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1、第三章第三章 菌种选育与培养菌种选育与培养第一节第一节 重要工业微生物的分离及菌种要求重要工业微生物的分离及菌种要求第二节第二节 工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育第三节第三节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏第四节第四节 种子的扩大培养种子的扩大培养发酵工程3上第一节第一节 重要工业微生物的分离重要工业微生物的分离及菌种要求及菌种要求微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。空气中，尤以土壤中最多。有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到
2、的野生菌株进行人工诱变，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。得到突变株才能被利用。当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。因突变转向基因重组的定向育种。由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。生物。发酵工程3上一、工业生产常用的微生物一、工业生产常用的微生物1.细菌（细菌（bacteria）2
3、.酵母菌（酵母菌（yeast）3.霉菌（霉菌（mould）4.放线菌（放线菌（actinomycetes）5.担子菌（担子菌（basidiomycetes）6.藻类（藻类（algae）枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等单细胞真核生物，常用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，单细胞真核生物，常用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等料用酵母菌体蛋白等根霉
4、、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等能产生多种抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素能产生多种抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等通常所说菇类（通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发质和抗癌药物的开发用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻
5、类将可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能转变为石油，或获取氢能发酵工程3上二、微生物工业对菌种的要求二、微生物工业对菌种的要求原料廉价、生产迅速、目的产物产量高。原料廉价、生产迅速、目的产物产量高。易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短。易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短。抗杂菌和噬菌体的能力强。抗杂菌和噬菌体的能力强。菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出
6、现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求：样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求：发酵工程3上三、重要工业微生物的分离三、重要工业微生物的分离分离分离 是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌
7、种。种生化反应的菌种。有时可以设计出一种在分离阶段便能识别所需有时可以设计出一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法；也可用特定的分离方法先进行分菌种的方法；也可用特定的分离方法先进行分离，随后再去识别所需的生产菌株。离，随后再去识别所需的生产菌株。发酵工程3上定方案：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：采样：有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。增增殖殖：人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培养养条条件件，使使所所需需菌菌种种增增殖殖培培养后，在数量上占优势。养后，在数量上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。利用分离
8、技术得到纯种。发发酵酵性性能能测测定定：进进行行生生产产性性能能测测定定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产量量、耐耐受受最最高高温温度度、生生长长和和发发酵酵最最适适温温度度、最最适适pHpH值值、提提取工艺等。取工艺等。工业微生物分离的程序：工业微生物分离的程序：发酵工程3上A A 采样对象采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较
9、多，如一些野的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。腐败物品，某些水域等。1 1、采样、采样发酵工程3上从自然界筛选从自然界筛选发酵工程3上 以温度适中，雨量不多的秋初为好。以温度适中，雨量不多的秋初为好。 在在选选好好适适当当地地点点后后，用用小小萨萨子子除除去去表表土土，取取离离地地面面5-15cm5-15cm处处的的土土约约10g10g，盛盛入入清清洁洁的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中，扎扎好好，标标记记，记记录录采采样样时时间间、地地点点、环环境境条条件件等等，以以备备查
