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1、 细胞培养细胞培养第一章第一章 绪绪 论论 细细胞胞是是一一切切生生命命现现象象的的基基石石和和载载体体，事事实实上上人人体体诸诸多多的的奥奥秘秘，包包括括生生理理的的和和病病理理的的都都是是从从细细胞胞的的活活动动中中揭揭示示出出来来。细细胞胞的的信信息息传传递递、代代谢谢、增增殖殖、遗遗传传、变变异异、分分化化、疾疾病病、衰衰老老和和死死亡亡等等无无一一不不是是整整个机体生命过程的反映，甚至是缩影。个机体生命过程的反映，甚至是缩影。细胞的发现和细胞学的创立是细胞的发现和细胞学的创立是“十九世纪三大发十九世纪三大发现之一现之一”；“每一个生物学问题的关键最终必然从每一个生物学问题的关键最终必
2、然从细胞中去寻找细胞中去寻找”。研究细胞有多种方式、多条途径以及不同层次，研究细胞有多种方式、多条途径以及不同层次，但最重要的是对单个或群体细胞的观察与分析。其但最重要的是对单个或群体细胞的观察与分析。其中细胞培养几乎可以最直接、最简单和最准确地反中细胞培养几乎可以最直接、最简单和最准确地反映生命的各种活动规律，以及部分地提供在机体映生命的各种活动规律，以及部分地提供在机体中发生的各种信息。中发生的各种信息。细胞培养是一门技术，包含有诸多方面的知识，细胞培养是一门技术，包含有诸多方面的知识，涉及细胞生物学、生物化学、分子生物学、动涉及细胞生物学、生物化学、分子生物学、动物学与植物学、病原学、遗
3、传学、肿瘤学、生物学与植物学、病原学、遗传学、肿瘤学、生物工程学甚至光学、物理学等学科，因此学习物工程学甚至光学、物理学等学科，因此学习细胞培养应有一定的其他学科的知识，操作时细胞培养应有一定的其他学科的知识，操作时刻不忘刻不忘“无菌无菌”概念。概念。一、体外培养的概念一、体外培养的概念体外培养技术是一门以模拟体内生长条件为体外培养技术是一门以模拟体内生长条件为基础而建立的基础而建立的“活体活体”实验技术。其相对于体内实验技术。其相对于体内试验，具有能够简化细胞生长环境、明确生长条试验，具有能够简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测件、便于施加实验因素、容易获得
4、活体直接观测结果以及方便控制培养产物等优点。结果以及方便控制培养产物等优点。体体外外培培养养(in vitroculture)：是是将将活活体体结结构构成成分分(如如活活体体组组织织、活活体体细细胞胞或或活活体体器器官官等等)甚甚或或活活的的个个体体从从体体内内或或其其寄寄生生体体内内取取出出，模模拟拟体体内内的的生生理理环环境境，在在无无菌菌、适适当当温温度度和和一一定定营营养养条条件件下下使使之之存存活活和和生生长发育的方法。长发育的方法。按按照照体体外外培培养养的的结结构构成成分分，可可将将体体外外培培养养人人为为分为：分为：组织培养组织培养(tissueculture)细胞培养细胞培养
5、(cellculture)器官培养器官培养(organculture)组织培养组织培养:指从生物体内取出活的组织指从生物体内取出活的组织(多指组织块）在多指组织块）在体外进行培养的方法。体外进行培养的方法。组织培养的对象在体外可以发生分化并保持组织的组织培养的对象在体外可以发生分化并保持组织的结构和功能，但不具备器官的结构和功能特点。结构和功能，但不具备器官的结构和功能特点。细胞培养细胞培养：指将活细胞：指将活细胞(尤其是分散的细胞尤其是分散的细胞)在体外进行在体外进行培养的方法。培养的方法。细胞培养强调在培养过程中分散的细胞不在形成组细胞培养强调在培养过程中分散的细胞不在形成组织。包括单细胞
6、的培养、细胞克隆化培养。织。包括单细胞的培养、细胞克隆化培养。器官培养器官培养：指从生物体内取出活的器官：指从生物体内取出活的器官(一般是胚胎器一般是胚胎器官官)、器官的一部分在体外进行培养的方法。、器官的一部分在体外进行培养的方法。器官培养的对象在体外环境下也可能发生一定程度器官培养的对象在体外环境下也可能发生一定程度的分化，但始终保持器官的基本结构和功能特征。的分化，但始终保持器官的基本结构和功能特征。事实上，三种培养方法没有截然的界限。事实上，三种培养方法没有截然的界限。 组组织织培培养养过过程程中中，培培养养组组织织不不能能在在体体外外长长期期维维持持其其结结构构和和功功能能，培培养养
7、的的时时间间长长，经经过过反反复复传传代代，细细胞胞出出现现单单一一化化现现象象趋趋向向单单一一类类型型的的细细胞胞最最终终成成为为细细胞胞培培养养。同同样样细细胞胞在在体体外外培培养养时时也也是是相相互互依依存存的的，而而不不是是各各自自为为政政，表表现现为为一一定定的的“组组织织”特征，故组织培养和细胞培养实为同义词。特征，故组织培养和细胞培养实为同义词。是否有体内培养是否有体内培养(in vivoculture)？ 体内培养体内培养(invivoculture)：将活体结构将活体结构成分成分(如活体组织、活体细胞、活体器官等如活体组织、活体细胞、活体器官等)甚至活的个体从体内或其寄生体内
