《第五章__DNA的复制3》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第五章__DNA的复制3（87页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第八节第八节 真核生物DNA的复制 一、概况二、DNA聚合酶三、SV40的DNA复制 1. DNA复制起点 2. SV40 T抗原 3. 引物合成和起始DNA的合成 4. 从Pol到Pol 的转换 5. 岗崎片段的连接 四、酵母DNA的复制 1. 酵母的复制起点 2. 真核生物的起点识别复合物 3. 真核生物的装载因子和螺旋酶 4. 复制过程 5. DNA聚合酶 6. 53外切核酸酶活性五、真核生物复制时核小体结构六、真核生物染色体末端的复制第八节第八节 真核生物真核生物DNA的复制的复制一、概况在真核生物细胞的细胞周期中，DNA的复制发生在间期的S期。真核生物染色体上DNA的复制是通过许多独
2、立的复制子来完成的，其中只有一部分复制子在S期的任何时间都参与复制，而其他复制子只在S期的特定时间活化。The mammalian cell cycleG1 SG2MG0DNA synthesis and histone synthesis Growth and preparation forcell division Rapid growth and preparation forDNA synthesisQuiescent cellsphasephasephasephaseMitosis静止的有丝分裂每个复制子都有固定的复制起点，常常采取双向复制方式。与原核生物不同，真核生物的复制子相对较
3、小，而且它们的复制叉移动的速度比原核生物复制叉的移动要慢许多。原核生物的基因组只有一个复制子，而真核生物的染色体含有许多复制起点，是多复制子（multireplicon）。有证据表明，真核生物染色体的复制子中没有复制终止，复制叉从其起点连续移动直到遇到邻近复制子的复制叉时终止复制。在一个细胞周期中，染色体上所有的复制子都起始复制，尽管它们不是同时活化的，但都是在一个周期内被激活的，而且每个复制子在一个细胞周期只能被激活一次。大肠杆菌的复制起点oriC中包含有11个GATC序列，其中腺嘌呤A的第六位N原子N6是Dam甲基化酶（Dam methylase）的作用靶点。复制前，复制起点oriC两条链
4、上靶位点的腺嘌呤全部是甲基化的，复制事件导致Dam甲基化酶的靶位点由全甲基化（fully methylated）状态转变为半甲基化（hemimethylated）状态。依赖oriC复制的甲基化质粒在Dam甲基化酶缺陷的（ dam ）大肠杆菌中只能复制一次，而后出现半甲基化产物的累积，说明半甲基化的复制起点不能起始新一轮的DNA复制。所以只有当Dam甲基化酶将半甲基化的复制起点转变为全甲基化状态以后，才可以起始DNA的复制。一般情况下，复制结束以后复制起点的半甲基化状态要维持13分钟左右，而基因组其他部位的GATC甲基化只需1.5分钟左右。dnaA基因的启动子基因的启动子也表现出类似的甲基化延迟
5、现象。在半甲基化阶段，复制起点是无活性的（ inert ），而且dnaA的表达也受到抑制，DNA复制的起始蛋白的产量很低。已经确定，SeqA基因的突变可以缩短oriC和dnaA再甲基化所需要的时间。SeqA与半甲基化状态DNA的结合力比与全甲基化DNA结合力更强。在体外，大肠杆菌DNA复制起点的半甲基化状态是复制起点与质膜结合所必需的。复制起点与质膜的结合可能会阻止复制起点过早地（prematurely）再度起始DNA的复制。已发现一种膜组分特异地识别半甲基化的DNA并阻止DnaA对复制起点的结合。DNA再度甲基化以后，膜抑制物得到释放，DnaA即可起始DNA的复制过程。隔膜控制DNA复制重新
6、起始的机制还不是完全清楚，可能会包括以下几种情况：复制起点的物理隔离再甲基化的延迟DnaA对复制起点的结合dnaA基因转录的抑制真核生物的基因组是由许多复制子（replicon）组成的，每个复制子的复制起点在一个细胞周期内同样也只能被激活一次。问题的实质集中在以下两个问题上：调节系统是如何识别已经发生复制的起点的？有哪些蛋白质成分参与了这些调控过程？非洲爪蟾的卵细胞非洲爪蟾的卵细胞已成为研究DNA复制起始的理想模式系统。爪蟾卵细胞内含有复制DNA所需的全部成分，能复制注入卵细胞核内的外源DNA。研究表明，细胞核内可能存在一/几种蛋白质，在一个细胞周期内会消耗殆尽。尽管细胞质内有大量的这种蛋白质
