《酶工程：10 酶的分析与检测（电泳、质谱等）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶工程：10 酶的分析与检测（电泳、质谱等）（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、酶的分析技术 电泳、质谱李志刚李志刚前前 言言19371937年，瑞典科学家年，瑞典科学家TiseliusTiselius设计了世界上第一台设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于电泳仪，建立了移界电泳法，并于19481948年荣获诺贝年荣获诺贝尔奖。尔奖。7070年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1 1、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。 2 2、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。 3 3、扩大应用范围。、扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用
2、于生命科学各个领域。各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。电泳分类纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳（常用）等电聚焦电泳2D电泳的用途分析微量蛋白的制备电泳技术的基本原理电泳技术的基本原理 电泳：电泳：电泳：电泳：带电粒子在电场中的定向移动。带电粒子在电场中的定向移动。带电粒子在电场中的定向移动。带电粒子在电场中的定向移动。V V V V: : : :泳动速度泳动速度泳动速度泳动速度cm/cm/cm/cm/秒秒秒秒orororor分分分分d d d d: : : :泳动距离泳动距离泳动距离泳动距离cmcmcmcmt t t t: : : :电泳时间电泳时间电泳时间电泳时间 ( ( ( (秒秒秒
3、秒/ / / /分分分分) ) ) )E E E E: : : :电场强度电场强度电场强度电场强度 伏特伏特伏特伏特/cm/cm/cm/cm电泳技术的基本原理电泳技术的基本原理u u u u: : : :泳动率泳动率泳动率泳动率orororor泳动度泳动度泳动度泳动度(cm/(cm/(cm/(cm/伏伏伏伏秒秒秒秒orororor分分分分) ) ) )U U U U: : : :电压电压电压电压 常压常压常压常压(100(100(100(100500v)500v)500v)500v) 高压高压高压高压(500(500(500(50010000v)10000v)10000v)10000v)仅需几
4、分钟仅需几分钟仅需几分钟仅需几分钟l l l l: : : :支持场的长度支持场的长度支持场的长度支持场的长度 ( ( ( (有效长度有效长度有效长度有效长度) ) ) )电泳技术的基本原理电泳技术的基本原理 影响泳动率影响泳动率影响泳动率影响泳动率u u u u的因素的因素的因素的因素 内因：内因：内因：内因：1 1 1 1. . . .净电荷净电荷净电荷净电荷 2 2 2 2. . . .质点大小质点大小质点大小质点大小 3 3 3 3. . . .质点形状质点形状质点形状质点形状 外因外因外因外因：1 1 1 1. . . .电压电压电压电压V V V V ( U/L)( U/L)( U
5、/L)( U/L) 2 2 2 2. . . .缓冲液的缓冲液的缓冲液的缓冲液的pH (pHpH (pHpH (pHpH (pH恒定恒定恒定恒定) ) ) ) 3 3 3 3. . . .离子强度离子强度离子强度离子强度I I I I 最适最适最适最适:0.02:0.02:0.02:0.02- - - -0.20.20.20.2 4 4 4 4. . . .电渗：液体对固体支持物的相对移动电渗：液体对固体支持物的相对移动电渗：液体对固体支持物的相对移动电渗：液体对固体支持物的相对移动SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 原理原理原理原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁蛋白质
6、在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。等因素。等因素。等因素。 1967196719671967年，年，年，年，ShapiroShapiroShapiroShapiro等人发现，如果在聚丙烯酰等人发现，如果在聚丙烯酰等人发现，如果在聚丙烯酰等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠胺凝胶
7、系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfatesodium dodecyl sulfatesodium dodecyl sulfatesodium dodecyl sulfate，简称，简称，简称，简称SDSSDSSDSSDS），则蛋白），则蛋白），则蛋白），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。与所带电荷和形状无关。与所带电荷和形状无关。与所带电荷和形状无关。