8、取出，放甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，放在其他生物体内让其生长和发育的方法。在其他生物体内让其生长和发育的方法。最常见的体内培养方式就是移植最常见的体内培养方式就是移植(trans-Plantation)。二、体外培养技术的发展历史二、体外培养技术的发展历史19世世纪纪后后叶叶实实验验胚胚胎胎学学的的兴兴起起拉拉开开了了体体外外培培养养技技术术的的序幕，一些著名实验如下：序幕，一些著名实验如下：1859年年，法法国国解解剖剖学学家家Vulpain最最早早尝尝试试将将蛙蛙胚胚尾尾部部组组织织切切下下，放放到到普普通通水水内内进进行行“培培养养”，结结果果观观察察到到了了生生长长和和分化现象
9、。分化现象。1885年年，德德国国人人Roux用用温温热热的的生生理理盐盐水水在在体体外外使使鸡鸡胚胚髓髓板板组组织织存存活活了了数数天天，被被认认为为是是体体外外培培养养的的萌萌芽芽实实验验，他他首次提出组织培养这一概念。首次提出组织培养这一概念。1887年年，Arnold将将赤赤杨杨髓髓质质小小片片在在蛙蛙的的体体液液中中浸浸过过，然然后后将将木木片片分分别别种种植植到到蛙蛙的的皮皮下下或或腹腹腔腔内内，木木片片被被白白细细胞胞浸浸润润后后，于于种种植植后后不不同同时时间间将将木木片片取取出出并并置置于于温温盐盐水水中中，观观察到有白细胞从木片迁移到盐水中，且能短期存活。察到有白细胞从木片
10、迁移到盐水中，且能短期存活。 1897年，年，Loeb首次在含有少量血浆凝块的试首次在含有少量血浆凝块的试管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺与卵巢植块，管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺与卵巢植块，发现这些植块在发现这些植块在3d内仍能保持正常的组织学结构。内仍能保持正常的组织学结构。被认为是器官培养的最早尝试。被认为是器官培养的最早尝试。1903年，年，Jolly用悬滴法将蝾螈的白细胞在体用悬滴法将蝾螈的白细胞在体外维持存活了近一个月时间。外维持存活了近一个月时间。1906年，年，Beebe和和Ewing以盖片悬滴培养法用以盖片悬滴培养法用动物血清培养狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了约动物血清培养狗的淋
11、巴肉瘤细胞在体外存活了约72h.（一）体外培养技术的创立（一）体外培养技术的创立1907年，实验胚胎学家年，实验胚胎学家RHarrison在研究神经突起的起在研究神经突起的起源时进行了一项著名的体外培养实验：源时进行了一项著名的体外培养实验：实验对象：蛙胚髓管部的小片组织实验对象：蛙胚髓管部的小片组织营养成分：蛙的淋巴液营养成分：蛙的淋巴液实验方法：盖玻片覆盖凹窝悬滴培养法实验方法：盖玻片覆盖凹窝悬滴培养法实验结果：将实验结果：将蛙胚髓管部的小片组织在体外培养了数周蛙胚髓管部的小片组织在体外培养了数周之久，并之久，并观察到有神经突起从种植的神经组织块长出。观察到有神经突起从种植的神经组织块长出
12、。贡贡献：献：Harrison的工作较为完善地建立了体外培的工作较为完善地建立了体外培养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察了体外养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察了体外培养活体组织的结果。被公认为是体外培养技术的开始，培养活体组织的结果。被公认为是体外培养技术的开始，标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神经突起是由神经突起是由神经细胞长出的这一重大理论的诞生。经细胞长出的这一重大理论的诞生。1910年年，ACarrel在在没没有
13、有抗抗生生素素的的情情况况下下，仅仅靠靠小小心心细细致致的的无无菌菌操操作作，连连续续培培养养鸡鸡胚胚心心脏脏植植块块长长达达数数年年之之久。久。Carrel对体外培养的对体外培养的贡献：贡献：将将无菌操作观念引入体外培养过程中。无菌操作观念引入体外培养过程中。将将培培养养组组织织包包埋埋技技术术、营营养养供供应应以以及及继继续续培培养养(也也称称传传代代或或继继代代培培养养)等等许许多多重重要要的的培培养养条条件件和和方方法法引引入入盖盖玻玻片悬滴培养系统，从而完善了片悬滴培养系统，从而完善了Harrison的方法。的方法。发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。发现鸡胚浸液能明显地促进
14、多种细胞的体外生长。设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。 1910年，美国医生年，美国医生MTBurrows对悬滴培养法对悬滴培养法的改进的改进:用血浆凝块替代蛙淋巴凝块包埋要培养的组织，用血浆凝块替代蛙淋巴凝块包埋要培养的组织，延长了组织在体外存活的时间。延长了组织在体外存活的时间。与与Carrel合作，致力于发展哺乳动物组织的培养，合作，致力于发展哺乳动物组织的培养，证明体外培养细胞的寿命可以因传代而延长。证明体外培养细胞的寿命可以因传代而延长。胚胎浸液与血浆混合使用，培养物可以活的更好。胚胎浸液与血浆混合使用，培养物可以活的更好。通
