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1、第四章第四章 蛋白质化学蛋白质化学Chapter 4 Chemistry of Proteins1主要内容主要内容第一节 概述 （Introduction）第二节 蛋白质的基本单位氨基酸（Amino Acids_ The basic unit of proteins ）第三节 肽（Peptides）第四节第四节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构（The Molecular Structure of Protein）第五节第五节 蛋白质的性质蛋白质的性质（Properties of Proteins）第六节第六节 蛋白质及氨基酸的分离纯化与测定蛋白质及氨基酸的分离纯化与测定 (Isolation
2、, purification and determination of proteins and amino acids)2第四节第四节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Proteinsl从化学结构上讲，蛋白质是很多氨基酸残基构成的多肽链。l 蛋白蛋白质质与多与多肽肽并无并无严严格的界格的界线线。l 蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大。蛋白质蛋白质月示月示胨胨多肽多肽肽肽氨基酸氨基酸 1*104 5*103 2*103 1000 200 -500 100 (分子量分子量)3蛋白质的分子大小与结构蛋白质的分子大小与结构胰岛素胰岛
3、素细胞色素细胞色素 c核糖核酸酶核糖核酸酶溶菌酶溶菌酶肌红蛋白肌红蛋白血红蛋白血红蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶4Primary StructureSecondary StructureTertiary StructureQuaternary Structure高级结构高级结构或或空间构象空间构象(conformation)Hierarchy in Protein StructureHierarchy (层次层次) in Protein Structure一级结构一级结构: 共价结构共价结构; 初级结构初级结构二、三、四级均属于蛋白质的三维空间结构三维空间结构（three
4、-dimensional structure，3D）或构象构象（conformation），即链的空间排布。5Structure of ProteinslPrimary Structuresequence of the amino acids in the proteinlSecondary Structurepolypeptide chain folds back on itself to form a secondary structure lTertiary Structureinteractions between amino acid side chains that leads t
5、o the three-dimensional structure of the polypeptide chainlQuaternary Structureinteractions between individual polypeptide chains 6Primary-sequenceSecondary-e.g-helixor-sheetTertiary-3DshapeQuaternary-subunitorganization(onepolypeptidechain)Structure of Proteins化学键化学键共价键共价键次级键次级键肽键肽键二硫键二硫键氢键氢键疏水键疏水键
6、盐键盐键范德华力范德华力一级结构一级结构二、三、四级结构二、三、四级结构三、四级结构三、四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质分子中的共价键与次级键Intermolecular Forces in a Protein Moleculeionic forcesionic forceshydrogenbondsdispersionforcesdispersionforcesdispersionforcesdipole-dipoleforces一、蛋白质的共价结构一、蛋白质的共价结构The primary structure is the specific sequence of amino a
7、cids in a proteinAmino Acid10（1）蛋白质的化学结构：（不同于一级结构）蛋白质的化学结构：（不同于一级结构）蛋白质的化学结构包括：多肽链数目；每条肽链的氨基酸数目、多肽链数目；每条肽链的氨基酸数目、种类和顺序；链间或链内键的位置和数目。种类和顺序；链间或链内键的位置和数目。1. 一级结构概念一级结构概念氨基酸的顺序氨基酸的顺序1969年，国际理论和应用化学协会（IUPAC）经过讨论，规定一规定一级结构级结构只指肽链中的氨基酸的排列顺序只指肽链中的氨基酸的排列顺序，其他内容属于一般的化，其他内容属于一般的化学结构。这种规定对于讨论学结构。这种规定对于讨论“一级结构决定
8、高级结构一级结构决定高级结构”这一命题这一命题是有意义的。是有意义的。11一级结构一级结构肽键（主要化学键）肽键（主要化学键）二硫键二硫键（2）维持）维持一级结构的化学键：（一级结构的化学键：（均是共价键。因此一级结构也称为共价结构共价结构）。（3）一级结构的书写方式：（一级结构的书写方式：（P56）二硫键（二硫键（disulfide bond）：两个巯基（）：两个巯基（SH）通过氧化失去两个）通过氧化失去两个氢原子而形成的氢原子而形成的S S 。巯基（。巯基（SH）仅仅存在于个别氨基）仅仅存在于个别氨基酸（如半胱氨酸）的侧链酸（如半胱氨酸）的侧链R基上。基上。12一级结构一级结构2.一级结构
