《第四节基因表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第四节基因表达（49页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四节第四节第四节第四节 基因表达基因表达基因表达基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中基因表达是指结构基因在生物体中基因表达是指结构基因在生物体中基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。的转录、翻译以及所有加工过程。的转录、翻译以及所有加工过程。的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指基因工程中基因高效表达研究是指基因工程中基因高效表达研究是指基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即外源基因在某种细胞中的表达活动，即外源基因在某种细胞中的表达活动，即外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基剪切下外
2、源基因片段，拼接到另一个基剪切下外源基因片段，拼接到另一个基剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性因表达体系中，使其能获得原生物活性因表达体系中，使其能获得原生物活性因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。又可高产的表达产物。又可高产的表达产物。又可高产的表达产物。 最佳的基因表达体系：目的最佳的基因表达体系：目的最佳的基因表达体系：目的最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳基因的表达产量高、表达产物稳基因的表达产量高、表达产物稳基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易定、生物活性高和表达产物容易定、生物活性高和表达产物
3、容易定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。分离纯化。分离纯化。分离纯化。一、宿主细胞的选择一、宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞适合目的基因表达的宿主细胞适合目的基因表达的宿主细胞适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求应满足以下要求应满足以下要求应满足以下要求: : : : 容易获得较高浓度的细胞；容易获得较高浓度的细胞；容易获得较高浓度的细胞；容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素； 发热量低、需氧低、适当的发酵发热量低、需氧低
4、、适当的发酵温度和细胞形态；温度和细胞形态； 容易进行代谢调控；容易进行代谢调控； 容易进行容易进行DNADNA重组技术操作；重组技术操作； 产物的产量、产率高，产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。产物容易提取纯化。 宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆第一类为原核细胞：常用有大肠杆第一类为原核细胞：常用有大肠杆第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、第二类为真核细胞：常用有酵母、第
5、二类为真核细胞：常用有酵母、第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。丝状真菌、哺乳动物细胞等。丝状真菌、哺乳动物细胞等。丝状真菌、哺乳动物细胞等。 原核细胞原核细胞原核细胞原核细胞 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 因为大肠杆菌的分子遗传学因为大肠杆菌的分子遗传学因为大肠杆菌的分子遗传学因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前研究深入，生长迅速，所以目前研究深入，生长迅速，所以目前研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的仍是基因工程研究中采用最多的仍是基因工程研究中采用最多的仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。原核表达体系。原核表达体系。原核表
6、达体系。 表达基因产物形式多样表达基因产物形式多样表达基因产物形式多样表达基因产物形式多样: : : :细胞内细胞内细胞内细胞内不溶性表达不溶性表达不溶性表达不溶性表达( ( ( (包含体包含体包含体包含体) ) ) )、细胞内可、细胞内可、细胞内可、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。溶性表达、细胞周质表达等。溶性表达、细胞周质表达等。溶性表达、细胞周质表达等。 大肠杆菌中的表达不存在信大肠杆菌中的表达不存在信大肠杆菌中的表达不存在信大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取号肽，产品多为胞内产物，提取号肽，产品多为胞内产物，提取号肽，产品多为胞内产物，提取困难。困难。困难。困难。