15、过通过Carrel等学者的工作，使得体外连续营养等学者的工作，使得体外连续营养供应和传代成为可能。供应和传代成为可能。现在一般认为体外培养技术是从现在一般认为体外培养技术是从Harrison和和Carrel真正开始的。真正开始的。 1925年，年，Maximov对悬滴培养法作了改进，创造了对悬滴培养法作了改进，创造了“双双盖玻片法盖玻片法”，可以更好地防止污染，也更适用于神经组，可以更好地防止污染，也更适用于神经组织的培养。织的培养。两位美国科学家和最先试用已知成分的合成培养基取代不两位美国科学家和最先试用已知成分的合成培养基取代不能准确确定其成分的天然培养基，由于他们和其它许多能准确确定其成
16、分的天然培养基，由于他们和其它许多科学家在此后科学家在此后30多年的努力，最终发展出许多合成培养多年的努力，最终发展出许多合成培养基。基。剑桥大学剑桥大学Strangeways实验室的实验室的HonorFell完善了组织和完善了组织和器官，乃至整个胚胎的体外培养方法器官，乃至整个胚胎的体外培养方法(表玻皿器官培养表玻皿器官培养法法)。借此保持它们正常的组织学结构，并防止从外植。借此保持它们正常的组织学结构，并防止从外植物新长出的细胞生长紊乱。物新长出的细胞生长紊乱。Fell及其同事使用此技术培及其同事使用此技术培养骨和关节组织，为我们提供了大量有关这些组织发育养骨和关节组织，为我们提供了大量有
17、关这些组织发育的知识。的知识。（二）体外培养技术的发展（二）体外培养技术的发展u发展主要包括：发展主要包括：探讨体外培养的营养条件探讨体外培养的营养条件 试图建立化学成分明确的人工合成培养基配方以代替试图建立化学成分明确的人工合成培养基配方以代替成分不明确的天然物质。最终导致人工合成培养基的诞生。成分不明确的天然物质。最终导致人工合成培养基的诞生。试图培养不同类别的生物体组织细胞试图培养不同类别的生物体组织细胞 19131913年，年，SteinhardSteinhard以血浆凝块悬滴培养法分离培养痘以血浆凝块悬滴培养法分离培养痘苗病毒，为体外培养技术在病毒学上的应用奠定了基础。苗病毒，为体外
18、培养技术在病毒学上的应用奠定了基础。 19151915年，年，GoldschmidtGoldschmidt最早进行无脊椎动物组织的体外最早进行无脊椎动物组织的体外培养，成功培养了鳞翅目昆虫组织。培养，成功培养了鳞翅目昆虫组织。建立不同的培养技术建立不同的培养技术u发展时期：以发展时期：以20世纪世纪50年代为界分为三个时期年代为界分为三个时期50年代前是培养技术在多个领域广泛发展的时期年代前是培养技术在多个领域广泛发展的时期1933年，年，GOGey创立了旋转管培养法，并以此建立了许创立了旋转管培养法，并以此建立了许多细胞系。如多细胞系。如1951年年Gey等以肿瘤组织为材料成功建立了等以肿瘤
19、组织为材料成功建立了Hela细胞系。细胞系。1948年，年，KKSanford创立了分离细胞培养法，第一次成创立了分离细胞培养法，第一次成功地从单层细胞分离出单个细胞，使得建立遗传性状相同的功地从单层细胞分离出单个细胞，使得建立遗传性状相同的细胞株成为可能。细胞株成为可能。1949年，年，Polge等发现了甘油能够用于保护低温下贮存的等发现了甘油能够用于保护低温下贮存的细胞。细胞。50年代是培养技术迅猛发展时期，多种培养技术相继年代是培养技术迅猛发展时期，多种培养技术相继被建立被建立1950年，年，JFMorgan等提出等提出199配方。配方。1951年，年，JEShannon和和Earle建
20、立建立T瓶（瓶（Earle瓶）培养法。瓶）培养法。CMPomerat改良和设计了结构简单且易于消毒的灌流小室，使改良和设计了结构简单且易于消毒的灌流小室，使得体外培养的细胞能在不断更新的培养液中生长。得体外培养的细胞能在不断更新的培养液中生长。1954年，年，Earle等建立了悬浮培养法。等建立了悬浮培养法。1955年，年，HEagle等建立著名的等建立著名的Eagle培养基配方。培养基配方。1957年，年，Dulbecco等开始采用胰蛋白酶消化处理来分离细胞的方法以及等开始采用胰蛋白酶消化处理来分离细胞的方法以及应用液体培养基的方法，使得体外培养单层细胞成为可能。应用液体培养基的方法，使得体
21、外培养单层细胞成为可能。1959年，年，Lovelock等发现了一种新的化学冷冻保护剂等发现了一种新的化学冷冻保护剂-二甲基亚砜。二甲基亚砜。1960年，年，GBarski等在两种不同类型的细胞混合培养物中，发现不同细胞等在两种不同类型的细胞混合培养物中，发现不同细胞间存在自发融合现象。间存在自发融合现象。50年代后是体外培养技术与生命科学其它技术结合年代后是体外培养技术与生命科学其它技术结合发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术以体外培养技术为基础的应用杂交瘤技术制备单克隆以体外培养技术为基础的应用杂交瘤技术制备单克隆抗体的技术、动物细胞大规模培养技术、
22、微生物制药技术、抗体的技术、动物细胞大规模培养技术、微生物制药技术、基因转染与细胞融合以及细胞转化等细胞工程技术。基因转染与细胞融合以及细胞转化等细胞工程技术。1967年，年，ALVanWezel创立了微载体技术用于体外大创立了微载体技术用于体外大规模培养。规模培养。1972年，年，RAKnazek等创立了中空纤维细胞培养技术，等创立了中空纤维细胞培养技术，模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管毛细血管”中空纤维给体外培养的细胞提供物质代谢条件。标志中空纤维给体外培养的细胞提供物质代谢条件。标志着体外培养技术从过去以二维生长条件跨越到以三维生