10、查考考。为为了了使使土土样样中中微微生生物物的的数数量量和和类类型型尽尽少少变变化化，宜宜将将样样品品逐逐步步分分批批寄寄回回，以便及时分离。以便及时分离。B B 采样季节采样季节C C采样方式采样方式发酵工程3上2 2、增殖培养、增殖培养为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择择性性培培养养基基，选选择择一一定的培养条件来控制。定的培养条件来控制。 例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选选定定糖糖，淀淀粉粉、纤纤维维素素，或或者者石石油油等等，以以其其中中的的一一种种为为唯
11、唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。发酵工程3上（1 1）施加选择压力的分离方法）施加选择压力的分离方法富集液体培养富集液体培养 富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。方富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件。例如，供给特殊的基质或加入
12、某些抑制剂。他菌株生长的条件。例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。3 3、培养分离、培养分离发酵工程3上固体培养基的使用固体培养基的使用 该方法常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有该酶的该方法常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有该酶的作用底物。作用底物。发酵工程3上抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选 抗生素可作为分离步骤中的选择压力抗生素可作为分离步骤中的选择压力（2 2）随机分离方法）随机分离方法发酵工程3上生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选 生长因子如氨基酸和核苷酸等的生产不能作为分离步骤中的选择生长因子如氨基酸和核苷酸等的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随
13、机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检验出压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检验出产生菌。产生菌。发酵工程3上多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。发酵工程3上尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离，纯纯化化。在在这这一一步步，增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用，而而且且控控制制得得细细一一点点。纯纯种种分分离离的的方方法有划线分离法、稀释分离法。法有划线分离法、稀释分离法
14、。发酵工程3上4 4、筛选、筛选采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，以以求求得得到到适适合合于工业生产用菌种。于工业生产用菌种。发酵工程3上5 5、毒性试验、毒性试验自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种，更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作
15、作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。发酵工程3上第二节第二节 工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育用发酵法生产产品，首先要有一个良好的菌种，因此用发酵法生产产品，首先要有一个良好的菌种，因此必须进行菌种选育工作必须进行菌种选育工作菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展了微生物发酵工业的迅速发展通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几
16、十倍、几百倍、甚至几千倍产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和产生菌的遗传学研究等方面也发挥了重大作用和产生菌的遗传学研究等方面也发挥了重大作用菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求产的要求发酵工程3上一、自然选育一、自然选育 在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选自然选育育或或自然分离自然分离。 引起自发突变
17、的原因：多因素低剂量的诱变效引起自发突变的原因：多因素低剂量的诱变效应；互变异构效应。应；互变异构效应。 自然选育包括自然选育包括从自然界分离获得菌株从自然界分离获得菌株和和根据菌根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。种的自发突变进行筛选而获得菌种。自然选育的方法与第一节介绍的自然选育的方法与第一节介绍的微生物的微生物的分离方法分离方法相近，不同之处在于分离和筛选相近，不同之处在于分离和筛选是同步进行的。是同步进行的。宇宙空间的各种短波辐射、自然界普遍存在的一些低浓度诱宇宙空间的各种短波辐射、自然界普遍存在的一些低浓度诱变物质、微生物自身代谢活动中产生的诱变物质。变物质、微生物自身代谢活动中产
18、生的诱变物质。四种碱基的酮基（酮式或烯醇式）和氨基（氨基式或亚氨基式）四种碱基的酮基（酮式或烯醇式）和氨基（氨基式或亚氨基式）的互变异构。的互变异构。发酵工程3上1. 从自然界分离获得菌株从自然界分离获得菌株一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。发酵工程3上2. 从自发突变体中获得菌株从自发突变体中获得菌株u变异是育种的基础。变异是育种的基础。u自然突变是指自然条件下出现的基因变化。自然突变是指自然条件下出现的基因变化。u自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不