7、因分泌能力不足，真核蛋白质常因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质产物蛋白质N N端多余一个蛋氨酸端多余一个蛋氨酸残基。残基。 其内毒素很难除去。其内毒素很难除去。 枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌 分泌能力强，蛋白质不形成包分泌能力强，蛋白质不形成包分泌能力强，蛋白质不形成包分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。含体。产物蛋白质不能糖基化。含体。产物蛋白质不能糖基化。含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降有
8、很强的胞外蛋白酶对产物降有很强的胞外蛋白酶对产物降有很强的胞外蛋白酶对产物降解。解。解。解。 链霉菌链霉菌链霉菌链霉菌 作为外源性基因表达受到重作为外源性基因表达受到重作为外源性基因表达受到重作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分视。不致病、使用安全、分视。不致病、使用安全、分视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基泌能力强、表达产物可糖基泌能力强、表达产物可糖基泌能力强、表达产物可糖基化。化。化。化。真核细胞真核细胞真核细胞真核细胞 酵母酵母酵母酵母 酵母菌是研究基因表达最酵母菌是研究基因表达最酵母菌是研究基因表达最酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因有效的
9、单细胞真核微生物。其基因有效的单细胞真核微生物。其基因有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍组小，世代时间短，有单倍体双倍组小，世代时间短，有单倍体双倍组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。体两种形式，繁殖迅速，无毒性。体两种形式，繁殖迅速，无毒性。体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不能外分泌，产物可糖基化。已有不能外分泌，产物可糖基化。已有不能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达少真核基因成功表达少真核基因成功表达少真核基因成功表达 丝状真菌丝状真菌丝状真菌丝状真菌 优点：分泌能力强，能正优点：分泌能力强，能正优点
10、：分泌能力强，能正优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖确进行翻译后加工（肽剪切糖确进行翻译后加工（肽剪切糖确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后处理基化）有成熟的发酵和后处理基化）有成熟的发酵和后处理基化）有成熟的发酵和后处理工艺。工艺。工艺。工艺。 哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞 优点：表达产物可由重组转化优点：表达产物可由重组转化优点：表达产物可由重组转化优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。细胞分泌到培养液中，纯化容易。细胞分泌到培养液中，纯化容易。细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。产物是糖基化的接近天然物。
11、产物是糖基化的接近天然物。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培缺点：生长慢，生产率低，培缺点：生长慢，生产率低，培缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度养条件苛刻，费用高，培养液浓度养条件苛刻，费用高，培养液浓度养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。稀。稀。稀。 目前使用最广泛的宿主菌目前使用最广泛的宿主菌目前使用最广泛的宿主菌目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母是大肠杆菌和酿酒酵母是大肠杆菌和酿酒酵母是大肠杆菌和酿酒酵母, , , ,已建立已建立已建立已建立了许多适合它们的克隆载体和了许多适合它们的克隆载体和了许多适合它们的克隆载体和了许多适合它们的克隆
12、载体和DNADNADNADNA导入方法。许多外源基因已导入方法。许多外源基因已导入方法。许多外源基因已导入方法。许多外源基因已获得成功表达。获得成功表达。获得成功表达。获得成功表达。二、大肠杆菌中的基因表达二、大肠杆菌中的基因表达 载体载体 基因工程的目的和基本手段，是选基因工程的目的和基本手段，是选用合适的用合适的载体载体把供体把供体DNADNA（外源基因）（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的大量的目的DNADNA分子或转录表达为相分子或转录表达为相应的产物。应的产物。 基因工程载体分为：基因工程载体分为：基因工程载体分为：基因工程载体分为： 克