23、长着体外培养技术从过去以二维生长条件跨越到以三维生长条件进行体外培养的新阶段。条件进行体外培养的新阶段。 现代组织培养的三个阶段现代组织培养的三个阶段第一阶段第一阶段悬滴培养悬滴培养悬滴培养法具有简便的特点，其次由于培养基中有纤维蛋白构成的支悬滴培养法具有简便的特点，其次由于培养基中有纤维蛋白构成的支架，可供细胞向四面八方生长，培养物是立体的。在此环境中，细胞不仅架，可供细胞向四面八方生长，培养物是立体的。在此环境中，细胞不仅能增殖生长，也能发生分化，如心肌发生搏动等。能增殖生长，也能发生分化，如心肌发生搏动等。缺陷：空间狭小、气体不足、培养液少、难以大量繁殖细胞，观察不方缺陷：空间狭小、气体
24、不足、培养液少、难以大量繁殖细胞，观察不方便等。便等。第二阶段第二阶段单层培养单层培养单层细胞培养和体内细胞比仍然有很大差距单层细胞培养和体内细胞比仍然有很大差距(缺少细胞基质、血液供应、缺少细胞基质、血液供应、调控因子调控因子) 。细胞只有长和宽二维结构，大多细胞会失去原体内时立体的。细胞只有长和宽二维结构，大多细胞会失去原体内时立体的形态，也是细胞生物学性状发生改变的主要原因。细胞在形态、功能上与形态，也是细胞生物学性状发生改变的主要原因。细胞在形态、功能上与体内时不同，多数不能充分表达原基因产物。体内时不同，多数不能充分表达原基因产物。第三阶段第三阶段三维培养三维培养(立体培养立体培养)
25、为培养细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的条件，为培养细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的条件，不仅能促进细胞增殖，也可使细胞发生分化和表达体内时的某些产物。不仅能促进细胞增殖，也可使细胞发生分化和表达体内时的某些产物。u现代组织培养的重要标志：现代组织培养的重要标志：培养液的改变培养液的改变培养容器的改变培养容器的改变培养方法的改进：培养方法的改进：1948年年Sanford创立了单细胞分离培养法创立了单细胞分离培养法1957年蛋白酶消化组织，分离细胞年蛋白酶消化组织，分离细胞液体培养基的应用液体培养基的应用细细胞胞培培养养用用的的多多种种材材料料都都已已商商品品化化
26、、规规范范化化和和系列化。系列化。低低温温冷冷冻冻技技术术的的应应用用，可可将将已已建建立立的的多多种种细细胞胞系系和细胞株长期冻存。和细胞株长期冻存。细细胞胞培培养养技技术术更更加加广广泛泛地地用用于于生生物物学学和和医医学学研研究究(如如分分子子遗遗传传学学、分分子子生生物物学学和和细细胞胞工工程程等等学科均与细胞培养技术密切相关学科均与细胞培养技术密切相关)如：如：应用理化因素诱发出遗传缺陷细胞株。应用理化因素诱发出遗传缺陷细胞株。利用细胞技术，用杂交瘤细胞制备利用细胞技术，用杂交瘤细胞制备McAb用用细细胞胞培培养养检检测测环环境境中中可可疑疑致致癌癌物物，癌癌基基因因转染和细胞转化等
27、。转染和细胞转化等。基基因因工工程程的的生生产产手手段段，用用于于生生产产多多种种生生物物制制品。品。 （三）我国细胞培养技术的发展（三）我国细胞培养技术的发展20世纪世纪30年代细胞培养传入我国，年代细胞培养传入我国，50年代以后组织培养年代以后组织培养在我国逐渐开展起来。在我国逐渐开展起来。李继侗、沈同李继侗、沈同(银杏胚胎的培养银杏胚胎的培养)、罗宗洛和罗士伟、罗宗洛和罗士伟(玉米根玉米根尖生长锥的培养尖生长锥的培养)是植物组织培养的先驱者。是植物组织培养的先驱者。细胞学家张钧、鲍鉴清和杨敷海等则最早将动物组织培养细胞学家张钧、鲍鉴清和杨敷海等则最早将动物组织培养引入我国。引入我国。病毒
28、分离培养：汤飞凡、郭辉玉、顾方舟等病毒分离培养：汤飞凡、郭辉玉、顾方舟等昆虫组织培养：高尚荫、刘年翠等昆虫组织培养：高尚荫、刘年翠等肿瘤培养：曾毅、鄂征、潘琼婧、何申、姚开泰等肿瘤培养：曾毅、鄂征、潘琼婧、何申、姚开泰等神经细胞培养：鲍璇、邵文钊、郭畹华等神经细胞培养：鲍璇、邵文钊、郭畹华等干细胞培养：姚鑫、吴祖泽等干细胞培养：姚鑫、吴祖泽等三、体外培养技术的主要类别三、体外培养技术的主要类别按照体外培养的对象，可分为按照体外培养的对象，可分为全部培养全部培养和部分和部分培养两大类：培养两大类：全部培养：全部培养：指对生物个体进行培养。对象一般是微指对生物个体进行培养。对象一般是微小的生物个体
29、，如微生物、寄生虫等。小的生物个体，如微生物、寄生虫等。部分培养：部分培养：指对生物个体的一部分进行培养的技术。指对生物个体的一部分进行培养的技术。组织培养、器官培养、细胞培养组织培养、器官培养、细胞培养四、体外培养技术的应用四、体外培养技术的应用在组织学与胚胎学上的应用：培养胚胎器官，研究其分在组织学与胚胎学上的应用：培养胚胎器官，研究其分化和发育过程。是研究胚胎发生、发育过程中诱导现象、化和发育过程。是研究胚胎发生、发育过程中诱导现象、发育潜能、胚胎致畸作用、环境诱变等衍生、演化生长行发育潜能、胚胎致畸作用、环境诱变等衍生、演化生长行为及其机制的重要手段。为及其机制的重要手段。在细胞生物学