19、能满足育种工作的需要。因而不能仅停留菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在在“选选”种，还要进行种，还要进行“育育”种。如通过诱变剂处种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株诱诱变育种。变育种。发酵工程3上二、诱变选育二、诱变选育使用诱变剂进行人工诱变能提高突变频率和使用诱变剂进行人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。是当前菌种选育的一种主要
20、方法，使用普遍。诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。作相配合才能受到良好的效果。诱变育种的主要环节：诱变育种的主要环节：以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高；碱基变异频率大幅度提高；用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。异株，
21、以达到培育优良菌株的目的。发酵工程3上1.出发菌株的选择出发菌株的选择u工业上用来进行诱变处理的菌株，工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（称为出发菌株（parent strain）。）。u一般有三种：一般有三种：从自然界分离得到的野从自然界分离得到的野生型菌株；生型菌株；通过生产选育，已有一通过生产选育，已有一定的生产性状，对生产定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，环境有较好的适应性，正突变可能性较大；正突变可能性较大；已经诱变过的菌株，负已经诱变过的菌株，负突变可能性较大。突变可能性较大。2.菌悬液的制备菌悬液的制备3.前培养前培养4.诱变诱变5.变异菌株的分离和筛选变异菌株的分
22、离和筛选1、诱变选育的程序、诱变选育的程序发酵工程3上2、诱变育种方案设、诱变育种方案设计计 诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。和突变高产基因的表现。这些环节是相互联系，缺一不可的。这些环节是相互联系，缺一不可的。（1）出发菌株的选择）出发菌株的选择选择单倍体纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影选择单倍体纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响。响。不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。多或少，生长
23、速度快等有利于合成发酵产物的特性。选择对诱变剂敏感且变异幅度广的菌株作为出发菌株，可以提选择对诱变剂敏感且变异幅度广的菌株作为出发菌株，可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。发酵工程3上（2）诱变剂的种类和选择）诱变剂的种类和选择A、诱变剂、诱变剂物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂各种射线，如紫外线（焦耳）、各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑射线（库仑/千克）、千克）、射线、射线、射线、射线、射线和超声波等射线和超声波等直接与直接与DNA发生化学反应：甲基磺酸乙酯（发生化学反应：甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝）、亚硝基胍、氮芥、亚硝酸等
24、基胍、氮芥、亚硝酸等碱基类似物：碱基类似物：5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（BU）是胸腺嘧啶的类似物）是胸腺嘧啶的类似物 引起移码突变：吖啶类染料引起移码突变：吖啶类染料要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂 ，同时要，同时要考虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选考虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。择诱变剂。对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一
25、些作用较缓的诱变剂处理；的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理；对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。采用温和诱变剂或对高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。嘧啶的嘧啶的 5位上溴原子代替甲基后可较多地出现烯醇式的嘧啶。位上溴原子代替甲基后可较多地出现烯醇式的嘧啶。酮式的酮式的BU代替了胸腺嘧啶代替了胸腺嘧啶T而使而使A:T碱基对变为碱基对
26、变为A:BU，在下一次，在下一次DNA复制中烯醇式的复制中烯醇式的BU*和鸟嘌呤和鸟嘌呤G配对而出现配对而出现G:BU碱基对，最后在又一碱基对，最后在又一次复制中次复制中G和和C配对而终于出现配对而终于出现G:C碱基对，完成了碱基的置换。碱基对，完成了碱基的置换。发酵工程3上合适的剂量：合适的剂量：能增加变异幅度，又能促使变异能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量。向正变范围移动的剂量。 剂量的选择和诱变因素的使用随菌种的不剂量的选择和诱变因素的使用随菌种的不同而异，因此需从工作中总结、摸索来确定。同而异，因此需从工作中总结、摸索来确定。u诱变处理剂量的选择是一个比较复杂的问题，一般
27、正突变较多出现在偏低诱变处理剂量的选择是一个比较复杂的问题，一般正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变则较多出现于偏高剂量中。剂量中，而负突变则较多出现于偏高剂量中。u对于经过多次诱变而提高了产量的菌株，在较高剂量负突变率更高。对于经过多次诱变而提高了产量的菌株，在较高剂量负突变率更高。u因此，目前处理剂量已从以前采用的死亡率因此，目前处理剂量已从以前采用的死亡率9099减低为减低为7080。发酵工程3上各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间诱变剂诱变剂诱变剂的剂量诱变剂的剂量处理时间处理时间缓冲剂缓冲剂中止反应方法中止反应方法亚硝酸（亚硝酸（HNO2）0.010.
