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1、1流式细胞术实验技巧及数据分析流式细胞术实验技巧及数据分析2BDBD公司不同型号流式细胞仪公司不同型号流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto3一一 流式细胞仪的基本原理流式细胞仪的基本原理 *稳定流动稳定流动 *激发光斑激发光斑 *荧光补偿荧光补偿 *荧光素选择荧光素选择二二 数据分析及开窗数据分析及开窗4FCMFCM原理示意图原理示意图5 层流是液体稳定流动的必要条件层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流管道中层流 的形成要满足雷诺数的形成要满足雷诺数 dV Re = 2300， 式中式中、分别为液体的
2、密度和粘滞系数，分别为液体的密度和粘滞系数，d d和和V V分别为管道的直径和液体的平均流速。分别为管道的直径和液体的平均流速。FCMFCM利利用层流技术用层流技术, ,使细胞流动稳定使细胞流动稳定, ,并具有自聚焦作用并具有自聚焦作用, ,为细胞分析分选提供技术保证为细胞分析分选提供技术保证. . 层流技术层流技术6液流驱动系统（示意图）液流驱动系统（示意图） 流速与压力的关系服从流速与压力的关系服从BernoulliBernoulli方程，即方程，即 P=(1/2)P=(1/2) V V2 2 ( (忽略高度的变化忽略高度的变化) )。改变气压。改变气压, ,就可获得不同的流速。就可获得不
3、同的流速。 78 低速低速 高速高速不同样本速率形成的样本流不同样本速率形成的样本流9激发光源与光束成形系统激发光源与光束成形系统10.20um64um32um 0 32um聚焦距离聚焦距离激光束激光束聚焦透镜聚焦透镜强度强度光光束束成成形形与与细细胞胞受受照照方方式式这种椭圆形光斑的检这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分测区保证每个细胞分别受到光照且受检时别受到光照且受检时受到一致的光照受到一致的光照 FCMFCM的单细胞照明技的单细胞照明技术术1112荧荧光光光光谱谱重重叠叠 FITCFITC和和PEPE荧光光谱重叠荧光光谱重叠13Uncompensated vs CompensatedF
4、L1FL2 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的方法称利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿荧光补偿荧光补偿荧光补偿”荧荧光光补补偿偿14荧光补偿荧光补偿15MeanMean值判断补偿值判断补偿16双或多参数荧光抗体的组合标记双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE 488 525 、575 绿色、橙色绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色绿色 568 615 红色红色FITC+PeCy5 488 525、 675 绿色、绿色、 红色红色FITC+ ECD 488 525、 625 绿色、橙红色绿色、橙红色F
5、+P +PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、绿、橙、红色红色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 绿、橙红色、绿、橙红色、红色红色F+P +PeCy5 +APC 488 525 、 575 绿色、橙色绿色、橙色 633 670 红色红色 荧光染料荧光染料 激发波长（激发波长（nm) nm) 发射波长（发射波长（nm) nm) 颜色颜色17 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在起，在488nm488nm波长激发光激发后产生的发射波长波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。激发另一荧光染料
6、产生的荧光信号。LaserLaserCY7755PEECD620CY5670488nm488nm能量传递染料：能量传递染料：18流式细胞术操作流程流式细胞术操作流程：培养细胞培养细胞新鲜组织新鲜组织石蜡包埋石蜡包埋单细胞悬液单细胞悬液制备制备荧光抗体标记荧光抗体标记上机检测上机检测表型测定表型测定细胞分选细胞分选继继续续培培养养FISHPCR统统计计学学分分析析19单单分分散散细细胞胞20FSCFSCFSCFSCFSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关信号的强弱与细胞的大小和活力相关信号的强弱与细胞的大小和活力相关信号的强弱与细胞的大小和活力相关21SSCSSCSSCSSCSSC信号的强弱与细胞
7、内颗粒多少相关信号的强弱与细胞内颗粒多少相关信号的强弱与细胞内颗粒多少相关信号的强弱与细胞内颗粒多少相关22细胞散色光信号细胞散色光信号23细胞荧光测量细胞荧光测量细胞的自发荧光细胞的自发荧光细胞的自发荧光细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞未经染色的样品细胞 在激发光的照射下可测到有微弱的荧在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号光信号. .细胞的特异性荧光细胞的特异性荧光细胞的特异性荧光细胞的特异性荧光 经过各种特异染色的经过各种特异染色的 细胞在细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光激发光的照射下可测到较强的荧光 信号信号. .24自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自发荧光信号与特异染色
8、的荧光信号分析图自自发发荧荧光光信信号号25特特异异染染色色的的荧荧光光信信号号26DNADNA分析比较分析比较27排除双联体细胞排除双联体细胞28细胞阻滞在细胞阻滞在G G2 2M M期期29双双克克隆隆细细胞胞周周期期分分析析30 溴脱氧尿嘧啶核苷溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代是胸苷的一种类似物。它可以替代胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNADNA分子中，成为分子中，成为S S期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗期细胞的一种标记物。流式细胞术
9、采用抗BrdUrdBrdUrd单克隆抗体免疫荧光和单克隆抗体免疫荧光和PIPI双参数检测细胞，不仅双参数检测细胞，不仅可检测一个细胞群体的动力学参数和可检测一个细胞群体的动力学参数和DNADNA含量，同含量，同时可以了解不同细胞的时可以了解不同细胞的DNADNA合成能力高低。合成能力高低。 BrdUrdBrdUrd和和DNADNA双标记染色双标记染色3132BrdUrdBrdUrd与与PIPI检测检测33BrdUrdBrdUrd与与PIPI检测检测34BrdUrdBrdUrd与与PIPI检测检测35细细胞胞三三色色荧荧光光检检测测36细胞因子测定细胞因子测定* *检测检测T T细胞细胞(CD69)(CD69)活化活化37G6=R1*R538*CD4*CD4抗原分子结构引起抗原分子结构引起CD4CD4荧光强度下调荧光强度下调39细胞因子分析图细胞因子分析图* *过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较40纯化单核细胞纯化单核细胞41调节性调节性T T细胞检测细胞检测4243G3=R1*R3G3=R1*R3G4=R1*R4G4=R1*R444凋亡细胞测定凋亡细胞测定45凋亡细胞测定凋亡细胞测定46细胞凋亡检测细胞凋亡检测47阴性的设置阴性的设置48血血小小板板检检测测49血血小小板板检检测测50血血小小板板检检测测51血小板检测血小板检测52谢谢谢谢