9、的测定一级结构的测定氨基酸序列的自动程序测定氨基酸序列的自动程序测定总的策略：总的策略：u 将大化小，逐段分析，并对照两套以上肽段分析结果，排出将大化小，逐段分析，并对照两套以上肽段分析结果，排出肽段前后位置，最后确定全部序列。肽段前后位置，最后确定全部序列。片段重叠法片段重叠法14一级结构测定一级结构测定(6)比较两套肽段比较两套肽段的氨基酸顺序，拼凑出整个肽链的氨基酸顺序；(7)最后确定原来多肽链中二硫键确定原来多肽链中二硫键的位置。(3)对肽链的一部分样品进行完全水解完全水解，进行氨基酸组成分析；(4)对肽链的另一部分样品进行不不完完全全水水解解，得出一套大小不等的片段（第一套），（第一
10、套），分离出各片段，并测定每个片段的氨基酸序；(5)再用另一种酶或化学试剂对第二步所得的样品（即肽链）进行不完全水解，从而得到另一套片段（第第二二套套），分离出各片段并测定每个片段的氨基酸序；这样就能够测定出全部一级结构。这样就能够测定出全部一级结构。(1)测定氨基酸末末端端数数目目，确定蛋白质分子是由几几条条肽肽链链构构成成，并测得其末端组成末端组成；(2)若蛋白质有几条肽链，拆拆分分蛋白质分子的多多肽肽链链，断开多肽链内二硫键，并分离出每条肽链分离出每条肽链；15（1 1）肽链末端分析）肽链末端分析N-末端C-末端a.DNFB法（Sanger法）（法）（二硝基氟苯反应）b.苯异硫腈法（Ed
11、man法法）c.二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS法）（丹磺酰氯反应）d.氨肽酶法a.肼解法b.羧肽酶法16 N N末端分析末端分析a. DNFB法（法（Sanger法）：法）： -NH2与二硝基氟苯(DNFB)的反应黄色:根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定DNP-肽链17黄色黄色DNP氨基酸，氨基酸，乙醚抽提后测定乙醚抽提后测定DNP-肽链Sanger法法牛胰岛素牛胰岛素N-末端的测定：末端的测定：Sanger（10年）年）b. 苯异硫腈法（苯异硫腈法（Edman法）（法）（Edman于于1950年首先提出）年首先提出）PITCPTC-肽链肽链少一个氨基酸的肽链少一个氨基酸的肽链PTH-
12、氨基酸氨基酸(丙氨酸丙氨酸)氨氨基基酸酸序序列列全全自自动动分分析析仪仪c. 二甲基氨基萘磺酰氯法（二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS法）法）二甲基氨基萘磺酰氯法简称丹磺酰氯（DNS-Cl）。DNS法的原理与DNFB法相同，只是用DNS代替DNFB试剂。特点：特点：u丹磺酰基具有强烈的荧光，此法的灵敏度比DNFB法高100倍。u水解后的DNS-氨基酸无需抽提，即可直接进行测定。u还可用荧光计检测。-HCl+氨基酸混合物水解水解DNS-Cl + 多肽多肽DNS-多肽多肽具有强荧光d. 氨肽酶法氨肽酶法u氨肽酶是一类肽链外切酶（肽链外切酶（expopeptidasesexpopeptidases）：从多
13、肽链N-N-端端逐个向逐个向内切内切水解水解；u根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和反应时间和AAAA残基释放量作动力学曲线残基释放量作动力学曲线，就能够知道蛋白质N-N-末端残基顺序末端残基顺序。u最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。 NH2-aa-aa-aa-aa.。 C-C-末端分析末端分析a. 肼解法肼解法这是测定C-C-末端末端最常用的方法最常用的方法。多肽与肼在无水条件无水条件下加热，C-末端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-末端氨基酸分离。 注:C-末端若为
14、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸或精氨酸，则半胱氨酸或精氨酸，则此法的分析结果不够准确。 肼解法肼解法b. 羧肽酶法羧肽酶法l羧肽酶羧肽酶也是一类肽链外切酶，它是一种专门水解并并从肽链的C-末端依次切下一个氨基酸残基的蛋白水解酶。释放出的游离氨基酸的种类和数量随反应时间反应时间而变化而变化。l采用色谱法色谱法测定不同时间释放出来的氨基酸，然后根据氨基酸量与反应时间的关系，就可以知道C-末端氨基酸的排列顺序。l是目前最有效也是最常用的方法之一。羧肽酶法羧肽酶法（2 2）二硫键的拆开和肽链的分离二硫键的拆开和肽链的分离肽链的拆开：肽链的拆开：l如果蛋白质分子含有几条肽链，就应该设法将这些肽链分开，然后
15、测定每条肽链的氨基酸序列。肽链的分离：肽链的分离：l二硫键拆开后的单个肽链，可用纸色谱、离子交换色谱或电泳等方法分离。如果几条肽链是通过共价键（二硫键）交联，或者虽然蛋白质分子只由一条肽链构成，但存在链内二硫键，则必须先将二硫键打开。如果几条肽键是通过非共价键连接，则可用酸碱、高浓度的盐或其他变性剂（如8 mol/L脲、 6 mol/L盐酸胍）处理，将肽链分开。 用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用碘乙酸（ICH2COOH）保护还原生成的半胱氨酸的巯基，以防止它重新被氧化：H2NCHCOOHCH2SNH2CHCOOHSCH22HSCH2CH2OHH2NCHCOOHCH2
16、SHSCH2CH2OHSCH2CH2OHH2NCHCOOHCH2S-CH2-COOHICHICH2 2COOH(COOH(碘乙酸）碘乙酸）S-S-羧甲基衍生物羧甲基衍生物+ +二硫键的打开：二硫键的打开：常采用氧化还原法常采用氧化还原法H2NCHCOOHCH2SNH2CHCOOHSCH2H2NCHCOOHCH2SO3H+6HCOOH6 HCOOOH磺基丙氨酸磺基丙氨酸 也可用发烟甲酸（过甲酸）打开二硫键，将二硫键氧化成磺酸也可用发烟甲酸（过甲酸）打开二硫键，将二硫键氧化成磺酸基而使链分开：基而使链分开：二硫键的打开：二硫键的打开：常采用氧化还原法常采用氧化还原法 目前较好的方法是目前较好的方法
