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1、单核苷酸多态性及其应用单核苷酸多态性及其应用核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNP的概念的概念 单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（single nucleotide single nucleotide polymorphism,SNPpolymorphism,SNP) ) ) ) 是指基因组是指基因组DNADNA序列中由于单个核苷酸的突变序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。而引起的多态性。同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异基的变化，主要表现为基因组核苷酸
2、水平上的变异引起的引起的DNADNA序列多态性序列多态性 。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件Single nucleotide polymorphism核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNP的特征 SNPSNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的占所有已知多态性的90%90%以上，在人类基因组中广以上，在人类基因组中广泛存在，人类泛存在，人类DNADNA中每中每300-1000bp300-1000bp就有一个就有一个SNP.SNP. 因此，一个人类个体大约携带因此，一个人类个体大约携带300300万万-100
3、0-1000万个万个SNPsSNPs。 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNPSNP的特征的特征一个一个SNPSNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化，化， 作为一种碱基的替换，大多数为转换（作为一种碱基的替换，大多数为转换（CTCT，GAGA），也可能是颠换。），也可能是颠换。 具有转换型变异的具有转换型变异的SNPSNP约占约占SNPSNP总量的总量的2 23 3左右。左右。 转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而且在且在CGCG序列上出现最为频繁，多是发生序列上出现最为频繁，多是发生CTCT
4、的转换，的转换，原因是原因是CGCG中的中的C C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替是甲基化的，它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。换为胸腺嘧啶。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件 SNP SNP大都表现为二等位基因（大都表现为二等位基因（bialletic)bialletic)多多态性态性, ,即在该位置只存在两种不同的碱基。即在该位置只存在两种不同的碱基。 位于染色体上某一区域的一组相关联的位于染色体上某一区域的一组相关联的SNPSNP等等位位点被称作单倍型位位点被称作单倍型(haplotype)(haplotype)，相邻，相邻SNPsSNPs的的等位位点倾向于以一个整体遗传给
5、后代等位位点倾向于以一个整体遗传给后代. .核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件根据SNP在基因组中的分布位置可分为: 基因编码区SNP(cSNP) 基因调控区SNP(pSNP) 基因间随机编码区SNP(rSNP) 等三类。因为编码区内的变异率占周围序列的1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件 cSNP又可分为2种： 同义cSNP(synonymous cSNP)： 非同义cSNP(non-synonymous cSNP)核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件同义同义
6、cSNPcSNP： SNP SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；基的含义相同；非同义非同义cSNPcSNP： 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。 位于基因调控区的位于基因调控区的SNPSNP则会影响基因表达量则会影响基因表达量的多少，因此，这两类的多少，因此
7、，这两类SNPSNP在功能和疾病发生发在功能和疾病发生发展方面具有更重要的意义。展方面具有更重要的意义。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNPSNP的检测方法的检测方法 单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性(single-strand conformational (single-strand conformational polymorphism,SSCP)polymorphism,SSCP) 原理： 单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。核苷酸多态性及其应用
8、课件核苷酸多态性及其应用课件SNP的检测方法的检测方法变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel denaturing gradient gel electrophoresis,DGGEelectrophoresis,DGGE) ) 原理原理: : 当双链当双链DNADNA在变性梯度凝胶中进行到与在变性梯度凝胶中进行到与DNADNA变性变性温度一致的凝胶位置时，温度一致的凝胶位置时，DNADNA发生部分解链，电泳发生部分解链，电泳迁移率下降，迁移率下降，DNADNA链中有一个碱基改变时，会在不链中有一个碱基改变时，会在