30、上的应用：广泛由于细胞形态学、细胞生在细胞生物学上的应用：广泛由于细胞形态学、细胞生理、细胞遗传学研究。理、细胞遗传学研究。肿瘤学方面的研究：肿瘤细胞生物学特性研究肿瘤学方面的研究：肿瘤细胞生物学特性研究肿瘤发病机制研究肿瘤发病机制研究异种移植研究异种移植研究在微生物学领域的应用：病毒学、细菌学在微生物学领域的应用：病毒学、细菌学在免疫学方面的应用：抗体的产生、单克隆抗体的制备在免疫学方面的应用：抗体的产生、单克隆抗体的制备在药理学领域的应用：药物筛选、细胞毒性和活性检测在药理学领域的应用：药物筛选、细胞毒性和活性检测动物细胞与微生物大规模培养技术在生产实践上的应用：动物细胞与微生物大规模培养
31、技术在生产实践上的应用：疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素、生长因子、酶制剂等疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素、生长因子、酶制剂等在现代医学领域的应用：以培养细胞移植修复骨和软骨在现代医学领域的应用：以培养细胞移植修复骨和软骨缺损、体外受精产生试管婴儿、转基因动物、干细胞移植、缺损、体外受精产生试管婴儿、转基因动物、干细胞移植、器官移植等。器官移植等。五、对体外培养技术的评价能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学和肿瘤学等。学和肿瘤学等。
32、供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组织或肿瘤组织细胞，而且便于记录织或肿瘤组织细胞，而且便于记录(通过摄影、闭路电视和摄通过摄影、闭路电视和摄电影等方式电影等方式)易施加理化因素和生物因素进行实验研究。如研究某种实易施加理化因素和生物因素进行实验研究。如研究某种实验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加入或删除该成分即可。入或删除该成分即可。可可同同时时方方便便获获得得大大量量细细胞胞类类型型单单一一、细细胞胞周周期期同同步步、生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的
33、细胞群。生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的细胞群。能能够够进进行行大大规规模模生生物物制制品品的的生生产产。利利用用体体外外培培养养技技术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。与与体体内内环环境境相相比比，体体外外培培养养细细胞胞在在一一定定程程度度上上失失去去了了组组织织联联系系及及相相互互作作用用，缺缺乏乏在在体体内内时时的的血血运运和和神神经经体体液液调调节节作作用用，因因此此不不能能将将体体外外实实验验结结果果一一并并推推至至体体内内，即即不不能能轻轻易下结论易下结论。1.Anchorage-dependentcellsorcu
34、ltures(贴贴壁依赖性细胞或培养物壁依赖性细胞或培养物)：体外培养的细胞只：体外培养的细胞只有贴附在不起化学作用的物体的表面时才能生有贴附在不起化学作用的物体的表面时才能生长、生存或维持功能。长、生存或维持功能。2.Apoptosis(细胞凋亡细胞凋亡)：是指细胞内死亡程序的：是指细胞内死亡程序的启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为程启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为程序性细胞死亡序性细胞死亡(programmedcelldeath)。细胞凋。细胞凋亡与机体正亡与机体正常发育、形态形成以及多余细常发育、形态形成以及多余细胞的清除等生理过程密切相关，所以被胞的清除等生理过程密切相关，所
35、以被认为是一种积极的生理性死亡。认为是一种积极的生理性死亡。六、组织培养常用术语六、组织培养常用术语3.Cellculture(细胞培养细胞培养)：细胞在体外条件下的：细胞在体外条件下的生长。生长。4.Cellfusion(细胞融合细胞融合)：体外培养条件下，经：体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同种化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同种的的2个或个或2个以上体细胞融合产生杂交细胞的过程。个以上体细胞融合产生杂交细胞的过程。5.cellgenerationtime(细胞一代时间细胞一代时间)：是指单：是指单个细胞两次连续分裂的时间间隔。可借助显微镜电个细胞两次连续
36、分裂的时间间隔。可借助显微镜电影照相术来精确确定。影照相术来精确确定。6.Primaryculture（原代培养）：是指直接取自（原代培养）：是指直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。生物体细胞、组织或器官开始的培养。7.cellline(细胞系细胞系)：原代培养物经首次传代成：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系功后即成为细胞系。8.Clone(克隆克隆)：单个细胞通过有丝分裂形：单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。成的细胞群体，他们的遗传特性相同。9.Confluence(汇合汇合)：指在细胞培养瓶中培：指在细胞培养瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的