8、6. SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 原理原理原理原理 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质PrPrPrPr溶液中溶液中溶液中溶液中 加巯基乙醇加巯基乙醇加巯基乙醇加巯基乙醇 加加加加SDS,SDS,SDS,SDS,打开氢键与疏水键打开氢键与疏水键打开氢键与疏水键打开氢键与疏水键 复合物复合物复合物复合物 1.4g 1.4g 1.4g 1.4g ： 1g 1g 1g 1g 加入加入加入加入SDSSDSSDSSDS为为为为SO4-2SO4-2SO4-2SO4-2改变了改变了改变了改变了PrPrPrPr的荷电性质的荷电性质的荷电性质的荷电性质. . . .SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定
9、蛋白质分子量SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 原理原理原理原理 各种各种各种各种SDS-PrSDS-PrSDS-PrSDS-Pr均带相同密度的负电荷，其荷电均带相同密度的负电荷，其荷电均带相同密度的负电荷，其荷电均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原超过了原超过了原超过了原PrPrPrPr，消除了不同，消除了不同，消除了不同，消除了不同PrPrPrPr荷电差异。荷电差异。荷电差异。荷电差异。 加入加入加入加入SDSSDSSDSSDS，改变了，改变了，改变了，改变了PrPrPrPr的构象，的构象，的构象，的构象，SDS-PrSDS-PrSDS-PrSDS-Pr为长椭圆为长椭圆为长椭
10、圆为长椭圆棒，各种短轴约为棒，各种短轴约为棒，各种短轴约为棒，各种短轴约为1.8nm1.8nm1.8nm1.8nm。 长轴：长轴：长轴：长轴：MrMrMrMr，均呈正比例，所以，均呈正比例，所以，均呈正比例，所以，均呈正比例，所以 常数常数常数常数 斜率斜率斜率斜率 迁移率迁移率迁移率迁移率SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 影响迁移率的因素影响迁移率的因素影响迁移率的因素影响迁移率的因素 二硫键是否完全被还原：二硫键是否完全被还原：二硫键是否完全被还原：二硫键是否完全被还原： 只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情只有在蛋白质分子内的二
11、硫键被彻底还原的情只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，况下，况下，况下，SDSSDSSDSSDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并才能定量地结合到蛋白质分子上去，并才能定量地结合到蛋白质分子上去，并才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在
12、电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。 SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 影响迁移率的因素影响迁移率的因素影响迁移率的因素影响迁移率的因素 溶液中溶液中溶液中溶液中SDSSDSSDSSDS的浓度：溶液中的的浓度：溶液中的的浓度：溶液中的的浓度：溶液中的SDSSDSSDSSDS的总量，至少的总量，至少的总量，至少的总量，至少要比蛋白质的量高要比蛋白质的量高要比蛋白质的量高要比蛋白质的量高3 3 3 3倍，一般需高达倍，一般需高达倍，一般需高达倍，一般
13、需高达10101010倍以上。倍以上。倍以上。倍以上。 溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过高不能超过高不能超过高不能超过0.260.260.260.26，因为，因为，因为，因为SDSSDSSDSSDS在水溶液中是以单体和在水溶液中是以单体和在水溶液中是以单体和在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，分子团的混合体而存在的，分子团的混合体而存在的，分子团的混合体而存在的，SDSSDSSDSSDS结合到蛋白质分子结合到蛋白质分子结合到蛋白质分子结合到蛋白质分子
14、上的量，仅决定于平衡时上的量，仅决定于平衡时上的量，仅决定于平衡时上的量，仅决定于平衡时SDSSDSSDSSDS单体的浓度而不是总单体的浓度而不是总单体的浓度而不是总单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，浓度，在低离子强度的溶液中，浓度，在低离子强度的溶液中，浓度，在低离子强度的溶液中，SDSSDSSDSSDS单体具有较高单体具有较高单体具有较高单体具有较高的平衡浓度。的平衡浓度。的平衡浓度。的平衡浓度。SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 影响迁移率的因素影响迁移率的因素影响迁移率的因素影响迁移率的因素 在凝胶电泳中，影响迁移率在凝胶电泳中，影响迁移率在凝胶电泳中，影响迁
