分析化学课件（上）：分子荧光_

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1、分子分子发光发光分析法分析法Molecular Emission Analysis 第五章荧光荧光是指一种是指一种发光现象发光现象。当某种常温。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是物质经某种波长的入射光（通常是紫紫外线外线）照射，吸收光能后进入激发态，）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即发出比入射光的的波长长的并且立即发出比入射光的的波长长的出射光；出射光； 停止照射，发光现象立即消失。停止照射，发光现象立即消失。 具有这种性质的具有这种性质的发射光就被称之为荧光发射光就被称之为荧光。 荧光显微镜荧光显微镜 用荧光抗体染色之原生动物用荧光抗体染色之原生动物螳螂虾通过发出色彩鲜艳螳螂虾通过

2、发出色彩鲜艳的荧光来警告对手或者吸的荧光来警告对手或者吸引配偶引配偶 K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 23061 nmgreen-fluorescent protein (GFP)由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息之中，让其随着这些需要跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症对大脑造成的损害、观察有害细菌的生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何产生分泌胰岛素的细胞。 2008年诺贝尔化学奖 下村修现年80岁的下村修1928年出生于日本京都府，1960年获得名古屋大学理学博士

3、学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。他1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。 马丁沙尔菲马丁沙尔菲出生于1947年，现年61岁，是美国哥伦比亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。 瑞典皇家科学院8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家马丁沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学奖，将均分1000万瑞典克朗（约合140万美元）奖金。帮助他们获奖的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实验带来革命，它发出的荧光

4、像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞层面的诸多反应。 一、分子荧光与磷光产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence二、仪器结构流程instrument and general process三、激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum四、荧光的产生与分子结构关系relation between fluorescence and molecular structure 五、影响荧光强度的因素factor influenced

5、 fluorescence六、荧光分析方法与应用fluorescence analysis and application主主 要要 内内 容容一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1. 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能

6、级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1、S2； 第一、第二、电子激发三重态 T1、T2；2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； S0T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小； 2.激发态基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径

7、传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光荧光：10-710-9s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3外转换l l 2T2内转换振动弛豫非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫：振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换内转换：同多重度

8、电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，通过自旋轨道耦合进行。辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射：荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为S1S0跃迁），发射波长为 2的荧光；10-710-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1； 磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基

9、态（T1S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0T1禁阻跃迁）S0激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫T1发光速度很慢：10-4100s。光照停止后，可持续一段时间。二二、仪器结构流程、仪器结构流程instrument and general process 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。 特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光光源源：灯和高压汞灯，染

10、料激光器(可见与紫外区)检测器检测器：光电倍增管。仪仪器器光光路路图图仪器框图仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；三、激发光谱与荧光三、激发光谱与荧光( (磷光磷光) )光谱光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.1.荧光荧光( (磷光磷光) )的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.2.荧光光谱荧光光谱( (或磷光光谱或磷光

11、光谱) ) 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2, 1)，产生不同吸收带，但均回到第第一一激激发发单单重重态态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2)。 c. . 镜像规则镜像规则通常荧光发射光谱

12、与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。 200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱四、荧光的产生与分子结构的关系四、荧光的产生与分子结构的关系relation between fluorescence and molecular structure 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现

13、荧光发射；1.荧光寿命和荧光效率荧光寿命和荧光效率荧荧光光寿寿命命（fluorescence life time）：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间。荧光量子产率（荧光量子产率（ fluorescence quantum yield）：2.2.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有强的紫外-可见吸收；（2）具有一定的荧光量子产率。3.3.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃跃迁迁类类型型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移苯苯萘萘蒽蒽

14、维生素维生素A205nm286nm356nm327nm278nm321nm404nm510nm 0.110.290.36（3）刚刚性性平平面面结结构构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。弱荧光物质弱荧光物质荧光加强荧光加强（4）取代基效应取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强 给电子取代基如NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高; 而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等吸电子取代基，可减弱分子电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭; 部分取代基对荧光的影响不明显，如R、S

15、O3H、NH3 等。五、影响荧光强度的因素五、影响荧光强度的因素 影响荧光强度的外部因素外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3. 溶液溶液pH溶液的酸度（pH值）对荧光物质的影响可以分两个方面： （1）对酸碱性物质的影响（）对酸碱性物质的影响（掌握掌握） 若荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液若荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化，而不同形体具有其各自特定的之

16、发生变化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺荧光光谱和荧光效率。例如苯胺（2） 对金属离子的影响（对金属离子的影响（了解了解） 对于金属离子与有机试剂生成的荧光配对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物，溶液合物，溶液pH值的改变会影响配合物的组成，值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。例如从而影响它们的荧光性质。例如Ga3+离子与离子与邻邻-二羟基偶氮苯，在二羟基偶氮苯，在pH34的溶液中形成的溶液中形成1:1配合物，能产生荧光。而在配合物，能产生荧光。而在pH67的溶的溶液中，则形成液中，则形成1 2的配合物，不产生荧光。的配合物，不产生荧光。4.4.散射光