13、隆载体克隆载体克隆载体克隆载体 转录载体转录载体转录载体转录载体 表达载体表达载体表达载体表达载体 克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体 转录载体转录载体转录载体转录载体转录载体转录载体 DNA DNA DNA DNADNADNA RNA RNA RNA 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 表表表表表表 达达达达达达 载载载载载载 体体体体体体原核细胞的基因组特点：原核细胞的基因组特点：原核细胞的基因组特点：原核细胞的基因组特点：染色质为环状双股染色质为环状双股染色质为环状双股染色质为环状双股DNADNA分子分子分子分子具有操纵子结构具有操纵子结构具有操纵子结构具有操纵子结构结构
14、基因多为单拷贝结构基因多为单拷贝结构基因多为单拷贝结构基因多为单拷贝特定区域分布特异特定区域分布特异特定区域分布特异特定区域分布特异DNADNA顺序顺序顺序顺序 因此外源因此外源因此外源因此外源DNADNA分子可以插入原核细胞分子可以插入原核细胞分子可以插入原核细胞分子可以插入原核细胞DNADNA复制体系的特定区段复制体系的特定区段复制体系的特定区段复制体系的特定区段基因工程克隆载体的特点：基因工程克隆载体的特点：基因工程克隆载体的特点：基因工程克隆载体的特点：具有复制子具有复制子具有复制子具有复制子有单一限制内切酶切位点或多克隆有单一限制内切酶切位点或多克隆有单一限制内切酶切位点或多克隆有单
15、一限制内切酶切位点或多克隆位点位点位点位点有选择性遗传标记如抗药基因有选择性遗传标记如抗药基因有选择性遗传标记如抗药基因有选择性遗传标记如抗药基因拷贝数高拷贝数高拷贝数高拷贝数高生物安全性好生物安全性好生物安全性好生物安全性好目前使用的载体按特性可分为：目前使用的载体按特性可分为：目前使用的载体按特性可分为：目前使用的载体按特性可分为：质粒质粒质粒质粒噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体黏性质粒黏性质粒黏性质粒黏性质粒M13M13M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体酵母酵母酵母酵母真核细胞病毒载体真核细胞病毒载体真核细胞病毒载体真核细胞病毒载体 细菌质粒的生物学特性细菌质粒的生物学特性细菌质粒的生物学特性
16、细菌质粒的生物学特性 质粒的定义：质粒的定义：质粒的定义：质粒的定义： 质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双股以外的共价闭环的双股以外的共价闭环的双股以外的共价闭环的双股DNADNA分子，具分子，具分子，具分子，具有独立自主复制和调控能力，可赋予有独立自主复制和调控能力，可赋予有独立自主复制和调控能力，可赋予有独立自主复制和调控能力，可赋予宿主细胞一定的生物性状。宿主细胞一定的生物性状。宿主细胞一定的生物性状。宿主细胞一定的生物性状。质粒的生物学特性质粒的生物学特性大小大小 小
17、型质粒小型质粒1.515kb , 大型质粒大型质粒60120kb复制类型复制类型: 严紧型质粒严紧型质粒, 松弛型质粒松弛型质粒拷贝数拷贝数电泳特点电泳特点不相容性不相容性 质粒的分类质粒的分类:按复制型式按复制型式严紧型严紧型 松弛型松弛型按基因转移性按基因转移性传递性质粒传递性质粒 非传递非传递性质粒性质粒按遗传性状产物分类按遗传性状产物分类: 抗生素抗性抗生素抗性 限制酶修饰酶系统限制酶修饰酶系统 真核基因在原核细胞中表达载体必真核基因在原核细胞中表达载体必真核基因在原核细胞中表达载体必真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：须具备条件：须具备条件：须具备条件：载体能够独立复制。载体本
18、身是载体能够独立复制。载体本身是载体能够独立复制。载体本身是载体能够独立复制。载体本身是 一个复制子，具有复制起点。一个复制子，具有复制起点。一个复制子，具有复制起点。一个复制子，具有复制起点。应具有灵活的克隆位点和方便的应具有灵活的克隆位点和方便的应具有灵活的克隆位点和方便的应具有灵活的克隆位点和方便的 筛选标记，以利于外源基因的克筛选标记，以利于外源基因的克筛选标记，以利于外源基因的克筛选标记，以利于外源基因的克 隆鉴定和筛选。隆鉴定和筛选。隆鉴定和筛选。隆鉴定和筛选。应具有很强的启动子，能为应具有很强的启动子，能为应具有很强的启动子，能为应具有很强的启动子，能为 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌
19、大肠杆菌RNARNARNARNA聚合酶所识别。聚合酶所识别。聚合酶所识别。聚合酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受应具有阻遏子，使启动子受应具有阻遏子，使启动子受应具有阻遏子，使启动子受 到控制，只有当诱导时才能到控制，只有当诱导时才能到控制，只有当诱导时才能到控制，只有当诱导时才能 进行转录。进行转录。进行转录。进行转录。应具有很强的终止子，只转录应具有很强的终止子，只转录应具有很强的终止子，只转录应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的克隆的基因，所产生的克隆的基因，所产生的克隆的基因，所产生的mRNAmRNAmRNAmRNA较为较为较为较为稳定。稳定。稳定。稳定。所产生的所产生的所产