17、是用二硫苏糖醇（Dithiothreitol）或二硫赤藓糖醇 (dithioerythreitol)还原二硫键，本身被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构，而使得还原性巯基稳定。反应式如下：二硫键的打开：二硫键的打开：常采用氧化还原法常采用氧化还原法（3 3）肽链的部分水解和肽段的分离）肽链的部分水解和肽段的分离 CNBr能专一性地切断肽链中甲硫氨酸甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 溴化氰溴化氰 (Cyanogen bromide)水解法水解法 部分酸水解法部分酸水解法 采用盐酸进行限时控温水解： 烯酸：天冬氨酸的羧基端肽链易断裂； 浓酸：含羟基氨基酸的氨基端肽链断裂。 酶水解法酶水解法 不同的酶有
18、不同的选择点。不同的酶有不同的选择点。（4 4）肽段的氨基酸序列测定）肽段的氨基酸序列测定主要采用主要采用Edman降解法、酶解法。降解法、酶解法。（5 5）肽段在多肽链中次序的推断）肽段在多肽链中次序的推断片段重叠法基本方法：Sanger法Edman降解法DNS-Edman测序法蛋白质顺序仪测序二、蛋白质的空间结构二、蛋白质的空间结构蛋白质分子的空间结构空间结构又称为构象构象、高级结构、立体结构、三维结构，指的是蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布原子在三维空间中的排布，分为二级结构、三节结构和四级结构。Hydrogen bondPleated sheetAmino acid(a) Pri
19、mary structureHydrogen bondAlpha helix(b) Secondary structurePolypeptide(single subunit)(c) Tertiary structure(d) Quaternary structure1. 概念概念蛋白质的空间结构系非共价结构蛋白质的空间结构系非共价结构u 二级结构：二级结构：多肽链多肽链借助氢键氢键排列成沿一个方向具有周期性周期性结构的构象构象。也就是指主链的构象，如-螺旋、-折叠片等。二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。u 三级结构：三级结构：在二级结构基础上，多肽链多肽链借助于各种次级键绕成特定的不规则的
20、球状结构球状结构的构象。u 四级结构：四级结构：寡聚蛋白质中各亚甲基之间排布上的相互关系或结合方式。（1）含义）含义现已知道，维持和稳定蛋白质分子构象的化学键主要是次级键化学键主要是次级键，但离子键、二硫键甚至共价键也参与维持蛋白质的构象： 氢键（氢键（hydrogen bondhydrogen bond）：）：一个氢原子连接两个点负性强的原子（如N、O、S等）：x H y 其中，xH是共价键，Hy是氢键 。（2 2） 维持蛋白质分子构象的化学键维持蛋白质分子构象的化学键 静电引力静电引力( Electrostatic attraction )：它是由带相反电荷的两个基团间的静电吸引所形成的。
21、又称离子键（又称离子键（ionic bondionic bond）或盐）或盐键。键。 在蛋白质分子中，通常有带正电荷的基团和带负电荷的基团。其中，带正电荷的基团有：N末端的-NH3，肽链中赖氨酸残基的-NH3等；带负电荷的基团有：C末端的-COO-，肽链中天门冬氨酸残基的-COO-，谷氨酸残基的-COO-。静电引力较强，但对蛋白质构象的稳定性贡献不是很大。F：吸引力吸引力Q1/2：电荷电量电荷电量 ：介质介电常数介质介电常数R：电荷质点间距离电荷质点间距离 范德华力范德华力(van der Waals force ) ：偶极子与偶极子之间的微弱引力。这种力是原子团相互接近时产生时诱导产生的。它
22、瞬息万变，但对维持蛋白质活性中心的构象非常重要。 疏水作用力疏水作用力(hydrophobic interactions) (hydrophobic interactions) ：是指非极性基团即疏水基团为了避开水相而群集在一起的作用力。是蛋白质高级结构的重要决定因素。 二硫键二硫键(disulfide bond)(disulfide bond) ：是两个硫原子之间所形成的共价键。此键作用很强。它可以把不同的肽链或同一条肽链的不同部分连接起来，对维持和稳定蛋白质的构象具有重要作用。二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失。（3 3） 蛋白质分子中肽键的空间结构原则蛋白质分子中肽键的空间结构原则 肽键肽
23、键COCONHNH键具有部分双键性质，不能沿键具有部分双键性质，不能沿C CN N键自键自由旋转。肽键亚氨基上的氢原子在由旋转。肽键亚氨基上的氢原子在pHpH0 04 4范围内不离解。范围内不离解。Resonance 肽键的4个原子与它相邻的2个-碳原子构成一个刚性平面，称为肽平面肽平面或酰胺平面酰胺平面(Amide plane)。u Resonance explains partial double bonduSix atoms of the peptide group lie in a plane肽平面特征：肽平面特征：肽键的空间结构原则肽键的空间结构原则肽平面键长和键角一定：肽平面键长和
24、键角一定：肽链主链上的重复结构称为肽单位或肽单元肽单位或肽单元 ( (peptide unit) peptide unit) ，它包括完整的肽键及-碳原子，即即C CCOCONHNH。残基残基则是为了研究化学结构，将肽键切断，所余部分相当于一个氨基酸化学结构单位NHCRCO。 肽平面之间可以旋转，但肽平面之间可以旋转，但这种旋转是受到限制的：这种旋转是受到限制的：a.氨基酸残基侧链的结构、极性造成空间位阻，使CC键和 NC的旋转不能超过0180 范围；b.NH键的H原子和另一酰胺平面的CO键的原子间有强吸引力，二者可形成氢键；同样， CO键的O原子与另一个肽平面的NH键的H原子也可形成氢键，因