28、1mol/L510minpH值值4.5，1mol/L醋醋酸缓冲液酸缓冲液pH8.6，0.07磷酸二氢钠磷酸二氢钠硫酸二乙酯硫酸二乙酯（DES）0.511030min，孢子孢子1824hpH值值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯（EMS）0.050.5mol/L1060min，孢子孢子36hpH值值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释亚硝基胍亚硝基胍（NTG）0.11.0 mol/mL，孢子孢子3mg/mL1560min，90120minpH值值7.0，0.1mol/L磷酸缓
29、冲液或磷酸缓冲液或Tris缓缓冲液冲液大量稀释大量稀释亚硝基甲基胍亚硝基甲基胍（NMU）0.11.0 mol/mL1590minpH值值6.07.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂磷酸缓冲剂或或Tris缓冲液缓冲液大量稀释大量稀释氮芥氮芥0.11.0 mol/mL510minNaHCO3甘氨酸或大量甘氨酸或大量稀释稀释乙烯亚胺乙烯亚胺1:10001:100003060min硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释羟胺羟胺（NH2OHHCl）0.10.5数小时或生长过程数小时或生长过程中诱变中诱变大量稀释大量稀释氯化锂（氯化锂（LiCl）0.30.5加入培养基中，在加入培养基中，在生长过程中诱变生长
30、过程中诱变大量稀释大量稀释秋水仙碱秋水仙碱（C22H25NO6）0.010.2加入培养基中，在加入培养基中，在生长过程中诱变生长过程中诱变大量稀释大量稀释发酵工程3上B、影响诱变效果的因素、影响诱变效果的因素出发菌株的遗传特性；出发菌株的遗传特性；诱变剂；诱变剂；菌种的生理状态；菌种的生理状态；被处理菌株的预培养条件；被处理菌株的预培养条件；诱变处理时的外界条件等。诱变处理时的外界条件等。微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、融合后，易产生核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触
31、、融合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子显微镜操纵器分离单孢子 细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加都处于休眠状态，所以培养时间的
32、长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率；对不产孢的真菌，可直接采用萌发后的孢子则可提高诱变效率；对不产孢的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。年幼的菌丝体进行诱变处理。 诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养中培养2060min，再进行诱变处理，则变异率可大幅度提高。，再进行诱变处理，则变异率可大幅度提高。发酵工程3上（3）突变的诱发）突变的诱发A、诱变剂接触、诱变剂接触DNA分子分子B、DNA损伤的修复损伤的修复C、从前突变到突变、从前突变到突变D、从突变到突变型、从突变到突变型光复活作用光
33、复活作用切补修复切补修复重组修复重组修复SOS修复系统修复系统DNA多聚酶的校正作用多聚酶的校正作用（表型延迟：诱变剂一般只作用于（表型延迟：诱变剂一般只作用于DNA双链中的双链中的某一条单链，故某一突变还是无法反映在当某一条单链，故某一突变还是无法反映在当代的表型上，只有当经过代的表型上，只有当经过DNA的复制和细胞的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落。）于是出现了不纯菌落。）发酵工程3上（4）筛选的方法）筛选的方法A A、营养缺陷型、营养缺陷型(auxotroph)(auxotroph)的筛选方法的筛选方法 营养缺陷型菌
34、株的工业应用价值：在直链式合成途径中，营养缺陷营养缺陷型菌株的工业应用价值：在直链式合成途径中，营养缺陷型突变株可积累中间产物；分支代谢途径中，可通过解除协同反馈调节型突变株可积累中间产物；分支代谢途径中，可通过解除协同反馈调节而使另一分支末端产物积累。而使另一分支末端产物积累。发酵工程3上 与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：营养缺陷型养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出生的一些合成能力出现缺陷，而缺陷，而必必须在培养基内加入相在培养基内加入相应有机养分才能正常生有机养分才能正常生长的的变异菌株。异菌株。如：如：lys -， bio- 野生型野生型：自然界
35、分离到的任何微生物，在其自然界分离到的任何微生物，在其发生生营养缺养缺陷突陷突变前的原始菌株，前的原始菌株，为该微生物的野生型。微生物的野生型。 如：如：lys + ; bio + ;原养型原养型 ：指指营养缺陷型突养缺陷型突变菌株回复突菌株回复突变或重或重组后后产生生的菌株，与野生型的表型相同。的菌株，与野生型的表型相同。 发酵工程3上与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基基本培养基基本培养基（MM）-：凡是能凡是能满足野生型菌株足野生型菌株营养要求养要求的的最低成分的最低成分的合成培养基合成培养基。 完全培养基完全培养基（CM）+：满足一切足一切营养缺
36、陷营养缺陷型型菌株菌株生生长的的天然或半天然或半合成合成培养基。培养基。 补充培养基充培养基（SM）x：在：在MM中有中有针对性地加入一或几性地加入一或几种种营养成分以养成分以满足相足相应营养缺陷营养缺陷型型菌株菌株生生长的的合成合成培培养基。养基。 发酵工程3上筛选方法筛选方法一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有：淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。法等。（1）抗生素法：）抗生素法：细菌用青霉素法：
37、细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细