20、生的所产生的mRNAmRNAmRNAmRNA必须具有翻译的必须具有翻译的必须具有翻译的必须具有翻译的起始信号起始信号起始信号起始信号AUGAUGAUGAUG和和和和SDSDSDSD序列，以便转录序列，以便转录序列，以便转录序列，以便转录后顺利翻译。后顺利翻译。后顺利翻译。后顺利翻译。常用表达载体常用表达载体常用表达载体常用表达载体 pBV220pBV220系统系统系统系统质粒质粒质粒质粒pBV220pBV220的结构的结构的结构的结构pBV220pBV220系统国内使用最多的载体系统国内使用最多的载体, ,其组成其组成: :来源于来源于pUC8pUC8多克隆位点多克隆位点核糖体核糖体rrnBr
21、rnB基因终止信号基因终止信号pBR322pBR322第第4225422537353735位位pUC18pUC18第第20662066680680位位噬菌体噬菌体cIts857cIts857抑制子基因及抑制子基因及P PR R R R启动子启动子pRC23pRC23的的P PL L L L启动子及启动子及SDSD序列序列 pBV220pBV220系统优点：系统优点： cIts857cIts857抑制子基因抑制子基因P PL L L L启动子同在一个载启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易酶活性较低的宿主细胞，
22、使表达产物不易降解。降解。 SDSD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始始ATGATG的外源基因，可表达非融合蛋白；的外源基因，可表达非融合蛋白； 强的转录终止信号可防止出现强的转录终止信号可防止出现“通读通读”现象，有利于质粒现象，有利于质粒- -宿主系统的稳定；宿主系统的稳定；整个质粒仅为整个质粒仅为整个质粒仅为整个质粒仅为3.66kb3.66kb，有利于增，有利于增，有利于增，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大加其拷贝数及容量，可以插入大加其拷贝数及容量，可以插入大加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；片段外源基因；片段外源基因；片段外源基因；P PR
23、 RR和和和和P PL LL启动子串联，可以增强启启动子串联，可以增强启启动子串联，可以增强启启动子串联，可以增强启动作用；动作用；动作用；动作用； 本系统宿主菌可以是大肠杆菌本系统宿主菌可以是大肠杆菌本系统宿主菌可以是大肠杆菌本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101HB101HB101HB101、JM103JM103JM103JM103、C600C600C600C600，质粒拷贝数较多，因此，质粒拷贝数较多，因此，质粒拷贝数较多，因此，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要。小量简便快速提取即可满足需要。小量简便快速提取即可满足需要。小量简便快速提取即可满足需要。 本系统为温度诱导，外
24、源基因表达本系统为温度诱导，外源基因表达本系统为温度诱导，外源基因表达本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的量可达细胞总蛋白的量可达细胞总蛋白的量可达细胞总蛋白的20%20%20%20%30%30%30%30%； 产物以包含体形式存在不易降解均一产物以包含体形式存在不易降解均一产物以包含体形式存在不易降解均一产物以包含体形式存在不易降解均一性好；性好；性好；性好； pBG-2pBG-2是由是由是由是由pBV220pBV220系统衍生系统衍生系统衍生系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。的便于产物纯化的融合表达载体。的便于产物纯化的融合表达载体。的便于产物纯化的融合表达载体。 该质粒在
25、该质粒在该质粒在该质粒在P PR RRP PL LL启动子下游插入启动子下游插入启动子下游插入启动子下游插入proteinGproteinG的的的的IgGFcIgGFc结合区基因片结合区基因片结合区基因片结合区基因片段段段段180180个碱基对，下游是多克隆位个碱基对，下游是多克隆位个碱基对，下游是多克隆位个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白具有与点，引入剪切融合蛋白具有与点，引入剪切融合蛋白具有与点，引入剪切融合蛋白具有与IgGIgG结合的活性，可用亲和层析。简结合的活性，可用亲和层析。简结合的活性，可用亲和层析。简结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。化下游工艺。化下游工艺。化下