25、而使得CC键和 NC的旋转不能超过0180范围。41Restrictions on peptide conformation2. 二级结构二级结构肽链的螺旋折叠肽链的螺旋折叠多肽链（主链）中有规则重复的构象。多肽链（主链）中有规则重复的构象。不涉及氨基酸残基不涉及氨基酸残基的侧链构象。的侧链构象。Secondary: regular, repeated coiling and folding of polypeptide backbone. （1）-螺旋螺旋 ( -helix ) （2）-折叠折叠 ( -pleated sheet ) （3） -转角转角 ( -turn ) （4）无规卷曲）无
26、规卷曲 ( random coil )蛋白质二级结构的主要形式：蛋白质二级结构的主要形式：（1 1）-螺旋（螺旋（The -helix）First proposed by Linus Pauling and Robert Corey in 1951. a.a.多肽链的主链围绕一个多肽链的主链围绕一个“中心轴中心轴”螺旋螺旋上升，形成螺旋结构：上升，形成螺旋结构：u每隔3.6个氨基酸残基上升一圈（Residues per turn: 3.6）；u沿轴上升一圈的距离即螺距为0.54nm（Rise per turn: 5.4 ）；）；u两个氨基酸残基之间的距离为0.15nm（Rise per res
27、idue: 1.5 ）;u每个氨基酸残基沿轴旋转100度；u-螺旋都是由L-型氨基酸构成的（Gly除外）。 -螺旋结构模型要点螺旋结构模型要点这种典型的这种典型的-螺旋常用螺旋常用3.613来表示。其中来表示。其中3.6指每圈螺旋含指每圈螺旋含3.6个残个残基，基，3.6的右下角的的右下角的13表示氢键封闭的环内含表示氢键封闭的环内含13个原子。个原子。螺距螺距0.54nm每残基的每残基的轴向高度轴向高度0.15nm每残基绕轴每残基绕轴旋转旋转100 o氢键氢键H-bond between C=O(n).H-N(n+4)b.b.相邻的螺圈之间形成链内氢键相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几
28、乎与中心轴平行 。氢键是每个氨基酸残基的 NH中的氢和 它前面(N端)第四个残基上的CO中的氧之间形成的：l氢键封闭的环内含13个原子（不包括H原子）。l多肽链顺序上有脯氨酸残基时，没有多余的氢原子形成氢键，肽链就拐弯。不再形成-螺旋。l氢键氢键是维系是维系-螺旋的主要作用力。螺旋的主要作用力。n位位AA残基残基 (n+4)位位AA残基残基封闭的氢键封闭的氢键 c.c. R side-chains point out 侧基侧基R R伸向螺旋外侧伸向螺旋外侧。d. Right-handed -helix 右手螺旋右手螺旋 。天然蛋白质的-螺旋大多数是右手螺旋。由1条充分伸展的肽链的肽键平面折叠成
29、的。右手-螺旋空间位阻较小，构象稳定在肽链折叠中容易形成。左手螺旋左手螺旋 右手螺旋右手螺旋 影响影响-螺旋形成和稳定的因素螺旋形成和稳定的因素a.a.氨基酸的组成和排列顺序。氨基酸的组成和排列顺序。蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。l若一段肽链有多个Glu(Glu(谷氨酸谷氨酸) )或或Asp(Asp(天冬氨酸天冬氨酸) )相邻,则因pH=7.0时都带负电荷,防碍螺旋的形成;同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内,正电荷相斥,也防碍螺旋的形成。l凡是有Pro(Pro(脯氨酸脯氨酸) )存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽键N原子上没有H,不可能形成氢键。b. b. 氨基酸所带电荷性质。氨基酸
30、所带电荷性质。这与氨基酸的结构有关。c. Rc. R侧链的大小。侧链的大小。如果R侧链大，则位阻大，防碍螺旋的形成。如AsnAsn（天冬酰胺）、（天冬酰胺）、Leu(Leu(亮氨酸亮氨酸) )侧链很大。（2） -折叠（折叠（ -pleated sheet-pleated sheet） -折叠或 - -折叠片也称折叠片也称 - -结构或结构或 - -构象构象，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。 -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。氨基酸残基的侧链越小，越易形成氨基酸残基的侧链越小，
31、越易形成-折叠。折叠。Also first postulated by Pauling and Corey, 1951 结构要点结构要点a.Nearly fully extended 肽链几乎是完全伸展的；b.肽链呈锯齿状，按层平行排列，肽平面呈片状，称为折叠片（pleated sheetpleated sheet）；）；c.Side chains point alternatively on opposite sides of the sheet 肽链的R侧链基团在肽平面的上下交替出现；d. d. C=O, N-H groups form H-bonds between neighbouri
32、ng strands相邻肽链上的相邻肽链上的NHNH和和C=OC=O之间形成氢键之间形成氢键，氢键几乎垂直于肽链，用以维持片层间结构稳定性；e. e. Strands may be parallel or antiparallel 折叠片分平行式和反折叠片分平行式和反平行式两种类型平行式两种类型。反平行式的折叠更伸展，所以反平行式更反平行式更加稳定加稳定一些。NNN平行式平行式NCN反平行式反平行式蚕丝蛋白蚕丝蛋白中就存在反平行式反平行式 -折叠 - -折叠与折叠与-螺旋的转变螺旋的转变在某些蛋白质中，在某些蛋白质中，-螺旋可与螺旋可与 - -折叠相互转变。折叠相互转变。例如：l加热时，-螺旋