15、移率在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过的因素较多，而在制胶和电泳过的因素较多，而在制胶和电泳过的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控程中，很难每次都将各项条件控程中，很难每次都将各项条件控程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用制得完全一致，因此，用制得完全一致，因此，用制得完全一致，因此，用SDS-SDS-SDS-SDS-凝凝凝凝胶电泳法测定分子量，每次测定胶电泳法测定分子量，每次测定胶电泳法测定分子量，每次测定胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不样品必须同时做标准曲线，而不样品必须同时做标准曲线，而不样品必须同时做标准曲线，
16、而不得利用另一次电泳的标准曲线。得利用另一次电泳的标准曲线。得利用另一次电泳的标准曲线。得利用另一次电泳的标准曲线。 SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 注意注意注意注意 有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如两条以上肽链（如两条以上肽链（如两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它胰凝乳蛋白酶）组成的，它胰凝乳蛋白酶）组成的，它胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在们在们在们在SDSSDSSDSSDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条和巯基乙醇的作用下，解离
17、成亚基或单条和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，肽链。因此，对于这一类蛋白质，肽链。因此，对于这一类蛋白质，肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-SDS-SDS-SDS-凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，不是完整分子的分子量。为了得到更
18、全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与数目等，与数目等，与数目等，与SDS-SDS-SDS-SDS-凝胶电泳的结果互相参照。凝胶电泳的结果互相参照。凝胶电泳的结果互相参照。凝胶电泳的结果互相参照。SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 电泳装置电泳装置电泳装置电泳装置 SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 剥胶与染色剥胶与染色剥胶与染色剥胶与染色 电泳结束后，关闭电源开关，从电泳槽中取电泳结束后，关闭电源开关，从电泳槽中取
19、电泳结束后，关闭电源开关，从电泳槽中取电泳结束后，关闭电源开关，从电泳槽中取下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器吸满蒸馏水，将针头插入凝胶与玻板之间，沿玻吸满蒸馏水，将针头插入凝胶与玻板之间，沿玻吸满蒸馏水，将针头插入凝胶与玻板之间，沿玻吸满蒸馏水，将针头插入凝胶与玻板之间，沿玻板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注人，最后注入少板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注人，最后注入少板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注人，最后注入少板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注人，最后注入少量空气，取出针头，将
20、两玻板轻轻揭开后即可取量空气，取出针头，将两玻板轻轻揭开后即可取量空气，取出针头，将两玻板轻轻揭开后即可取量空气，取出针头，将两玻板轻轻揭开后即可取出凝胶板，将之置培养皿中，冲洗胶面后，加入出凝胶板，将之置培养皿中，冲洗胶面后，加入出凝胶板，将之置培养皿中，冲洗胶面后，加入出凝胶板，将之置培养皿中，冲洗胶面后，加入染色液，染色染色液，染色染色液，染色染色液，染色5h5h5h5h或过夜。或过夜。或过夜。或过夜。6. SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 染色染色染色染色 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白架膜架膜架膜架膜加盖加盖加盖加盖接导线，开机接导线