26、游工艺。融合表达质粒融合表达质粒融合表达质粒融合表达质粒pBG-2pBG-2的结构的结构的结构的结构影响目的基因在大肠杆菌中影响目的基因在大肠杆菌中影响目的基因在大肠杆菌中影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素表达的因素表达的因素表达的因素 外源基因表达产量与细胞浓度和细外源基因表达产量与细胞浓度和细外源基因表达产量与细胞浓度和细外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞胞表达产量呈正相关。单个细胞胞表达产量呈正相关。单个细胞胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：产量取决于：产量取决于：产量取决于： 外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数 外源基因的表达
27、效率外源基因的表达效率外源基因的表达效率外源基因的表达效率 启动子的强弱启动子的强弱启动子的强弱启动子的强弱 核糖体接合位点的有效性核糖体接合位点的有效性核糖体接合位点的有效性核糖体接合位点的有效性 SDSD序列和起始密码序列和起始密码序列和起始密码序列和起始密码ATGATG的间距的间距的间距的间距 密码子组成密码子组成密码子组成密码子组成 表达产物的稳定性表达产物的稳定性表达产物的稳定性表达产物的稳定性 细胞代谢负荷细胞代谢负荷细胞代谢负荷细胞代谢负荷 工程菌的培养条件工程菌的培养条件工程菌的培养条件工程菌的培养条件真核基因在大肠杆菌中的表真核基因在大肠杆菌中的表真核基因在大肠杆菌中的表真核
28、基因在大肠杆菌中的表达形式达形式达形式达形式 以融合蛋白的形式表达药物基因以融合蛋白的形式表达药物基因以融合蛋白的形式表达药物基因以融合蛋白的形式表达药物基因 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。合蛋白。合蛋白。合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；定，易实现高效表达；定，易实现高效表达；定，易实现高效表达； 缺点：只能作抗原用。缺点：只能作抗原用。缺点：只能作
29、抗原用。缺点：只能作抗原用。 以非融合蛋白的形式表达药物基因以非融合蛋白的形式表达药物基因以非融合蛋白的形式表达药物基因以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的白质以真核蛋白的白质以真核蛋白的白质以真核蛋白的mRNAmRNA的的的的AUGAUG为起为起为起为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。始，在其氨基端不含细菌多肽序列。始，在其氨基端不含细菌多肽序列。始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性；优点：保持原有蛋白活性；优点：保持原有蛋白活性；优
30、点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏。缺点：易被蛋白酶破坏。缺点：易被蛋白酶破坏。缺点：易被蛋白酶破坏。 分泌型表达药物基因分泌型表达药物基因分泌型表达药物基因分泌型表达药物基因 优点：在周质中稳定，有活性，优点：在周质中稳定，有活性，优点：在周质中稳定，有活性，优点：在周质中稳定，有活性，不不不不 含蛋氨酸残基；含蛋氨酸残基；含蛋氨酸残基；含蛋氨酸残基； 缺点：产量不高，缺点：产量不高，缺点：产量不高，缺点：产量不高， 信号肽不被切信号肽不被切信号肽不被切信号肽不被切割。割。割。割。三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因表达载体载体载体载体 酵母
31、载体可以携带外源基因在酵母载体可以携带外源基因在酵母载体可以携带外源基因在酵母载体可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母酵母细胞内保存和复制，并随酵母酵母细胞内保存和复制，并随酵母酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代分裂传递到子代分裂传递到子代分裂传递到子代DNADNADNADNA和和和和RNARNARNARNA单位。单位。单位。单位。 载体的复制系列可分四类：载体的复制系列可分四类：载体的复制系列可分四类：载体的复制系列可分四类： YepYepYepYep类（类（类（类（yeast yeast yeast yeast yeast yeast episomalepisomal
32、episomalepisomalepisomalepisomal plasmid plasmid plasmid plasmid plasmid plasmid， 酵母附加体质粒）酵母附加体质粒）酵母附加体质粒）酵母附加体质粒） YRpYRpYRpYRp类（类（类（类（yeast replication plasmidyeast replication plasmidyeast replication plasmidyeast replication plasmidyeast replication plasmidyeast replication plasmid， 酵母复制型质粒）酵母复制型
33、质粒）酵母复制型质粒）酵母复制型质粒） YCpYCpYCpYCp类（类（类（类（yeast yeast yeast yeast yeast yeast centromericcentromericcentromericcentromericcentromericcentromeric plasmid plasmid plasmid plasmid plasmid plasmid， 酵母着丝粒质粒）酵母着丝粒质粒）酵母着丝粒质粒）酵母着丝粒质粒） YIpYIpYIpYIp类（类（类（类（yeast integrative plasmidyeast integrative plasmidyeast