33、变为 -折叠。因为受热，-螺旋中氢键被破坏，肽链伸长。l头发（-角蛋白）在湿热条件下伸长，角蛋白中的-螺旋伸展变成了平行式 -折叠。(3) -转角（转角（ turn）-转角（-turn）也称为回折（reverseturn）、-弯曲（-bend）或发夹结构（hairpinstructure），它是球状蛋白质中广泛存在的一种二级结构类型，可占全部氨基酸残基总数的1/4。 转角是多肽主链回转180度所形成的部分，它使肽链的走向发生改变。uThe carbonyl oxygen of the ith residue forms H-bond with the amide proton of the (
34、i+3)th residue. 转角由4个连续的氨基酸残基组成，第第i个氨基酸残基的个氨基酸残基的 CO和第和第i+3个残基的个残基的 NH 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。氢键维持 转角的稳定结构。uPro (脯氨酸脯氨酸) and gly (甘氨酸甘氨酸) have high propensity for -turns; u -turn promotes formation of antiparallel b b-sheets.(4) 无无规则规则卷曲（卷曲（Random coil ）又称无规卷曲又称无规卷曲(nonregular coil(nonregular coil)或自由
35、回转自由回转（Random coil Random coil ），），指指肽段在空间的不规则排布，是上述几种结构单元以外的其他松散肽链结构形式。在一般球蛋白分子中，往往含有大量的无规则卷曲，它使蛋白质肽链从整体上形成球状构象。 在螺旋与螺旋之间、-折叠与-折叠之间或者螺旋与-折叠之间往往是无规则卷曲。 3. 三级结构三级结构肽链非几何形的进一步折叠肽链非几何形的进一步折叠蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构( (Tertiary Structure) )是指是指一条多肽链一条多肽链在二级在二级结构基础上，结构基础上，进一步卷曲折叠，构成一个不规则的特定构象，它进一步卷曲折叠，构成一个不规则的特定构
36、象，它包括主、侧链在内的所有原子的空间排布。包括主、侧链在内的所有原子的空间排布。生物体重要的生命活动都与蛋白质的三级结构直接相关并且对三级结构有严格要求。 所以三级结构是蛋白质构象中一个至关重要的等级式层次，从整体观念看，它实际包含着除亚基缔合以外的蛋白质分子结构的全部内容。只有三级结构才是蛋白质生物活性只有三级结构才是蛋白质生物活性的特征构象。的特征构象。例如，第一个被阐明具有三级结构的蛋白质鲸肌红蛋白（myoglobin）。 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) 的三级结构的三级结构 N 端端 C端端一条肽链一条肽链8段段-螺旋螺旋+无无规则卷曲卷曲羧基末端无基末端无规则卷曲卷曲含含153个个AA
37、一个血红素辅基一个血红素辅基分子量分子量1760017600无无-S-S-键键外极性内非极性外极性内非极性外圆中空的不对称结构外圆中空的不对称结构分子表面有一空穴分子表面有一空穴肌肉中储存氧并运输氧肌肉中储存氧并运输氧O219631963年，年，Kendrew J C Kendrew J C 确定确定uComplete three-dimensional structureuDue to weak interactions between side (R) groups as well as covalent disulfide bondsWeak interactions：Hydrogen
38、bondsElectrostatic interactions (ionic bonds)Hydrophobic interactionsVan der Waals interactionsInteractions in Tertiary Structure疏水作用力疏水作用力在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。多肽链进行折叠的主要驱动力。65Tertiary structure formed through side chain interactions 664. 四级结构四级结构亚基间的相互关系亚基间的相互关系
39、四级结构：四级结构：是指由两个或两个两个或两个以上具有三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成的特定构象。u其中每条多肽链称为亚基亚基 （subunit） 。通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。u不少蛋白质是由两个以上具有三级结构的多肽链组成的。这些多肽链之间以非共价键多肽链之间以非共价键连接。u四级结构涉及亚基的种类和数目以及各亚基在整个分子中的空间排布，包括亚基的接触位点和相互作用关系，而不包括不包括亚基本身的构象亚基本身的构象。l对亚基种类和数目的确定、亚基空间排布的分析： 寡聚蛋白：寡聚蛋白：由二个或多个亚基组成
40、的蛋白质统称寡聚蛋白质或多体蛋白质（multimericprotein ）。l维持四级结构的主要作用力是疏水作用力主要作用力是疏水作用力，此外，氢键、离子键及Van der Waals力也参与。血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构l是四个亚基的寡聚蛋白；574个AA残基，分子量65000；l是由相同的两条链和两条链组成四聚体；l链由141个AA残基组成， 链由146个AA残基组成；l四条肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基；l每条肽链与一个血红素结合；l运输O2和CO2的功能。三、蛋白质结构与功能的统一性三、蛋白质结构与功能的统一性lFunction is derived f