21、，开机接导线，开机接导线，开机醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白 电泳仪器电泳仪器电泳仪器电泳仪器等电聚焦等电聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF)(Isoelectro focusing IEF or EF) 原理原理原理原理 PrPrPrPr为两性电解质，不同为两性电解质，不同为两性电解质，不同为两性电解质，不同PrPrPrPr其其其其aaaaaaaa的数量、种的数量、种的数量、种的数量、种类及占比例不同，因此类及占比例不同，因此类及占比例不同，因此类及占比例不同，因此pIpIpIpI不同，不同，不同，不同，pIpIpIpI范围窄且
22、净范围窄且净范围窄且净范围窄且净电荷为零，因此依电荷为零，因此依电荷为零，因此依电荷为零，因此依pIpIpIpI分离分离分离分离PrPrPrPr。 EFEFEFEF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流是在凝胶中加两性载体电解质，通直流是在凝胶中加两性载体电解质，通直流是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pHpHpHpH梯度梯度梯度梯度( ( ( (连续的连续的连续的连续的, , , ,稳定的稳定的稳定的稳定的, , , ,线性的线性的线性的线性的pH)pH)pH)
23、pH)。等电聚焦等电聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF)原理原理 当当PrPr在电场中迁移到它的在电场中迁移到它的PIPI时，由于净电时，由于净电荷为零，不再移动。荷为零，不再移动。 如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它回到会重新吸引它回到pIpI位置。因此位置。因此PrPr只能在只能在pIpI位位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。聚焦。 只要凝胶中的只要凝胶中的pHpH梯度范围足够窄。便可将梯度范围足够窄。便可将pIpI相近的相近的PrPr分开，分开，EFEF是电
24、泳技术中分辨率最高是电泳技术中分辨率最高的技术。的技术。等电聚焦等电聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF)方法（方法（EFEF的关键）的关键） 载体两性电解质载体两性电解质CA CA 分辨率分辨率0.01pH0.01pH 固相固相pHpH梯度梯度(1975(1975年年)IPG)IPG 以具弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物以具弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物 CH2CHCONHR CH2CHCONHR R=COOH R=COOH R=4 R=4级氨基级氨基 R R为弱酸为弱酸oror弱碱弱碱, ,形成缓冲体系形成缓冲体系等电聚焦等电聚焦(Isoelectro focus
25、ing IEF or EF)(Isoelectro focusing IEF or EF) 方法（方法（方法（方法（EFEFEFEF的关键）的关键）的关键）的关键） 体系分辨率达体系分辨率达体系分辨率达体系分辨率达0.001pH0.001pH0.001pH0.001pH p p p pH H H H梯度范围最窄可为梯度范围最窄可为梯度范围最窄可为梯度范围最窄可为0.01pH/cm0.01pH/cm0.01pH/cm0.01pH/cm CAIEFCAIEFCAIEFCAIEF是两性分子是两性分子是两性分子是两性分子, , , ,在凝胶聚合时形成两性分子在凝胶聚合时形成两性分子在凝胶聚合时形成两性
26、分子在凝胶聚合时形成两性分子在电场中在电场中在电场中在电场中,CA,CA,CA,CA迁移到自己的迁移到自己的迁移到自己的迁移到自己的pIpIpIpI而形成而形成而形成而形成pHpHpHpH梯度梯度梯度梯度. . . .双向电泳简介双向电泳简介l2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术蛋白质的技术 。l第一向第一向等点聚焦等点聚焦(IEF)pH梯度载体梯度载体pIl第二向第二向十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)SDS作为变性剂和助溶剂作为变性剂和助溶剂分子量分子量样品样品等点聚焦等点聚焦( (第一向第一向) )双
27、向电泳的基本原理与流程示意双向电泳的基本原理与流程示意分子量分子量pH 梯度梯度(pI)SDS-PAGE两性电解质两性电解质pH 9 -pH 3 +聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺第二向第二向双向电泳具体步骤双向电泳具体步骤样品制备样品制备缓冲液的配制缓冲液的配制IPG条重泡涨及上样条重泡涨及上样第一向：第一向：IEFIPG条平衡条平衡平衡缓冲液平衡缓冲液(还原还原)平衡缓冲液平衡缓冲液(巯烷基化巯烷基化)第二向：第二向：SDS-PAGE胶条染色胶条染色成像及图像分析成像及图像分析IPG（immobilized pH gradient ）凝胶的图像处理分析凝胶的图像处理分析典型流程典型流程凝胶图像的扫描凝