34、 integrative plasmidyeast integrative plasmidyeast integrative plasmidyeast integrative plasmid， 酵母整合型质粒）酵母整合型质粒）酵母整合型质粒）酵母整合型质粒） 克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体 表达载体表达载体表达载体表达载体 普通表达载体普通表达载体普通表达载体普通表达载体 精确表达载体精确表达载体精确表达载体精确表达载体 - -因子分泌型表达载体因子分泌型表达载体因子分泌型表达载体因子分泌型表达载体H HH： Hind Hind Hind 位点位点位点 B :B :B :BamHBamHBa
35、mH I I I位点位点位点 TTT:酵母主要蛋白酶加工位点酵母主要蛋白酶加工位点酵母主要蛋白酶加工位点酵母主要蛋白酶加工位点酵母主要蛋白酶加工位点酵母主要蛋白酶加工位点影响目的基因在酵母菌中表影响目的基因在酵母菌中表影响目的基因在酵母菌中表影响目的基因在酵母菌中表达的因素达的因素达的因素达的因素外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数外源基因的表达效率外源基因的表达效率外源基因的表达效率外源基因的表达效率 启动子启动子启动子启动子分泌信号的效率分泌信号的效率分泌信号的效率分泌信号的效率终止序列的影响终止序列的影响终止序列的影响终止序列的影响外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖
36、基化外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响宿主菌株的影响宿主菌株的影响宿主菌株的影响菌体生长力强菌体生长力强菌体生长力强菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱菌体内源蛋白酶要较弱菌体内源蛋白酶要较弱菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定菌体性能稳定菌体性能稳定菌体性能稳定 分泌能力强分泌能力强分泌能力强分泌能力强四、动物细胞中的基因表达四、动物细胞中的基因表达四、动物细胞中的基因表达四、动物细胞中的基因表达 哺乳动物细胞外源基因表达产物哺乳动物细胞外源基因表达产物哺乳动物细胞外源基因表达产物哺乳动物细胞外源基因表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养可由重组转化的细胞分泌到培养可由重组转化的细胞分
37、泌到培养可由重组转化的细胞分泌到培养 液中，使产物易纯化。液中，使产物易纯化。液中，使产物易纯化。液中，使产物易纯化。 基因产物糖基化接近天然产物。基因产物糖基化接近天然产物。基因产物糖基化接近天然产物。基因产物糖基化接近天然产物。 细胞生长慢，生产率低，细胞生长慢，生产率低，细胞生长慢，生产率低，细胞生长慢，生产率低， 条件刻苛，费用高，条件刻苛，费用高，条件刻苛，费用高，条件刻苛，费用高， 培养液浓度较小。培养液浓度较小。培养液浓度较小。培养液浓度较小。 表达的外源细胞均为传代细胞表达的外源细胞均为传代细胞表达的外源细胞均为传代细胞表达的外源细胞均为传代细胞 表达产物是否致癌尚有疑问。表达
38、产物是否致癌尚有疑问。表达产物是否致癌尚有疑问。表达产物是否致癌尚有疑问。 主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较表达体系表达体系表达体系表达体系 产产产产 物物物物 产生部位产生部位产生部位产生部位 培养方式培养方式培养方式培养方式 提提提提 纯纯纯纯 产物活性产物活性产物活性产物活性 潜在危性潜在危性潜在危性潜在危性大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 多肽蛋白质多肽蛋白质多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内菌体内菌体内 容易容易容易容易 一般一般一般一般 对原核好对原核好对原核好对原核好
39、不大不大不大不大 融合蛋白质融合蛋白质融合蛋白质融合蛋白质 部分高产部分高产部分高产部分高产 对真核差对真核差对真核差对真核差 酵酵酵酵 母母母母 多肽蛋白质多肽蛋白质多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内菌体内菌体内 容易容易容易容易 菌体内菌体内菌体内菌体内 真核的接近真核的接近真核的接近真核的接近 不大不大不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌外分泌外分泌 可高产可高产可高产可高产 稍复杂稍复杂稍复杂稍复杂 天然产物天然产物天然产物天然产物 哺乳动物哺乳动物哺乳动物哺乳动物 完完完完 整整整整 外分泌外分泌外分泌外分泌 较难成本高较难成本高较难成本高较难成本高 简单简单简单简单 可达天然可达天然可达天然可达天然 需注意需注意需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白糖基化蛋白糖基化蛋白 可高产可高产可高产可高产 产物产物产物产物 致癌致癌致癌致癌