7、，但由于核膜的阻挡不能进入细胞核内。核膜破坏以后，这个/些蛋白质才可以进入细胞核，激活复制起点进行下一轮的DNA复制。分解, 解散酵母DNA复制起始的许可因子（licensing factor）为MCM2,3,5蛋白，在有丝分裂期间进入细胞核。动物细胞中也发现了MCM2,3,5的类似物。使许可因子失活的一些蛋白质因子如Ubiquitin家族的成员的突变会造成许可因子的持续存在，进而形成大量的DNA累积。说明许可因子在复制周期开始以后便被灭活。二、二、DNA聚合酶聚合酶与真核细胞中多起点复制相应的特点是细胞中DNA聚合酶的数目众多。一个典型的动物细胞中含有20,00060,000分子的聚合酶。在
8、哺乳动物细胞抽提物中发现了五种不同的DNA聚合酶，它们是、。 其中(起始)、 (修复) 、 (增殖，复制) 、 (延伸)位于细胞核中，而 (复制)是线粒体酶。目前认为，DNA聚合酶的功能是起始复制，而DNA聚合酶的功能是延伸两条链。前导链和滞后链合成的起始具有相同的程序。但还不清楚前导链和滞后链合成的起始是否由同一个DNA聚合酶/引发酶复合物完成的。DNA聚合酶的作用是碱基切除修复，而DNA聚合酶是线粒体DNA的复制酶。最近研究发现，DNA聚合酶催化亚基的表达与人细胞增殖紧密联系，表明它在细胞DNA复制中也起关键作用。此外DNA聚合酶也可能参与修复反应。DNA聚合酶的进行性由PCNA滑动钳蛋白
9、来保持。PCNA的晶体结构与大肠杆菌亚基十分类似，PCNA三聚体形成环围绕着DNA。PCNA的功能与二聚体是相同的。真核生物DNA聚合酶不同生物的DNA复制体系三、三、SV40的的DNA复制复制SV40（simian virus 40）病毒只编码一个蛋白质T抗原，以供基因组复制的需要，其他复制所需要的蛋白质由宿主细胞提供。SV40 DNA的复制发生在宿主细胞核中，在病毒和细胞DNA复制之间有很多相似之处，这使SV40病毒成为研究真核生物细胞DNA复制的理想模型体系。1. DNA复制起点复制起点在SV40复制起点处有两个T抗原结合位点，其中核心起点是基因组中一个64 bp的片段，它含有在体内和体
10、外起始病毒DNA复制所需的所有核苷酸序列元件。核心起点中心核心起点中心是27 bp的严格的反向重复序列，其中含有4个拷贝的五核苷酸序列特征微区（GAGGC），这些序列是病毒起始蛋白T抗原的识别位点。在T抗原结合位点的一侧是一个由A/T组成的17 bp片段，可能是起始解链的位点。T抗原结合位点另一侧是15 bp不严格的回文结构，其功能未知。SV40 DNA复制需要起点具有所有三三个微区个微区，而且它们之间的间隔距离对起点功能也很关键。尽管64 bp核心起点区核心起点区足以支持SV40 DNA复制起始，核心区外的序列却能影响起始的效率。第二个T抗原结合位点(位点)位于核心起点的附近，可使复制效率提
11、高14倍。与SV40 DNA转录活化转录活化相关的元件，如SV40增强子或转录因子SP-1的结合位点，对起始复制也很重要。这些序列元件的存在至少可使DNA体内复制效率提高10倍。2. SV40 T抗原在SV40起点起始复制需要病毒基因产物T抗原结合起点并起始链分离过程。SV40 T抗原在病毒DNA复制起始过程中具有起始因子、DNA螺旋酶和引发体装载蛋白的三重作用。T抗原介导的解旋需要宿主细胞提供辅助蛋白，如复制蛋白A （replication protein A，RP-A）。RP-A是SV40的单链结合蛋白。3. 引物合成和起始DNA的合成双功能的DNA聚合酶/引发酶识别并结合T抗原-RPA-
12、起点复合物，从而导致了引发体的形成，开始引物合成。当引物合成并起始了DNA合成之后，复制叉形成并开始复制的延伸期。SV40复制叉上至少包含了两种DNA聚合酶（DNA 聚合酶/引发酶复合物、DNA聚合酶）、滑动钳蛋白PCNA及滑动钳载体RF-C。此外延伸过程也需要RP-A的参与，它可促进DNA聚合酶的活性。T抗原除了在DNA合成前解旋起点之外，还是延伸过程中负责亲代DNA解旋的螺旋酶。SV40 DNA复制需要拓扑异构酶活性。在复制过程中拓扑异构酶起两个作用，一是释放复制叉前进时产生的超螺旋张力，二是复制完成时介导新合成的子代双螺旋分离。4. 从从Pol到到Pol 的转换的转换一旦起始DNA合成，