37、养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的区别。区别。10.Contactinhibition(接触抑制接触抑制)：当一个贴壁生长的体外：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞相互接触时，便停止了分裂正常细胞生长至与另一个细胞相互接触时，便停止了分裂增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不再进入再进入S期。期。11.Invitromalignanttransformation(体外恶性转化体外恶性转化)：细胞：细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适当的动物，可以
38、产生肿瘤，即异种动物接种致瘤实验。当的动物，可以产生肿瘤，即异种动物接种致瘤实验。12.Invitrotransformation(体外转化体外转化)：细胞在体外培养过：细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其他特性的可遗程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其他特性的可遗传的变化，但不一定具有致瘤性。传的变化，但不一定具有致瘤性。13.Minimalmedium(最低限度培养基最低限度培养基)：能：能满足大多数细胞生长增殖需要的最简单的满足大多数细胞生长增殖需要的最简单的培养基。培养基。14.Organculture(器官培养器官培养)：是指维持整：是指维持整个器官或器官的一部分
39、在体外生存和生长，个器官或器官的一部分在体外生存和生长，并一定程度上保持原来的结构和功能的方并一定程度上保持原来的结构和功能的方法。法。15.Passage(Subculture，传代或传代培养，传代或传代培养)：将细胞从一个培养瓶转移到更多培养瓶：将细胞从一个培养瓶转移到更多培养瓶的过程。的过程。16.Saturationdensity(饱和密度饱和密度)：在特：在特定条件下，培养容器能达到的最高细胞定条件下，培养容器能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止增殖。在贴壁培养中以每平方厘米的止增殖。在贴壁培养中以每平方厘米的细胞数表示，而悬浮生长的
40、细胞则以每细胞数表示，而悬浮生长的细胞则以每立方厘米的细胞数表示。立方厘米的细胞数表示。17.HeLacell来源于子宫颈癌组织来源于子宫颈癌组织(美国美国黑人妇女黑人妇女HenriettaLacks)的上皮细胞的上皮细胞系，为体外最早建立的人类癌细胞系。系，为体外最早建立的人类癌细胞系。n 1951年，美国非裔烟农年，美国非裔烟农HenriettaLacks因宫颈癌病逝因宫颈癌病逝于巴尔的摩一家医院，当时她只有于巴尔的摩一家医院，当时她只有31岁。在未告知的情岁。在未告知的情况下，科学家以她的子宫颈癌切除组织，成功培育出第况下，科学家以她的子宫颈癌切除组织，成功培育出第1种体外可无限增殖的人
41、类细胞系。很快种体外可无限增殖的人类细胞系。很快“海拉细胞海拉细胞”(HeLacells)细胞就开始从巴尔的摩运往世界各地。细胞就开始从巴尔的摩运往世界各地。62年过去了年过去了-这是拉克斯女士寿命的两倍这是拉克斯女士寿命的两倍-她的细胞承她的细胞承担了超过担了超过74,000项研究课题，其中很多已在细胞生物学、项研究课题，其中很多已在细胞生物学、疫苗、试管婴儿、癌症研究和许多药物等方面结出了硕疫苗、试管婴儿、癌症研究和许多药物等方面结出了硕果，造就了产值庞大的相关产业。果，造就了产值庞大的相关产业。HeLa细胞是科学史上细胞是科学史上最著名且最有价值的人类细胞，不过未来取得最著名且最有价值的
42、人类细胞，不过未来取得“海拉细海拉细胞胞”的难度会提高。的难度会提高。n拉克斯女士身后留下的孩子，现在已有孙辈拉克斯女士身后留下的孩子，现在已有孙辈和曾孙辈，他们中很多人还生活在巴尔的摩或附和曾孙辈，他们中很多人还生活在巴尔的摩或附近地区。设在德国的欧洲分子生物学实验室近地区。设在德国的欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)的科学的科学家今年家今年3月发布了月发布了HeLa细胞系一个支系的全基细胞系一个支系的全基因组序列，可供公开下载。包括会暴露出拉克斯因组序列，可供公开下载。包括会暴露出拉克斯后代的某些特征。这类信息可能会透露疾病倾向，后
43、代的某些特征。这类信息可能会透露疾病倾向，像是酗酒、阿兹海默症或是躁郁症，并可能会使像是酗酒、阿兹海默症或是躁郁症，并可能会使个人遭到保险公司拒保寿险或失能保险。在拉克个人遭到保险公司拒保寿险或失能保险。在拉克斯家属提出抗议后，这些资料已不再斯家属提出抗议后，这些资料已不再“公诸于世公诸于世”。n 另一项由美国国家卫生研究院另一项由美国国家卫生研究院(NIH)资助、华盛顿大资助、华盛顿大学学(UniversityofWashington)进行的研究即将在进行的研究即将在nature上发表。这两项研究都未曾让拉克斯家庭知悉。上发表。这两项研究都未曾让拉克斯家庭知悉。n美国国家卫生研究院的官员现在