9、不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。而被分离。 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNPSNP的检测方法的检测方法 TaqmanTaqmanTaqmanTaqman法法法法 以荧光共振能量传递以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy (fluorescent resonance energy transfer,FRETtransfer,FRET) )为基础的检测方法。为基础的检测方法。 在在PCRPCR反应中，将供者反应中，将供者- -受者染料对分别结合到受者染料对分别结合到Taqma
10、nTaqman探探针的两端，探针未与目标序列结合时，通过针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRETFRET作用使供者作用使供者不发荧光；完全互补配对后，由于不发荧光；完全互补配对后，由于TaqTaq DNA DNA聚合酶具有聚合酶具有55核核酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及结合的紧密程度及TaqTaq DNA DNA聚合酶切割供者的活性，也就影聚合酶切割供者的活性，也就影响了供者的荧光释放量，从而使碱
11、基突变链和正常链得以区响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链得以区分。分。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件供者受者53Taqman 探针探针核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件供者受者53Taqman 探针探针核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件供者受者53引物目标序列核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件受者53引物供者目标序列核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNPSNP的检测方法的检测方法 分子信标分子信标分子信标分子信标(molecular beacon)(molecular beacon)(molecular b
12、eacon)(molecular beacon)法法法法 分子信标是一个分子信标是一个U U型的单链核苷酸探针（探针序列内型的单链核苷酸探针（探针序列内部可有一定程度的互补配对），在探针两端也加上供者部可有一定程度的互补配对），在探针两端也加上供者- -受者染料对，受者染料对，U U型探针使两染料靠近，通过型探针使两染料靠近，通过FRETFRET作用使供作用使供者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料分离，使得供者的荧光亮增加，分离，使得供者的荧光亮增加，如果目标序列中存在错配如果目标序列中存在错配碱基，就会影响探针与其结合，从而影响
13、到供者的荧光亮，碱基，就会影响探针与其结合，从而影响到供者的荧光亮，使碱基突变链和正常链得以区分。使碱基突变链和正常链得以区分。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件供者受者核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件供者受者核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件焦磷酸测序法 焦磷酸测序法焦磷酸测序法(pyrosequencing)(pyrosequencing)是一种不依是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依赖赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNADNA的荧光标记的荧光标记/ /激发激发/ /检测体系的序列分析技术，适用于已知序列检测体系的序列分析技术，适用于已知序列的的D
14、NADNA片段进行验证分析，适用于已知片段进行验证分析，适用于已知SNPSNP的序列的序列验证及基因分型。验证及基因分型。 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件 焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的酶级联反应系中的酶级联反应: : 包括包括DNADNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶酸酶; ; 反应底物为反应底物为adenosine adenosine 5phosphosulfate(APS)5phosphosulfate(APS)和萤光素。和萤光素。 反应体系还包括待测序的反应体系还包括待测序的
15、DNADNA单链和测序引物单链和测序引物。 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件 在每一轮测序反应中，加入一种在每一轮测序反应中，加入一种dNTPdNTP。 如该如该dNTPdNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTPdNTP掺入到掺入到引物链中并释放焦磷酸基团引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)(PPi)。 掺入的掺入的dNTPdNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时dATPdATP由由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)deoxyadenosine alf