41、rom structurelStructure is derived from sequencelSimilar sequences have similar functionsSimilar function often implies evolutionary relatednessSequence similarity suggests common evolutionary originMany diseases are related to anomaly（异常）of some proteins -sickle cell anemia and mad cow disease镰状细胞贫
42、血症和疯牛病711.一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系氨基酸序列提供重要的生物化学信息氨基酸序列提供重要的生物化学信息同功蛋白质也叫同功蛋白质也叫同源蛋白质（同源蛋白质（homologous protein），），指不同种指不同种属来源的执行同种生物学功能的蛋白质。属来源的执行同种生物学功能的蛋白质。不同种属来源的同功蛋白质一般具有相同长度或接近相同长度的多肽链。同功蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有的种属来说都是相同的，因此称为不变残基（invariant residue）。但是其他位置的氨基酸因种属不同有相当大的变化，因此称为可变残基（variable residue)，这
43、是同功蛋白质的种属差异的体现这是同功蛋白质的种属差异的体现。（1 1）同功蛋白质氨基酸的种属差异和分子进化）同功蛋白质氨基酸的种属差异和分子进化72 氨基酸残基序号 胰岛素 A8 A9 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 马 Thr Ser Ile Ala不同种属来源的胰岛素分子中氨基酸序列的部分差异不同种属来源的胰岛素分子中氨基酸序列的部分差异73同功蛋白质在组成上的差异也表现在生物进化中亲缘关系的
44、远近。同功蛋白质在组成上的差异也表现在生物进化中亲缘关系的远近。l细胞色素细胞色素C Cc(cytochrome c)c(cytochrome c)是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明：物种进化过程中越接近的生物，细胞色素的一级结构越相似。尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处。l细胞色素C的氨基酸顺序分析资料已被用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树（进化树（evolutionary treeevolutionary tree），），即系统发
45、生树。根据进化树不仅可以研究从单细胞有机体到多细胞有机体的生物进化过程，而且可以粗略估计现存的各类种属生物的分歧时间。74生物生物 与人不同的与人不同的AA数目数目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、猪、羊、狗牛、猪、羊、狗 11马马 12鸡、火鸡鸡、火鸡 13响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21角饺角饺 23小蝇小蝇 25蛾蛾 31小麦小麦 35粗早链孢霉粗早链孢霉 43酵母酵母 44 不同生物与人的不同生物与人的Cytc的的AA差异数目差异数目根据细胞色素根据细胞色素 C的顺的顺序种属差异建立起来序种属差异建立起来的进化树的进化树圆圈代表分歧点圆圈代表分
46、歧点(2)(2)同功蛋白质中氨基酸序列的个体差异和分子病同功蛋白质中氨基酸序列的个体差异和分子病同种蛋白质：同种蛋白质：对于同种生物，具有相同生物活性的蛋白质。个体差异：个体差异：不同生物个体中同种蛋白质的一级结构（氨基酸序列）的细微差异。个体差异常常会引起多种疾病，即分子病。个体差异常常会引起多种疾病，即分子病。分子病：分子病：指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病(基因突变造成的)。镰刀形贫血病（sickle-cell anemia）病因：血红蛋白AA顺序的细微变化 镰刀形贫血病：镰刀形贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为病人
47、体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄，而且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄，而且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。引起头昏、胸闷而导致死亡。谷氨酸谷氨酸Glu（极性）（极性） 缬氨酸缬氨酸Val（非极性）（非极性）-链链N端氨基酸排列顺序端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）
48、（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患（患 者）者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-LysSickle-cell diseaseNormalredbloodcellsSickleshapedredbloodcellsDuetosingleaminoacidchangeinhemoglobin=proteincarriesoxygeninredbloodcells78(3)(3)一级结构的局部断裂与蛋白质的激活一级结构的局部断裂与蛋白质的激活在某些生化过程中，蛋白质分子的部分肽链要按照特定方式先在某些生化过程中，蛋白质分
