） 常用的瞬时表达宿主是常用的瞬时表达宿主是源自非洲绿猴细胞源自非洲绿猴细胞株株CV-1的的COS细胞细胞n稳定表达稳定表达 （整合至宿主染色体中（整合至宿主染色体中 ） 常用的稳定表达宿主细胞是常用的稳定表达宿主细胞是中国仓鼠卵巢中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞本章要求掌握的内容本章要求掌握的内容1. 重组重组DNA技术与基因工程的概念、基本原理、技术与基因工程的概念、基本原理、 基本步骤基本步骤2. 限制性内切酶的概念、分类和特点限制性内切酶的概念、分类和特点3. 质粒载体的概念和特点质粒载体的概念和特点4. 重组重组DNA分子的构建、导入、筛选及鉴定分子的构建、导入、筛选及鉴定