13、细胞复制因子C（RFC）结合到DNA上，并在模板上装载PCNA和DNA聚合酶，取代聚合酶。因此，聚合酶不能一直完成DNA合成。RFC是真核生物的滑动钳载体。PCNA参与延伸反应，可提高SV40 DNA复制效率，而且也提高DNA聚合酶的进行性。RFC/PCNA/Pol 复合物复合物延伸新的DNA链，形成连续合成的前导链复合物。DNA聚合酶含有起校正作用的35外切核酸酶活性，保证双链DNA的精确合成。 目前认为，真核生物滞后链DNA的复制也是以岗崎片段形式半不连续合成的。与大肠杆菌二聚体DNA聚合酶一致，双链合成是一个高度协同的过程。5.岗崎片段的连接岗崎片段的连接岗崎片段合成后，RNA酶H1和5
14、3外切核酸酶MF1共同作用切除RNA引物；滞后链的DNA聚合酶填充两个岗崎片段之间的缺口，DNA连接酶用来连接已完成填补的岗崎片段，产生完整的滞后链。四、酵母四、酵母DNA的复制的复制1. 酵母的复制起点酵母的复制起点酵母染色体上具有一些短的专一性序列，能指导DNA复制的起始，称为自主复制序列（autonomously replicating sequence，ARS）。ARS在质粒和正常染色体复制中都能发挥DNA复制起点的功能。酵母染色体中潜在的复制起点比真正需要的复制起点要多，可能在细胞分化中允许选择性地使用不同的复制起点。研究表明，真核生物的染色体复制起点由一些DNA元件以一定的排列形式
15、组织而成，而且还需要多个有活化作用的因子结合，才能成为有活性的复制起点。2.真核生物的起点识别复合物真核生物的起点识别复合物酵母的起始因子是一个叫做起点识别复合物(origin recognition complex， ORC)的多亚基蛋白质， 对细胞分裂和DNA复制都有重要的作用。ORC具有原核生物DnaA起始蛋白的一些特性，表明它可能是真核细胞复制的起始蛋白。此外，ORC还具有单链结合蛋白的作用。ORC不仅存在于酵母中，最近在许多物种甚至人中都克隆了ORC亚基亚基的同源物的同源物，表明酵母中控制DNA合成的组分和机制在所有真核生物中都是保守的。3.真核生物的装载因子和螺旋酶真核生物的装载因
16、子和螺旋酶目前尚未确切发现负责真核生物DNA复制的六聚体螺旋酶。有证据表明，MCM蛋白复合物作用于复制叉上，因此最有可能成为真核生物复制性螺旋酶的候选因子。Cdc6蛋白蛋白与大肠杆菌的DnaC和噬菌体的P蛋白类似，是一个装载因子。真核生物有着与原核生物相似的复制叉组装过程。4. 复制过程复制过程对真核生物起点结合复合物的研究表明，伴随着复制起始也有类似的改型事件。在起始过程中，与起点结合的蛋白质组分明显地改变。这些改变包括释放或降解装载因子Cdc6蛋白以及最后起点结合复合物的去组装。目前还不清楚控制这些变化的机制。5. DNA聚合酶聚合酶目前还不清楚两个真核生物聚合酶Pol 和Pol的具体功能
17、。在染色体复制时，两个酶分别合成前导链和滞后链，但还不能完全确定具体哪个聚合酶作用于哪条链。6. 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性真核生物的DNA聚合酶没有53外切核酸酶活性，切除RNA引物的过程由一个独立的外切外切/内切核酸酶内切核酸酶FEN-1完成。RNase H1也可能参与引物的切除。五、真核生物复制时核小体结构五、真核生物复制时核小体结构真核生物染色体的复制要经历DNA和组蛋白八聚体的解离以及DNA和组蛋白的重结合步骤。DNA是半保留复制的，而组蛋白八聚体是以全保留方式传给子代分子的，即亲本的组蛋白八聚体在复制过程中并不解离，而新生链上的组蛋白八聚体完全是重新合成的。SV40的复制中，
18、亲代组蛋白八聚体都结合在前导链上。六、真核生物染色体末端的复制六、真核生物染色体末端的复制真核生物同样面临线性DNA复制时所产生的5末端隐缩的问题，常规的真核生物DNA聚合酶同样不能完全复制染色体末端（端粒）。真核生物的端粒酶可以保持染色体的长度。令人惊奇的是，人类的许多细胞中都缺乏端粒酶，大多数普通的体细胞在培养中分裂时都失去了其端粒片段，而且正常人体组织中的端粒也随着人的衰老也发生缩短。人体细胞能通过检测失去端粒的次数而计数细胞的分裂次数，当端粒长度下降到某一临界值时，它们就可能终止分裂。端粒酶端粒酶是一个核糖核蛋白，含有蛋白质成分和RNA分子（含有复制端粒亚单位所需要的关键核苷酸模板），