38、胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。不能生长而被保留下来，达到富集目的。酵母菌和霉菌用制霉素法：酵母菌和霉菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。CM或或SM培养基培养培养基培养过夜，克服表型延迟过夜，克服表型延迟发酵工程3上（2）菌丝过滤法）菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子
39、移入到菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔隔34h过滤一次，重复过滤一次，重复34次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。释、涂皿分离。（3）差别杀菌法）差别杀菌法 利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢
40、，然后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到将培养物加热到80，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。陷型则得以保留，起到了浓缩作用。 发酵工程3上营养缺陷型菌株的检出方法有：营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。营养法和影印接种法等。二二二二发酵工程3上B
41、、 抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选 包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性突变株筛选，这些突变型常包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性突变株筛选，这些突变型常用来提高某些代谢产物的产量。筛选常用梯度平板法（用来提高某些代谢产物的产量。筛选常用梯度平板法（gradient plategradient plate）。）。抗药性突变株的应用：抗药性突变株的应用：v作作为菌株的菌株的遗传标记v作作为生生产菌种（菌种（结构构类似物抗性似物抗性变异株）异株）发酵工程3上（5）突变基因的表型）突变基因的表型u菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件。菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特
42、性和菌种的培养条件。u突变株的遗传特性改变了，其培养条件也应该作出相应的改变。突变株的遗传特性改变了，其培养条件也应该作出相应的改变。u在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件，以在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件，以鉴别带有新特点的突变株，使高产基因能在生产规模下得以表达。鉴别带有新特点的突变株，使高产基因能在生产规模下得以表达。发酵工程3上三、常规的杂交育种三、常规的杂交育种1.遗传标记遗传标记2.异核体形成异核体形成3.杂合二倍体的形成杂合二倍体的形成4.染色体交换和单倍体染色体交换和单倍体发酵工程3上四、原生质体融合四、原生质体融合发酵工程3上1. 标
43、记菌株的筛选标记菌株的筛选u供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。利于融合子的选择。u采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。为标记。u通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。较细的筛选。发酵工程3上2. 原生质体的制备原生质体的制备在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶（细菌或放线菌可用溶菌酶在
44、高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶（细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）或青霉素处理，酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。影响原生质体制备的因素：影响原生质体制备的因素：菌体的预处理菌体的预处理菌体的培养时间菌体的培养时间酶浓度酶浓度酶解温度酶解温度酶解时间酶解时间渗透压稳定剂渗透压稳定剂用用EDTA、甘氨酸、青霉素或、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。一般选择对数生长后期的菌体
45、，这时细胞正在生长、一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。一般控制在一般控制在2040。充足的酶解时间充足的酶解时间对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于酵对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl和和NaCl等。一定浓度的等。一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。原生质膜的稳定性。发酵工程3上3. 原生质体的融合和再生原生质体的融合和再生u融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在
46、融合剂融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和和Ca2+作用下，作用下，发生原生质体的融合。发生原生质体的融合。u原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。影响原生质体融合的因素：影响原生质体融合的因素：菌体的前处理；菌体的前处理；菌体的培养时间；菌体的培养时间；融合剂的浓度；融合剂的浓度；融合剂作用的时间；融合剂作用的时间；阳离子的浓度；阳离子的浓度；融合的温度；融合的温度；融合体系的融合体系的pH值等。值等。影响原生质体
