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1、工业发酵的工艺流程工业发酵的工艺流程 生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种的选生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种的选 育、菌种培养基的配制、扩大培养和接种、发酵育、菌种培养基的配制、扩大培养和接种、发酵 过程下游处理即分离提纯等几个过程。过程下游处理即分离提纯等几个过程。找到合适的菌种是发酵工程的前提。人们最初是从自然界寻找所需要的菌种，如谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌等。但这种方法得到的菌种，产量一般都比较低。20世纪40年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理菌种，使菌种产生突变，以筛选出符合要求的优良菌种。随着细胞工程、基因工程等技术的日益成熟，科学家开始构建工程细
2、胞或工程菌，用它们进行发酵，甚至能生产出一般微生物所不能生产的产品。 一、菌种的选育菌种选育的必要性和重要性菌种选育的必要性和重要性 必要性必要性：1、经诱变剂处理的细胞中只有一部分是突变型菌株，而有害突变往往占有很大比例； 2、从自然界筛选得来的菌株，药物代谢合成能力均很低，野生型菌株由于长时间生长在非最适条件下，产物浓度很低，对于工业生产来说，如果不进行菌种改良，势必造成生产成本过高。 重要性：重要性：1、菌种选育是提高单位产量产量和改进产品质量质量的重要措施； 2、能够改变菌种的某些遗传性状，使之更适合于工业生产，例如抗噬菌体的菌株能利用廉价发酵原料或需氧量较小的菌株等。 选育方法选育方
3、法1、自然选育自然选育：是指微生物细胞群体不经过人工处理而利用菌种的自发突变（spontaneous mutation）进行菌种筛选的育种方法。 效率低、进展缓慢。2、诱变育种诱变育种：是用不同的诱变剂（mutagen）处理微生物的细胞群体，以诱发各种遗传突变，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中选出所需要的突变株（mutant）。发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株，故至今仍是菌种改良的主要方法。 （一）方法和原理（一）方法和原理 A.A.诱变机制诱变机制（1 1）微小损伤突变微小损伤突变：碱基置换，码组移动碱基置换，码组移动（2 2）染色体畸变染色体
4、畸变：易位，逆位，缺失，重复易位，逆位，缺失，重复（3 3）染色体组突变染色体组突变：数目变化（单倍体变多倍体）数目变化（单倍体变多倍体） B.B.诱变剂及其作用方式：诱变剂及其作用方式：物理物理诱变剂诱变剂，化学，化学诱变诱变剂剂，生物，生物诱变剂诱变剂常用诱变剂常用诱变剂 p-263p-263（二）诱变和筛选初步筛选是关键步骤A.自身耐药突变株：耐受自身分泌的抗生素，提高产量B.结构类似物或前体类似物的耐受突变株：解除反馈抑制 C.营养缺陷型及其回复突变株 通过诱变导致某些基因的突变，而需要添加一些物质（氨基酸、核苷酸等）才能生长的突变体。 营养缺陷型的作用：（1）解除末端产物的反馈调节作
5、用。（2）作为标记，在杂交育种中作为出发菌株有利于杂交重组的分析。（3）作为基因工程的受体菌，检出克隆基因的表达。3、杂交育种杂交育种：是将两个基因型不同的亲株的某些遗传信息，通过杂交重组于同一重组体中，形成新的遗传型个体的过程。传统的杂交育种在真核微生物中可以通过有性杂交及准性杂交两种途径；在原核微生物中（如细菌和放线菌）则可通过接合杂交进行。 a. 准性生殖准性生殖（parasexual reproduction）：是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。 b. 接合接合（conjugation）：在细菌和放线菌中，接合是最常见的杂交方式。二亲株的细胞在固体培养基上混合培养时，一亲株细胞的