44、承认，研究院在最初美国国家卫生研究院的官员现在承认，研究院在最初申请资金对海拉细胞基因组测序时，就应该联系拉克斯申请资金对海拉细胞基因组测序时，就应该联系拉克斯家族。而在拉克斯家族提出反对后，他们也没有及时处家族。而在拉克斯家族提出反对后，他们也没有及时处理该问题。理该问题。n欧洲研究者们撤下此前发布的公共数据，华盛顿大欧洲研究者们撤下此前发布的公共数据，华盛顿大学的论文发表也被叫停。柯林斯以及美国国家卫生研究学的论文发表也被叫停。柯林斯以及美国国家卫生研究院负责科学、普及和政策副主任凯茜院负责科学、普及和政策副主任凯茜L哈德逊哈德逊(KathyL.Hudson)三次前往巴尔的摩与拉克斯的家人
45、见三次前往巴尔的摩与拉克斯的家人见面，并就研究和接下来应该怎么办进行了讨论。面，并就研究和接下来应该怎么办进行了讨论。n这起事件引发拉克斯家族与这起事件引发拉克斯家族与NIH对话，对话，8月月8日日NIH宣布，已和宣布，已和HenriettaLacks的后代达成协议：两项研究的后代达成协议：两项研究所得出的数据应该被储存在该研究院的基因型和表型数所得出的数据应该被储存在该研究院的基因型和表型数据库，想要使用数据的研究者可以进行申请，获得权限，据库，想要使用数据的研究者可以进行申请，获得权限，而且必须每年提交研究报告。而且必须每年提交研究报告。NIH一个被称为一个被称为“海拉基因海拉基因组数据权
46、限获取工作小组组数据权限获取工作小组”的组织会对这些申请进行审的组织会对这些申请进行审查，小组中将有拉克斯的两名家族成员。根据协议，拉查，小组中将有拉克斯的两名家族成员。根据协议，拉克斯家族不会获得海拉基因组研究所产生的任何可能商克斯家族不会获得海拉基因组研究所产生的任何可能商业产品带来的利益。签订上述协议后，华盛顿大学的研业产品带来的利益。签订上述协议后，华盛顿大学的研究人员便可以发表其研究结果了。他们的分析在几个方究人员便可以发表其研究结果了。他们的分析在几个方面超过了欧洲的研究。最重要的是，他们精确地说明了面超过了欧洲的研究。最重要的是，他们精确地说明了海拉细胞海拉细胞DNA中每一个基因
47、的具体位置。中每一个基因的具体位置。 n即研究人员要使用即研究人员要使用HeLa细胞做研究，必细胞做研究，必须向须向NIH申请，并且遵守两名拉克斯家申请，并且遵守两名拉克斯家属参与的小组规范条款，并将研究成果属参与的小组规范条款，并将研究成果贡献到资料库。贡献到资料库。nNIH院长柯林斯院长柯林斯(FrancisCollins)告诉告诉记者：记者：“这是具历史性的新协议。这是具历史性的新协议。”这这项协议将项协议将“保护家属权益，同时也加深保护家属权益，同时也加深他们对生物医学研究的投入他们对生物医学研究的投入”。18.Suspensionculture(悬浮培养悬浮培养)：细胞或细胞聚集体悬
48、：细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方法。浮于液体培养基中增殖的一种培养方法。19.Tissueculture(组织培养组织培养)：组织在体外条件下保存或：组织在体外条件下保存或生长。借此组织结构或功能得以在体外保持，亦可能在生长。借此组织结构或功能得以在体外保持，亦可能在体外维持其分化。体外维持其分化。20.Transfection(转染转染)：用生物学的、物理的或化学的：用生物学的、物理的或化学的方法将目的基因转移到培养细胞内的实验方法。方法将目的基因转移到培养细胞内的实验方法。21.Lipofectin：一种常用的细胞转染试剂，用该试剂包裹：一种常用的细胞转染试剂，用该试剂
49、包裹DNA可形成脂质体可形成脂质体-DNA复合物，再通过细胞膜融合可复合物，再通过细胞膜融合可将将DNA转染入哺乳动物细胞。转染入哺乳动物细胞。22.Cellcycle：指细胞从前一次分裂结束开始：指细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。分至本次分裂结束所经历的时相过程。分4个个时期，即时期，即DNA合成期合成期(S期期)、有丝分裂期、有丝分裂期(M期期)、有丝分裂完成至、有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙合成开始的间隙期期(G1期期)以及以及DNA复制结束至有丝分裂开始复制结束至有丝分裂开始的间隙期的间隙期(G2)。若某种原因细胞不再沿细胞。若某种原因细胞不再沿细胞周期运行
50、，而进入休眠状态称为周期运行，而进入休眠状态称为G0期。期。23.细胞株细胞株(cellstrain)：是由具有某些特性与标：是由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特性志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在随后的培养中必须保持下去。或标志在随后的培养中必须保持下去。 24.Stemcell(干细胞干细胞)：具有继续增殖与分化潜能：具有继续增殖与分化潜能的细胞，其中胚胎干细胞的细胞，其中胚胎干细胞(Embryonicstemcell，ESC)可形成机体所有各种类型的组织和细胞，甚可形成机体所有各种类型的组织和细胞，甚至发育成一个完整的胚胎，故又称全能性至发育成一个