49、子的部分肽链要按照特定方式先断裂，然后才呈现生物活性。断裂，然后才呈现生物活性。 血液凝固的生化机理血液凝固的生化机理血液存在两个系统：凝血系统和溶血系统凝血系统：纤维蛋白原纤维蛋白（凝血）溶血系统：纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶两套系统发生作用都是酶原激活。 胰岛素原（胰岛素原（proinsulinproinsulin）的激活）的激活胰岛素原与胰岛素（牛胰岛素原的激活）胰岛素原与胰岛素（牛胰岛素原的激活）ArgLysArg（C肽）肽）胰岛素原分为胰岛素原分为A、B、C三段，三段，被类胰蛋白酶被类胰蛋白酶作用后切去作用后切去C肽而转变为活肽而转变为活性胰岛素。性胰岛素。2. 蛋白质空间结构与功能的
50、关系蛋白质空间结构与功能的关系构象决定功能构象决定功能蛋白质的空间结构与生物学功能是统一、对应关系。蛋白质的空间结构与生物学功能是统一、对应关系。（1）变构现象）变构现象有些蛋白质在完成其生物功能时往往空间结构发生一定的变化，从而改变分子的性质，以适应生理功能的需要，这种现象称为变变构现象构现象，又称为别构现象别构现象或变构作用（变构作用（allostery）。例如，血红蛋白运输氧气能力的变化与其变构现象相关。 变构变构脱氧血红蛋白脱氧血红蛋白 氧合血红蛋白氧合血红蛋白对氧的亲和力低对氧的亲和力低 对氧的亲和力高对氧的亲和力高 Hb在完成运输氧的功能时要发生变构作用。在完成运输氧的功能时要发生
51、变构作用。Hb有两种构象：有两种构象：这种蛋白质与效应物之间的结合引起整个蛋白质分子构象发生改变的现象就称为蛋白质的变构效应变构效应。此外，当第一亚基与氧结合后，其余三个亚基的构象发生改变，整个分子的构象由致密态变成松弛态由致密态变成松弛态，使得Hb对氧的运输能力大大加强。这种一个亚基与氧结合后增强其余亚基对氧的亲和力的现象，称为协同效应协同效应(cooperativity) 。Hb的两种不同构象态的两种不同构象态tense state 致密态致密态relaxed state 松弛态松弛态（2）变性作用）变性作用天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，由氢键、盐键等次级键维系的高级结构被破坏，使蛋
52、白质分子的内部结构发生了变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质改变。这种现象称为蛋白质的变性作用变性作用(denaturation)(denaturation)。u组分及分子量未变，但一级结构未遭破坏。一级结构未遭破坏。u从紧密有序的状态变成松散无序的状态。从紧密有序的状态变成松散无序的状态。u氢键、盐键等次级键被破坏。变性作用变性作用(denaturation)(denaturation)紧密有序的状态变成松散无序的状态紧密有序的状态变成松散无序的状态导致蛋白质变性的因素：导致蛋白质变性的因素：热、紫外光、X-射线、超声波、激烈的搅拌以及强酸、强碱、乙醇等。变性特点及表现：变性特点及
53、表现：首先丧失生物学活性（如酶失去催化能力等）；理化性质改变，蛋白变性后，疏水基团外露，溶解度降低，易沉淀析出；结晶能力丧失；分子形状改变，球蛋白变成松散结构，既肽链松散，反应基团（如：SH）增加，易被水解酶消化；黏度增加。第五节第五节 蛋白质的性质蛋白质的性质一、蛋白质分子的大小二、两性解离和等电点三、胶体性质四、沉淀作用五、变性作用六、颜色反应87一、蛋白质分子的大小一、蛋白质分子的大小u蛋白质相对分子质量很大，从几千到上百万。u相对分子质量的大小是在某种测试方法下得到的蛋白质的相对质量。同种蛋白质在不同方法下测得的相对分子量大小不完全相同。1. 相对分子质量相对分子质量蛋白质是巨大分子蛋
54、白质是巨大分子2. 测定方法测定方法蛋白质相对分子质量的测定蛋白质相对分子质量的测定（1）根据化学组成测定最低相对分子质量）根据化学组成测定最低相对分子质量应该与其他物理化学测定方法配合使用。88（2）用物理化学方法来测定蛋白质的相对分子质量）用物理化学方法来测定蛋白质的相对分子质量渗透压测定法渗透压测定法：超离心法：超离心法：其测定相对分子质量一般有沉降速度法沉降速度法 （sedimentation velocity method）和沉降平衡方法沉降平衡方法 （sedimentation equilibriummethod） 两种。沉降系数或沉降常数（沉降系数或沉降常数（sedimentat
55、ion coefficient）：由于实验技术和理论发展的结果，本法已成为测定生物体各种大分子分子量的最标准的方法。89二、两性解离和等电点二、两性解离和等电点1. 两性解离两性解离蛋白质是多价解离的两性电解质蛋白质是多价解离的两性电解质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质分子所带电荷的性质和数量是由蛋白质分子中的可解离基团的种类和数目及其溶液的pH值所决定的。90u当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白蛋白质质的的等等电电点点(
56、isoelectric point, pI) 。u蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。u在不含任何盐的纯水中进行蛋白质等电点测定时，所得的等电点称为等离子点（等离子点（isoionic point）。等电点不一定等于等离子点。2. 等电点等电点在等电点时蛋白质的多种性质达到最低值在等电点时蛋白质的多种性质达到最低值91lNo net chargelMinimum solubility in waterlprotein will precipitate out at its isoelectric pointlcan separate amino acids and peptides
57、 based in electrophoresis（电泳）电泳）:+ charged amino acids move to - electrode- charged amino acids move to + electrodeamino acids at their isoelectric points do not moveIsoelectric point三、胶体性质三、胶体性质l由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围的大小达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。l蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象