16、a-thio triphosphale(dATPaS)替代替代 因为因为DNADNA聚合酶对聚合酶对dATPaSdATPaS的催化效率比对的催化效率比对dATPdATP的催化效的催化效率高，且率高，且dATPdATP是萤光素酶的底物，是萤光素酶的底物，dATPctSdATPctS不是。不是。 硫酸化酶催化硫酸化酶催化APSAPS和和PPiPPi形成形成ATPATP，其物质的量和焦磷酸，其物质的量和焦磷酸一致。一致。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件 ATPATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素(oxyluclferin)(oxyluclfe
17、rin)的转化，氧化萤光素发出与的转化，氧化萤光素发出与ATPATP含量成正含量成正比的可见光信号。比的可见光信号。 光信号由光信号由CCDCCD摄像机检测并通过相应的软件得到反映。摄像机检测并通过相应的软件得到反映。 每个峰的高度每个峰的高度( (光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正比，比，ATPATP和未掺入的和未掺入的dNTPdNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号，由双磷酸酶降解，猝灭光信号，并再生反应体系，加入另一种并再生反应体系，加入另一种dNTPdNTP进行下一轮反应。随着进行下一轮反应。随着以上过程的循环进行，互补以上过程的循环进行，互补DNADNA链
18、合成，链合成，DNADNA序列信号峰确序列信号峰确定。定。 该技术分析系统自动化程度高，通量大，速度快，易该技术分析系统自动化程度高，通量大，速度快，易于建立标准化操作，适合大规模于建立标准化操作，适合大规模SNPSNP研究及基因分型。研究及基因分型。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNPSNP的检测方法的检测方法 动态等位基因特异性杂交法动态等位基因特异性杂交法动态等位基因特异性杂交法动态等位基因特异性杂交法(dynamic allele specific (dynamic allele specific (dynamic al
19、lele specific (dynamic allele specific hybridization,DASHhybridization,DASHhybridization,DASHhybridization,DASH) ) ) ) 用用生生物物素素标标记记一一条条引引物物进进行行目目的的DNADNA扩扩增增，PCRPCR产产物物经经生生物物素素结结合合于于链链亲亲和和素素包包裹裹的的微微孔孔板板壁壁，不不带带生生物物素素标标记记的的链链用用碱碱洗洗掉掉。加加入入探探针针和和荧荧光光染染料料，荧荧光光染染料料SYBR SYBR GreenGreen可可特特异异性性地地插插入入双双链链中中，
20、在在激激发发光光的的作作用用下下发发出出荧荧光光，而而在在单单链链中中则则不不能能；探探针针和和产产物物单单链链杂杂交交后后，在在仪仪中中微微孔孔板板持持续续缓缓慢慢升升温温，同同时时连连续续检检测测各各孔孔中中荧荧光光强强度度，将将温温度度及及各各孔孔中中对对应应的的荧荧光光强强度度输输入入计计算算机机, , 基基因因型型与与探探针针完完全全匹匹配配的的样样品品在在较较高高温温度度才才解解链链, ,因因此此在在较较高高温温度度才才得得到到d(Fluorescence)/dtd(Fluorescence)/dt峰峰; ;与与探探针针不不完完全全匹匹配配的的样样品品则则在在较较低低温温度度时时就
21、就得得到到d(Fluorescence)/dtd(Fluorescence)/dt峰峰，杂杂合合子子则得到两个峰。则得到两个峰。 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件PCR扩增核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件链亲和素包裹的微孔板+碱变性核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件持续缓慢升温核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNP的检测方法的检测方法 变性高效液相色谱变性高效液相色谱变性高效液相色谱变性高效液相色谱(Denaturing High (Denaturing High Performanc
22、e Liquid Chromatography, Performance Liquid Chromatography, DHPLC) DHPLC) 原理原理原理原理核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNPSNP的检测方法的检测方法 - - - -质谱分析法质谱分析法质谱分析法质谱分析法(matrix-assisted laser (matrix-assisted laser (matrix-
23、assisted laser (matrix-assisted laser desorptiondesorptiondesorptiondesorption/ionization time-flight mass /ionization time-flight mass /ionization time-flight mass /ionization time-flight mass spectrometry) spectrometry) spectrometry) spectrometry) 原原理理 ：适适当当大大小小的的有有机机分分子子晶晶体体( (介介质质) )用用接接近近其其吸吸收收