28、胶图像的扫描图像加工图像加工斑点检测和定量斑点检测和定量凝胶配比凝胶配比数据分析数据分析数据呈递和解释数据呈递和解释2-DE数据库的建立数据库的建立2-DE 分离的可溶性分离的可溶性 E. coli 蛋白蛋白 凝胶干燥技术凝胶干燥技术凝胶干燥技术凝胶干燥技术 凝胶扫描技术凝胶扫描技术凝胶扫描技术凝胶扫描技术借助薄层扫描借助薄层扫描借助薄层扫描借助薄层扫描仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳条带
29、转换成峰图。条带转换成峰图。条带转换成峰图。条带转换成峰图。 凝胶成像技术凝胶成像技术凝胶成像技术凝胶成像技术通过图像采集通过图像采集通过图像采集通过图像采集和图像分析，利用计算机程序自动和图像分析，利用计算机程序自动和图像分析，利用计算机程序自动和图像分析，利用计算机程序自动识别图中所有可能条带。识别图中所有可能条带。识别图中所有可能条带。识别图中所有可能条带。 凝胶印渍转移技术凝胶印渍转移技术凝胶印渍转移技术凝胶印渍转移技术SouthernSouthernSouthernSouthern Blot Blot Blot Blot，Northern BlotNorthern BlotNorth
30、ern BlotNorthern Blot，Western BlotWestern BlotWestern BlotWestern Blot电泳相关技术电泳相关技术蛋白质质谱技术蛋白质质谱技术质谱基础质谱基础样品样品离子源离子源质量分析器质量分析器离子检测器离子检测器固体固体液体液体蒸汽蒸汽形成离子形成离子(带电分子带电分子)电离电离质量分选质量分选(过滤过滤)检测检测根据根据m/z分选离子分选离子数据处理数据处理质谱质谱检测离子检测离子基本步骤基本步骤:1. 样品离子化样品离子化 2. 根据质量根据质量(m/z)不同分离离子不同分离离子3. 检测每种质量离子的数目检测每种质量离子的数目 4.
31、 收集、处理数据得到质谱图收集、处理数据得到质谱图 质谱的评价指标质谱的评价指标质量范围质量范围速度速度灵敏度灵敏度分辨率分辨率精确度精确度+自由漂移区自由漂移区检测器检测器基基质辅助激光解吸助激光解吸电离离飞行行时间质谱(MALDI-TOF-MS)样品探针样品探针激光激光335 nmm/z相相对强度度MH+MH+MH+特点特点：灵敏度高灵敏度高准确度高准确度高分辨率高分辨率高质量范围广质量范围广图谱简明图谱简明速度快速度快1、鉴定和注释蛋白质的路线、鉴定和注释蛋白质的路线 通过肽质谱指纹图（通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配）和
32、数据库搜寻匹配 通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定定鸟枪法蛋白质组学鸟枪法蛋白质组学 1234.5396 783.9147 375.2561多肽多肽 已测得质已测得质 谱数据或理论谱数据或理论 质谱质谱 数据数据MALDI-TOF检测的多肽指纹检测的多肽指纹 胰酶消化胰酶消化凝胶凝胶蛋白质数据库数据库?123比较比较: :? 是否相同是否相同 ?质谱质谱3235.2256 肽质谱指纹图在数据库中匹配肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因不成功的可能原因样样品品量量太太少少，PMF图图信信噪噪比比太太低低，输输入入库库中中搜寻的数据质量不好。搜寻的数据
33、质量不好。2-DE胶胶上上所所取取的的一一个个蛋蛋白白质质点点并并非非单单一一蛋蛋白白质质，所所获获PMF图图实实际际上上是是两两个个以以上上蛋蛋白白质质的的混合图。混合图。 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染操作中角蛋白或其他蛋白质的污染蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载未有记载所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多段多 未知的新蛋白质未知的新蛋白质 数据库规模太小数据库规模太小 氨基酸序列氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白质数据库蛋白质数据库？查询？查询串联质谱图串联质谱图从头测序从头测序输入输入输出输
34、出序列片段序列片段PNT串联质谱鉴定多肽的计量方法串联质谱鉴定多肽的计量方法组织切片或印片原位质谱分析技术组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS） 联合技术精确鉴定蛋白质联合技术精确鉴定蛋白质 质谱技术蛋白质鉴定基本流程蛋白质学研究组学(Omics)基因组学（Genomics）蛋白组学（Proteinomics）代谢组学（Metabolomics）转录组学(transcriptomics）脂类组学（lipidomics） 免疫组学（Immunomics）糖组学（glycomics ） RNA组学(RNomics)学。谢 谢！