58、、布郎运动、丁达尔现象、布郎运动、不能通过半透膜不能通过半透膜等。l蛋白质多肽链上含有许多极性基团，如NH3、COO 、OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性。因而蛋白质溶液是亲亲水胶体水胶体。1. 胶体性质胶体性质蛋白质溶液是亲水胶体蛋白质溶液是亲水胶体93v由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透透析（或透析）（析（或透析）（dialysis）法将蛋白质和一些小分子物质分开。v超超滤滤 (ultrafiltration) 是利用外加压力或离心力，使水及其他小分子物质通过半透膜，而蛋白质留在膜上。超滤是工业生产中常用的一种蛋白质纯化方法。2. 渗析渗析蛋白质的渗析和
59、超滤行为蛋白质的渗析和超滤行为94l 蛋白质胶体稳定的因素：蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜四、沉淀作用四、沉淀作用1. 稳定因素稳定因素蛋白质沉淀主要是破坏两个稳定因素蛋白质沉淀主要是破坏两个稳定因素l 当条件改变，稳定性破坏时，蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出，此现象即为蛋白质的沉淀作用（沉淀作用（precipitationprecipitation）。952. 沉淀方法沉淀方法盐析是最常用的沉淀方法盐析是最常用的沉淀方法u在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质沉淀析出的作用，称为盐析盐析（salting outsalt
60、ing out）。 破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。u各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为分段盐析分段盐析（fractional salting outfractional salting out） 。 96五、变性作用五、变性作用1. 变性的本质变性的本质变性是空间结构的解体变性是空间结构的解体l因理化因素引起维持蛋白质空间结构的氢键、盐键等次次级键级键被被破坏破坏，导致其空空间结间结构的解体构的解体。l蛋白
61、质的变性分为可逆可逆变变性（三性（三级级以上以上结结构）构）和不可逆不可逆变变性性（二（二级结级结构）构）。l但一级结构未遭破坏。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，即存在复复性性 (renaturation) 的可能。97 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性2. 变性的应用变性的应用变性作用具有实际意义变性作用具有实际意义u变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固（凝固（coagulation）。如煮鸡蛋、做豆腐。u 应用举例应用举
62、例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。的必要条件。 99六、颜色反应六、颜色反应1. 一般颜色反应一般颜色反应蛋白质具有氨基酸的颜色反应蛋白质具有氨基酸的颜色反应反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的Pr或aa双缩脲反应NaOH、CuSO2紫红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)及 HNO3、HNO2混合物红色Tyr黄色反应浓HNO3黄色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反应乙醛酸试剂沿 管 壁 慢 加 浓H2
63、SO4两液层间出现紫色环Trp（白明胶不含Trp）坂口反应Sakaguch反应)-萘酚、NaClO在NaOH溶液中红色胍基Arg酚试剂反应碱性CuSO4、磷钨酸及鳞钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基-氨基酸N1002. 特殊颜色反应特殊颜色反应蛋白质还具有氨基酸不具备的反应蛋白质还具有氨基酸不具备的反应双缩脲（双缩脲（biuretbiuret）反应：反应：(碱性溶液碱性溶液)Cu2+红紫色络合物红紫色络合物双缩双缩脲脲碱性溶液中能与硫酸铜发生碱性溶液中能与硫酸铜发生反应，产生红紫色络合物，此反应反应，产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。称为双缩脲反应。双缩脲双缩脲
64、101第六节第六节 蛋白质及氨基酸的分离纯化与测定蛋白质及氨基酸的分离纯化与测定（自学）（自学）102构型构型(configuration)与构象与构象( conformation)构型(configuration)是指不对称碳原子所连接的四个不同的原子或基团在空间中的两种不同的排列。构象( conformation)是指一个由几个碳原子组成的分子，因一些单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基团或原子的空间排列。构型的改变必然会引起共价键的破坏，并形成一些新键（如氨基酸由D型变成L型）。构象的改变并不需要共价键的断裂，只需要单键的旋转就可以产生新的构象。103谢谢！谢谢！本本PPT的相关内容仅供的相关内容仅供教学使用，图片及文字教学使用，图片及文字内容为原出版社或原作内容为原出版社或原作者所有，请勿随意拷贝、者所有，请勿随意拷贝、传播。如要使用，请追传播。如要使用，请追溯并注明其原始出处。溯并注明其原始出处。