6、基因组片段进入另一亲株的细胞，发生部分染色体的转移或遗传信息的交换，形成部分合子，经过二次交换形成单倍重组体。 c. 原生质体融合原生质体融合（protoplast fusion）：两亲本菌株的原生质体在高渗条件下混合，以聚乙二醇作为助融剂，或在一定电场条件下，通过电脉冲作用促进原生质体互相聚集，诱导融合，接着两亲本遗传物质交换，从而实现遗传重组。在适宜的条件下，融合细胞可再生成新的完整细胞，就有可能获得具有合乎理想的新遗传性状的重组子。二、发酵的基本过程基本过程为： 菌种 种子制备 发酵 发酵液预 处理 提取精制 菌种菌种发酵工程中所用的菌种多要求是纯培养的，即整个发酵过程不能混有杂菌，否则
7、将导致产量大大下降，甚至得不到产品。例如，如果青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌会分泌青霉素酶，将形成的青霉素分解掉。因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。种子制备种子制备在摇瓶或小罐内进行。种子罐一般用钢或不锈钢制成，相当于小型发酵罐。接种前所有设备及培养基要经过严格灭菌严格灭菌。在大规模的发酵生产中，需要将选育出的优良菌种经过多次扩大培养多次扩大培养，让它们达到一定数量以后，再进行接种。发酵发酵接种量：接种量：5-20%通气量：通气量：0.3-1 m3/m3搅拌功率消耗：搅拌功率消耗：1-2 kW/m3罐温：罐温：26-37罐压：罐压：0.3-0.5 kg/cm2发酵周期：发酵周期
8、：28d 发酵结束后，要对发酵液或生物细胞进行分离和提取发酵结束后，要对发酵液或生物细胞进行分离和提取精制，将发酵产物制成合乎要求的产品。对发酵产品的精制，将发酵产物制成合乎要求的产品。对发酵产品的要求不同，分离提纯的方法也相应有些区别。利用发酵要求不同，分离提纯的方法也相应有些区别。利用发酵工程生产的产品有工程生产的产品有菌种代谢产物菌种代谢产物和和菌种本身菌种本身（如酵母菌（如酵母菌和细菌）两大类，如果产品是菌种，分离方法一般是通和细菌）两大类，如果产品是菌种，分离方法一般是通过过滤、沉淀从培养液中分离出；如果产品是代谢产物，过过滤、沉淀从培养液中分离出；如果产品是代谢产物，则采用蒸馏、萃
9、取、离子交换等方法提取。分离提纯后则采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。分离提纯后的产品，还要经过的产品，还要经过质量检查合格质量检查合格后，才能成为正式产品。后，才能成为正式产品。产物提取产物提取发酵方式发酵方式1 1、分批、分批( (间歇间歇) )发酵：发酵：物料一次投入反应器中，灭物料一次投入反应器中，灭菌、接种、发酵。菌、接种、发酵。 特点：特点：一次性；发酵过程中，营养不断减少，微一次性；发酵过程中，营养不断减少，微生物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个生物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个时期明显；时期明显； 应用广泛，改善（在线检测，计算机控制）。应用广泛，改善（在线检测
10、，计算机控制）。 2、补料分批发酵、补料分批发酵 ：补加新鲜培养基。补加新鲜培养基。 特点：特点：可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生物过度生长；提高有用产物的转化率；物过度生长；提高有用产物的转化率； 应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业；业；3、连续发酵：、连续发酵：恒化器（基质恒）、恒浊器（菌体密度恒）恒化器（基质恒）、恒浊器（菌体密度恒），连续进料出料平衡，保持恒定的发酵液密度。易实现自，连续进料出料平衡，保持恒定的发酵液密度。易实现自动化生产，如啤酒，乙醇的发酵。动化生产，如啤酒，乙醇的发酵。优点：优点：操作稳定；利于机械、自动化；提高设备的利用率；操作稳定；利于机械、自动化；提高设备的利用率；减少灭菌次数；减少灭菌次数；易于过程优化。易于过程优化。缺点：缺点：易染菌；微生物易变异；对产品类型的适应性不广；易染菌；微生物易变异；对产品类型的适应性不广；对设备及附件要求高。对设备及附件要求高。