19、因此端粒酶是一种特殊的DNA聚合酶，即自身携带RNA模板的反转录酶。端粒酶通常是由胚胎发育过程中的种系细胞(Germ cells)产生的，但是一旦人体完全形成，大多数体细胞中的端粒酶就会被抑制，同时随着细胞的增殖，端粒缩短。不同的有机体之间端粒重复亚单位数目不同，甚至同一有机体的不同细胞之间也不同。在细胞分裂过程中端粒缩短，但它们也由于结合上新合成的端粒亚单位而被延长。如果端粒酶发生改变，端粒就会缩短，细胞甚至死亡。细胞增值，端粒缩短。当端粒下降到阈值水平，将发出防止细胞进一步分裂的信号。如果导致癌的遗传突变阻止了这种信号的正常传递，细胞将越过正常的衰老并继续分裂。当完全失去端粒时，细胞可能发
20、生破坏或死亡。但这种遗传混乱导致端粒酶的产生，细胞将不会完全失去它们的端粒。端粒酶不仅在癌细胞系中是有活性的，在大多数人的肿瘤样品中也都有活性。但研究还发现，人肿瘤中的端粒比周围正常组织中的端粒短得多。癌细胞只有在其已开始无控制的复制之后，细胞才合成端粒酶。此时，细胞已失去很大数量的端粒亚单位。当端粒酶最终被活化时，它将稳定这严重缩短的端粒，使过度增殖的肿瘤细胞变成永生的细胞。能够抑制端粒酶的药物可能会通过使端粒缩短或消失来破坏癌细胞而不影响大多数正常细胞的功能。In 1960s, Leonard Hayflick discovered that ordinary human cells ar
21、e not immortal. They can be grown in culture for a finite periodabout 50 generations. This ceiling in the lifetime of normal cells is known as Hayflick limit. But cancer cells do not obey any such limit. They do go on dividing generation after generation, indefinitely. Cancer cells are immortal and
22、normal cells are not, because cancer cells contain telomerase while normal somatic cell lack this enzyme.Some signs indicated that simply inhibiting the telomerase of cancer cells may not cause the cells die. For one thing, knockout mice totally lacking the telomerase activity survive and reproducte
23、d for at least 6 generation, though eventually the loss of telomerase leads to sterility（不育）. Thus the presence of telomerase is not an absolute requirement for the development of a cancer cell.Serge Lichtsteiner, Woodring Wright and their colleages transplanted a human telomerase reverse transcript
24、ase gene into human somatic cells in culture, so the cells were forced to express telomerase activity. The results are stricking: The telomeres in these cells grew longer and the cells went on dividing far past their normal lifetimes. They remained youthful in appearance and in their chromosome content. Furthermore they did not show any signs of becoming cancerous.