17、的干扰散射光的干扰瑞利光瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，光子的运动方向发生改变，其波长与入射光相同。散散射射光光：由于光子与溶剂分子的相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同方向散射，称为散射光。 瑞利光的特点：瑞利光的特点：强度与波长的四次方成反比，即波长越短，瑞利散射光越强。瑞利光的消除：瑞利光的消除：因瑞利散射光波长与激发光波长相同，只要选择适当的荧光测定波长或选用滤光片即可消除其影响。拉曼光：拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向发生的同时，光子与物质分子能量交换，使光子能量发生改变，其波长可能长于入射光，也可能短于入射光。拉拉曼曼光光特特点点：波长较

18、长的拉曼光因其波长与物质的荧光波长相接近, 故对测定的干扰较大。拉曼光的消除：拉曼光的消除：由于拉曼光波长随激发光波长的改变而改变, 而荧光物质的荧光波长与激发光波长无关, 故通过选择适当的激发光波长，就可以将二者区分开。320nm448nm350nm448nm激发320nm硫酸奎宁激发350nm硫酸奎宁硫酸奎宁硫酸奎宁的荧光光谱的荧光光谱5.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭荧荧光光熄熄灭灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用引起荧光其哪个度降低或荧光强度与浓度偏离线性的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧荧光光熄熄灭灭剂剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合

19、物等。 熄灭原因熄灭原因：碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。（1）激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭；（2）荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物；（3）荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越而转变为三重态；（4）当荧光物质浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光自熄灭现象荧光自熄灭现象。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重；（5）溶液中溶解的氧分子能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭。荧光熄灭的原因荧光熄灭的原因 概念：概念：利用荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减小和熄灭剂的浓度呈线性关系这一性质建立的荧光分析法，称为荧光熄灭法。特点：特

20、点：荧光熄灭法比直接荧光法更灵敏、更有选择性。应用示例：应用示例：铝-桑色素配合物的荧光强度因微量氟离子的存在而引起荧光熄灭，利用这种性质可测定样品中微量氟离子的含量，这时溶液的荧光强度和氟离子浓度成反比。 荧光熄灭法荧光熄灭法六六、荧光分析方法与应用、荧光分析方法与应用fluorescence analysis and application1. 1. 特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级；为什么？ 检测下限：0.10.0001g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根

21、据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。2.2.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相

22、同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 化学发光化学发光 (CL)(CL) 化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态

23、激发到激发态从而产生发光的现象。七、化学发光法七、化学发光法生活中常见的化学发光现象生活中常见的化学发光现象化学发光的基本条件化学发光的基本条件反应必须快速释放足够大的能量，以引起电子激发反应历程要有利于激发态产物的形成激发态分子要以辐射跃迁方式而非热交换方式返回基态化学发光分析方法的特点化学发光分析方法的特点仪器简单、检测限低、线性范围宽； 不需要外来的光源，减少了瑞利散射和拉曼散射，降低了噪音信号的干扰，提高了检测的灵敏度，扩大了线性动态范围；有时选择性差选择性差，会对一个系列的化合物做出反应，而不是针对单个的某一化合物；化学发光的发射强度依赖于各种环境因素依赖于各种环境因素，在不同的环境

24、体系中，发射强度和时间的曲线有较大的差别，所以必须严格控制外界的各种因素； 化学发光分析法的分类化学发光分析法的分类直接化学发光直接化学发光 A + B C* + D C* C + h 例: NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + h化学发光的分类化学发光的分类 间接化学反应发光间接化学反应发光 A + B C* + D C* + E E* + C E* E + h常见的化学发光体系常见的化学发光体系1、 鲁米诺体系鲁米诺体系(5-氨基氨基-临苯二甲酰肼）临苯二甲酰肼）氧化剂: H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 Fe(CN)63-.催化剂: 过氧化酶 氧化血红素

25、过渡金属离子(Co2+ Cu2+ Fe3+)2、 亚硫酸体系亚硫酸体系氧化剂: KMnO4 Ce(IV) in acid Mn(III)增强剂: 三价镧系元素常见的化学发光分析方法常见的化学发光分析方法高锰酸钾氧化法MnO4- +R+H+ H2O+CO2+Mn(一) *Mn(一) * Mn(一) +hv(=542nm)硫酸和磷酸是常用的高锰酸钾氧化法的酸性介质一些化学添加剂比如感光剂和有机介质的存在可以增强发光强度，甚至几个数量级 常见的化学发光分析方法常见的化学发光分析方法钌(II)-联吡啶配合物氧化法 Ru(bipy)33+这个复合物性质并不稳定，需要现配现用Ru(bipy)33+试剂 在

26、硫酸介质中，它能与氧化剂产生化学发光，加入某些有机物可以增强其发光强度，且发光强度与有机化合物浓度呈线性关系使用Ru(bipy)33+作为检测试剂的药物，它们的结构中都含有氮原子 本章小结本章小结1.掌握分子荧光及磷光产生的条件及原理；熟悉分子从激发态释放能量返回基态的主要方式。 2. 掌握两种特征荧光光谱的概念及三个特征。3. 掌握分子结构与荧光的关系；熟悉荧光寿命和荧光效率的概念，熟悉影响荧光强度的外部因素。4. 熟悉荧光强度与荧光物质浓度的关系及应用条件，了 解定量分析的两个常用方法。5. 对比紫外-可见分光光度法的仪器组成，熟悉荧光分析仪的主要部件和仪器特点。6、了解化学发光法作业作业P101思考题2、3、5、8完成习题册相关内容