51、完整的胚胎，故又称全能性(totipotency)干细胞。随着细胞分化，这种分化干细胞。随着细胞分化，这种分化潜能逐渐受到局限，只能分化形成有限细胞类型潜能逐渐受到局限，只能分化形成有限细胞类型的细胞称为多能性的细胞称为多能性(multipotency)干细胞，最终干细胞，最终成为单能干细胞成为单能干细胞(Monopotencystemcell)或定向干或定向干细胞细胞(directional). 克隆羊多利克隆羊多利(Dolly)的诞生的诞生1997年年2月月，英英国国Roslin研研究究所所克克隆隆羊羊多多利利(Dolly)的的诞诞生生揭揭示示一一个个全全新新概概念念：由由成成年年机机体体
52、的的一一个个体体细细胞胞核核，可可以以复复制制一一个基因完全相同的新生命个体。个基因完全相同的新生命个体。克克隆隆羊羊的的诞诞生生，预预示示着着动动物物将将成成为为人人类的药物制造厂。类的药物制造厂。 在培育多利的过程中，科学家采用体细胞克隆技术，主要分在培育多利的过程中，科学家采用体细胞克隆技术，主要分四个步骤进行：四个步骤进行：从一只六岁雌性的芬兰多塞特从一只六岁雌性的芬兰多塞特(FinnDorset)白面绵羊白面绵羊(称之称之为为A)的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。逐渐停止分裂，此
53、细胞称之为供体细胞。从一头苏格兰黑面母绵羊从一头苏格兰黑面母绵羊(称之为称之为B)的卵巢中取出未受精的的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞。称之为受体细胞。利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞
54、。胎细胞。将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊(称之为称之为C)的子的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多利。宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多利。 换言之，多利有三个母亲：它的换言之，多利有三个母亲：它的“基因母亲基因母亲”是芬兰多是芬兰多塞特白面母绵羊塞特白面母绵羊(A)；科学家取这头绵羊的乳腺细胞，将其；科学家取这头绵羊的乳腺细胞，将其细胞核移植到第二个细胞核移植到第二个“借卵母亲借卵母亲”一个剔除细胞核的一个剔除细胞核的苏格兰黑脸羊苏格兰黑脸羊(B)的卵子中，使之融合、分裂、发育成胚胎；的卵子中，使之融合、分裂、发育成
55、胚胎；然后移植到第三头羊然后移植到第三头羊(C)“代孕母亲代孕母亲”子宫内发育形成子宫内发育形成多利。多利。从理论上讲，多利继承了提供体细胞的那只绵羊从理论上讲，多利继承了提供体细胞的那只绵羊(A)的的遗传特征，它是一只白脸羊，而不是黑脸羊。分子生物学的遗传特征，它是一只白脸羊，而不是黑脸羊。分子生物学的测定也表明，它与提供细胞核的那头羊，有完全相同的遗传测定也表明，它与提供细胞核的那头羊，有完全相同的遗传物质物质(确切地说，是完全相同的细胞核遗传物质。还有极少确切地说，是完全相同的细胞核遗传物质。还有极少量的遗传物质存在于细胞质的线粒体中，遗传自提供卵母细量的遗传物质存在于细胞质的线粒体中，
56、遗传自提供卵母细胞的受体胞的受体)，它们就像是一对隔了，它们就像是一对隔了6年的双胞胎。年的双胞胎。 多莉的诞生证明高度分化成熟的哺乳动物乳多莉的诞生证明高度分化成熟的哺乳动物乳腺细胞，仍具有腺细胞，仍具有全能性全能性，还能像胚胎细胞一样，还能像胚胎细胞一样完整地保存遗传信息，这些遗传信息在母体发完整地保存遗传信息，这些遗传信息在母体发育过程中并没有发生不可回复的改变，还能完育过程中并没有发生不可回复的改变，还能完全恢复到早期胚胎细胞状态。最终仍能发育成全恢复到早期胚胎细胞状态。最终仍能发育成与核供体成体完全相同的个体。以往的遗传学与核供体成体完全相同的个体。以往的遗传学认为，哺乳动物体细胞的
57、功能是高度分化了的，认为，哺乳动物体细胞的功能是高度分化了的，不可能重新发育成新个体。与这一理论相反，不可能重新发育成新个体。与这一理论相反，多莉的诞生推翻了形成了上百年的上述理论，多莉的诞生推翻了形成了上百年的上述理论，实现了遗传学的重大突破，为开发新的哺乳动实现了遗传学的重大突破，为开发新的哺乳动物基因操作提供了动力。物基因操作提供了动力。七七. .体外体外(细胞细胞)培养的基本要求和注意事培养的基本要求和注意事项项基本要求：基本要求：掌握细胞培养技术掌握细胞培养技术能判定细胞生长情况能判定细胞生长情况(好坏好坏)、是否发生污染、是否发生污染熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞生物学性状熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞生物学性状注意事项：注意事项：防止微生物污染和细胞污染防止微生物污染和细胞污染液体配制注意浓度精确，标记日期，一定时间液体配制注意浓度精确，标记日期，一定时间内相对稳定。内相对稳定。