47、再生的因素：影响原生质体再生的因素：菌种自身的再生性能；菌种自身的再生性能；原生质体制备的条件；原生质体制备的条件；再生培养基成分；再生培养基成分；再生培养条件等。再生培养条件等。发酵工程3上检查原生质体形成和再生的指标：检查原生质体形成和再生的指标：原生质体的形成率原生质体的形成率原生质体的再生率原生质体的再生率将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数A；将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理：将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理：a.用无菌水适当稀释，在完全培养基平
48、板上培养计数，由于原生质体在低渗透用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数B；b.用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和C。原生质体形成率原生质体形成率A BA100原生质体再生率原生质体再生率C BAB100发酵工程3上4. 融合子的选择融合子的选择l融合子的选择主要依
49、靠两个亲株的选择性遗传标记。融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。l在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。l在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。发酵工程3上5. 灭活原生质体融合技术在育种中的应用灭活原生质体融合技术在育种中的应用灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一亲株或双亲株的原生质体，化试剂、抗生素等作为灭
50、活剂处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成使之失去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。能再生的融合体。该方法可以不用遗传标记该方法可以不用遗传标记发酵工程3上五、五、DNA重组技术重组技术 体外重组体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。 它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微它是现代生物技术的一
51、个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。株的潜力。发酵工程3上（一）（一）DNA重组过程重组过程基因的分离基因的分离载体的选择载体的选择DNA分子的切割与连接分子的切割与连接重组载体引入宿主细胞重组载体引入宿主细胞重组体的选择和鉴定重组体的选择和鉴定外源基因的表达外源基因的表达发酵工程3上微生物中各种形式基因重组的比较微生物中各种形式基因重组的比较重组范围重组范围供体和受体的关系供体和受体的关系整套染色体整套染色体局部杂合局部杂合高频率高频率低频率低频率部分染色体部分染色体个别或少数基因个别或少数基因细胞
52、融合细胞融合或联结或联结性细胞性细胞真菌的真菌的有性生有性生殖殖体细胞体细胞真菌的准真菌的准性生殖性生殖细胞间暂时沟通细胞间暂时沟通细菌的接合细菌的接合性导性导细胞间细胞间不接触不接触吸收游离吸收游离DNA片段片段转化转化噬菌体携带噬菌体携带DNA转导转导由噬菌体由噬菌体提供遗传提供遗传物质物质完整完整噬菌体噬菌体溶源转变溶源转变噬菌体噬菌体DNA转染转染发酵工程3上（二）分子育种技术（二）分子育种技术分子育种是应用基因工程手段进行的。分子育种是应用基因工程手段进行的。近年来，工程菌已逐渐开始应用发酵生产中。近年来，工程菌已逐渐开始应用发酵生产中。1.链霉菌的抗生素生物合成基因克隆链霉菌的抗生
53、素生物合成基因克隆2.利用基因工程技术生产新的抗生素利用基因工程技术生产新的抗生素3.利用基因工程技术生产氨基酸利用基因工程技术生产氨基酸发酵工程3上克隆抗生素生物合成基因的克隆抗生素生物合成基因的7个克隆策略个克隆策略检测克隆到标准宿主中的个别基因产物检测克隆到标准宿主中的个别基因产物利用产生菌阻断突变株的互补作用利用产生菌阻断突变株的互补作用利用突变克隆技术利用突变克隆技术连锁的抗生素抗性基因的克隆连锁的抗生素抗性基因的克隆用人工合成的寡核苷酸探测基因文库用人工合成的寡核苷酸探测基因文库直接克隆抗生素产生菌直接克隆抗生素产生菌DNA大片断到非产生菌中大片断到非产生菌中用一种抗生素的克隆用一
54、种抗生素的克隆DNA去探测相关抗生素的同源基因去探测相关抗生素的同源基因发酵工程3上第三节第三节 工业微生物菌工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏种的衰退、复壮与保藏一、微生物菌种的衰退一、微生物菌种的衰退u菌种的退化是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致菌种的退化是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株退化的一个从量变到质变的遗传变异过程。整个菌株退化的一个从量变到质变的遗传变异过程。u菌种的退化会使微生物个体和群体特征发生变化，其菌种的退化会使微生物个体和群体特征发生变化，其中最重要的使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢中最重要的使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发
55、酵周期延长、抗不良环境条件和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件的性能减弱。的性能减弱。发酵工程3上 菌种连续传代导致自发突变或回复突变是菌种发菌种连续传代导致自发突变或回复突变是菌种发生退化的直接原因。生退化的直接原因。u由于连续传代使培养物经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营由于连续传代使培养物经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是不断变化的，与处于休眠状态的培养物相比，养和环境等培养条件都是不断变化的，与处于休眠状态的培养物相比，细胞的自发突变率要高的多。菌株经过连续传代后，含突变基因的个细胞的自发突变率要高的多。菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。u培养基灭菌升、降温的不同，培养基存放时间的不同，采用老龄菌培养基灭菌升、降温的不同，培养基存放时间的不同，采用老龄菌和多核菌丝等都比较容易引起菌种退化。和多核菌丝等都比较容易引起菌种退化。1. 菌种衰退的原因菌种衰退的原因发酵工程3上发酵工程3上
