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1、酶联免疫斑点酶联免疫斑点(ELISPOT)(ELISPOT)技术技术一、ELISPOT检测细胞因子实验技术vELISPOT检测方法特点通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况在分泌细胞原处捕获该细胞分泌的细胞因子斑点的生成属于一种显色反应：SPOT=细胞印迹斑点可持久保存并进行计数分析v可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力v计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的比例v有效、快速、灵敏度高 使用高吸附性的专用ELISPOT培养板 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍v易操作v样本量大的情况下实验
2、结果可用计算机图象分析系统进行快速、客观的分析106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数量的IFN-+ +的T淋巴细胞 ，经下列方法检测： ELISPOT 细胞内细胞因子染色（FACS） ELISAX X坐标：坐标： 10106 6 APCAPC中实际中实际IFN-IFN-+ +T T细胞数量细胞数量Y Y坐标：坐标： 各检测方法的检测结果各检测方法的检测结果 ELISPOT/FACS/ELISA ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较Coating Ab 包被培养孔并经BSA阻断根据实验设计加入淋巴细胞及含或不含刺激因子的培养液孵育v 基 本 原 理活化的淋巴细胞可分泌细胞因子与
3、Coating Ab结合洗除细胞，依次加入生物素标记的抗细胞因子抗体及酶标抗生物素抗体进行反应加入酶底物显色形成斑点（SPOT）B细胞杂交瘤的筛选 化合物和药物免疫学反应的检测优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性靶向疫苗的质控自身免疫疾病的诊断和预后分析自身免疫疾病免疫治疗的监控 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 器官移植中排斥反应的预测微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析结核病的诊断 ELISPOT方法主要用途Coating Ab包被培养板0.05%PBS-Tween20(PBST)洗板5次每孔加入1%BSA阻断按实验设计加入含或不含刺激剂的培养液及一定数目细胞孵育5-24小时40C过夜370C孵育1
4、小时取外周血单核细胞或脾淋巴细胞根据实验要求，培养液中加入所需刺激物，预先将所检测细胞孵育24-42小时无菌直接取外周血单核细胞或脾淋巴细胞或者去除细胞，加入冰冻去离子水200ul/孔，培养板置冰上10分钟 加入生物素标记的detector Ab加入酶标抗生物素抗体(GABA)40C暗处混合显色剂I和II, 加入显色剂I/II,暗处室温孵育20-30分钟 PBST洗板10次370C孵育1小时后，PBST洗板5次370C孵育1小时后，PBST洗板5次显微镜下观察至斑点形成，去离子水清洗培养板 室温干燥后在倒置显微镜下观察结果非无菌v 技 术 要 点 预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄）会影响斑点的形成 提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰 入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液 细胞孵育过程应保证ELISPOT培养板静置，CO2培养箱应保证稳定，避免震荡 稀释抗体及GABA冻干粉时建议无菌操作，保存过程避免细菌的污染以保证其效用 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合v ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