24、光光谱谱的的激激光光瞬瞬时时激激发发，会会发发生生能能量量转转移移及及解解吸吸附附过过程程。如如将将低低浓浓度度的的蛋蛋白白质质或或核核酸酸分分子子加加入入介介质质溶溶液液中中并并加加以以干干燥燥，蛋蛋白白质质或或核核酸酸分分子子将将嵌嵌入入到到介介质质晶晶体体中中。将将该该晶晶体体放放入入质质谱谱仪仪的的真真空空小小室室，用用瞬瞬时时( (纳纳秒秒) )强强激激光光激激发发，晶晶体体中中的的蛋蛋白白质质或或核核酸酸分分子子就就会会解解吸吸附附，转转变变成成气气相相的的离离子子态态，此此时时可通过质谱分析这些离子。可通过质谱分析这些离子。 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNP
25、的检测方法的检测方法 DNADNA芯片技术（芯片技术（芯片技术（芯片技术（DNA chipDNA chip） 将许多已知序列的寡核苷酸将许多已知序列的寡核苷酸DNADNA排列在排列在1 1块集成电路板上，块集成电路板上，彼此之间重叠彼此之间重叠1 1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常光标记的正常DNADNA和突变和突变DNADNA分别与分别与2 2块块DNADNA芯片杂交，由于至芯片杂交，由于至少存在少存在1 1个碱基的差异，正常和突变的个碱基的差异，正常和突变的DNADNA将会得到不同的杂将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两
26、种交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNADNA分子产生的荧分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。非常重要的作用。 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNPSNP的应用的应用 SNP作图 利用SNP图谱搜寻遗传致病基因 SNP在药物设计中的作用 SNP在法医学中的应用 人类起源迁移进化的研究核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件 1人类基因单体型图的绘制 大多数染色体区域具
27、有少数几个常见的单体型，大多数染色体区域具有少数几个常见的单体型，代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。 某些染色体区域可以有很多某些染色体区域可以有很多SNPSNP位点，但是只用位点，但是只用少数几个标签少数几个标签SNPsSNPs，就能够提供该区域内大多数的，就能够提供该区域内大多数的遗传多态性模式。遗传多态性模式。 绘制人类基因单体型图的目的就是描述人类常绘制人类基因单体型图的目的就是描述人类常见的遗传多态性模式和染色体上具有成组紧密关联见的遗传多态性模式和染色体上具有成组紧密关联SNPsSNPs的区域。的区域。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸
28、多态性及其应用课件 2002 2002年年1010月，国际人类基因组单体型图计划月，国际人类基因组单体型图计划(HapMap(HapMap计划计划) )正式启动，截至目前已有超过正式启动，截至目前已有超过150150万万SNPsSNPs被精确定位于各染色体上，并且已根据这些被精确定位于各染色体上，并且已根据这些SNPsSNPs对来自对来自4 4个不同人种的个不同人种的269269份份DNADNA样品进行了基样品进行了基因分型。因分型。 后期目标是要使总密度达到每后期目标是要使总密度达到每500bP500bP有一个有一个SNPSNP。通过不同个体基因组通过不同个体基因组DNADNA的基因分型和频
29、率计算，的基因分型和频率计算，绘制更加精密的单倍型图谱。人类基因单体型图的绘制更加精密的单倍型图谱。人类基因单体型图的绘制完成，将为我们精确定位复杂疾病绘制完成，将为我们精确定位复杂疾病( (如糖尿病，如糖尿病，癌症，心脏病，脑猝和哮喘等癌症，心脏病，脑猝和哮喘等) )易感基因提供重要易感基因提供重要信息。信息。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件2 SNP与疾病易感基因的相关性分析 当一个遗传标记的频率在患者中明显超过非当一个遗传标记的频率在患者中明显超过非患者时就表明该标记可能与这种疾病相关、随患者时就表明该标记可能与这种疾病相关、随着大量代谢通路和上百万着大量代谢通路和上百万
30、SNPsSNPs的确认，的确认，SNPSNP作为新作为新一代遗传标记在人类疾病研究中显示出极高的潜一代遗传标记在人类疾病研究中显示出极高的潜在价值。在价值。 已经有高血压、哮喘、类风湿关节炎、肺癌、已经有高血压、哮喘、类风湿关节炎、肺癌、前列腺癌等许多易感基因通过前列腺癌等许多易感基因通过SNPSNP的相关研究被发的相关研究被发现。现。 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件3指导用药与药物设计 由于SNP能够充分反映个体间的遗传差异，所以诵过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的相天性研究，可能阐明遗传因素对药效的影响，因此可能建立与基因型相关的治疗方案对患者施行个性化用药。另外，随着SNP的研究与药物基因组学的结合根据特定的基因型来设计药物将成为可能。核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件SNPSNP数据库数据库 美国国立生物技术信息中心 http:/ 德国的HGBAS网站 http:/ 日本JST的数据库 核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件核苷酸多态性及其应用课件
