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1、PCR技术(环境微生物)概述原理流程操作方法应用 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。对目的基因进行分析、鉴定。 PCRPCR能将微量的能将微量的DNADNA大幅增加，因此，无论是化大幅增加，因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶石中的古
2、生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的离出一丁点的DNADNA，就能用，就能用PCRPCR加以放大，进行比对。加以放大，进行比对。PCRPCR技术的原理技术的原理 遗传物质：遗传物质：细胞核细胞核 染色体染色体 DNADNA（脱氧核糖核酸和（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成磷酸链和碱基构成) )碱基（碱基（A A、T T、C C、G G）是按）是按双链螺旋排列的，碱基双链螺旋排列的，碱基序列的序列的 长度和排列的长度和排列的顺序决定了生物的多样顺序决定了生物的多样性。性。比如人类体细胞中共有比如人类
3、体细胞中共有3131亿个碱基对，按上述的亿个碱基对，按上述的0.1%0.1%的差，人和人之间的差，人和人之间有有3 3百万个碱基对的差百万个碱基对的差别。别。 PCR PCR的原理的原理2 2： 用于扩增位于两段已知序列之间的用于扩增位于两段已知序列之间的DNADNA片段，类片段，类似于天然似于天然DNADNA的复制过程。的复制过程。 以拟扩增的以拟扩增的DNADNA分子为模板，以一对分别与模板分子为模板，以一对分别与模板55末端和末端和33末端互补的寡核苷酸末端互补的寡核苷酸片段（只有片段（只有2020个个以下碱基的核苷酸的总称）以下碱基的核苷酸的总称）为引物，在为引物，在DNADNA聚合酶
4、聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的直至完成新的DNADNA合成，重复这一过程，即可使目合成，重复这一过程，即可使目的的DNADNA片段得到扩增。片段得到扩增。PCR的原理3 PCRPCR是一种体外是一种体外DNA DNA 扩增技术，是在模板扩增技术，是在模板DNADNA、引物和种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于引物和种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNADNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNADNA片段与其两片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性高温变性低温低温退
5、火退火引物延伸引物延伸”三步反应的多次循环，使三步反应的多次循环，使DNADNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。我们所需的大量的特定基因片段。 扩增的特异性取决于引物与模板扩增的特异性取决于引物与模板DNADNA的特异结合，基本反的特异结合，基本反应步骤分三步：应步骤分三步：1. 1. 变性变性 (Denaturation) (Denaturation)： 加热使模板加热使模板DNADNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。双链间的氢键断裂而形成两条单链。94 3094 302. 2. 退火退火 ( (复性复性) (
6、Annealling):) (Annealling): 突然降温后模板突然降温后模板DNADNA与引物按碱基配对原则互补结与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 30 55 30 3. 3. 延伸延伸 (Extension): (Extension): 将反应温度调节到酶的最适温度，在将反应温度调节到酶的最适温度，在DNADNA聚合酶、聚合酶、4 4种种 dNTPs dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以
7、引物的及镁离子等存在的条件下，以引物的 3 3 端开始，结端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNADNA链。链。72 72 上述上述 3 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNADNA量量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过过25254040个循环后个循环后DNADNA可扩增可扩增10106 6 10 109 9 倍。倍。 PCRPCR的三个反应步骤反复进行，使的三个反应步骤反复进行，使DNADNA扩增量呈指数上扩增量呈指数上升。反应最终的
8、升。反应最终的DNA DNA 扩增量可用扩增量可用Y Y(1(1X)nX)n计算。计算。Y Y代表代表DNADNA片段扩增后的拷贝数，片段扩增后的拷贝数，X X表示平表示平(Y)(Y)均每次的扩增效率，均每次的扩增效率，n n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%100%，但在实，但在实际反应中平均效率达不到理论值。际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列反应初期，靶序列DNADNA片段的增加呈指数形式，随着片段的增加呈指数形式，随着PCRPCR产物的逐渐积累，被扩增的产物的逐渐积累，被扩增的DNA DNA 片段不再呈指数增加，片段不再呈指数增
9、加，而进入线性增长期或静止期，而进入线性增长期或静止期， 即出现即出现“停滞效应停滞效应” ” ，这种效应称平台期数、这种效应称平台期数、PCR PCR 扩增效率及扩增效率及DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR的的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。数情况下，平台期的到来是不可避免的。双链双链DNA分子分子双链断开双链断开 循环循环1模板与引物结合模板与引物结合循环循环1TaqTaq循环循环1TaqTaq循环循环1循环循环1双链断开双链断开循环循环2模板与引物结合模板与引物结合循环循环2TaqTaqTaqTaq
10、循环循环29494变性变性双链断开双链断开循环循环3循环循环3TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq循环循环3循环循环n PCR PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的决定的。反应初期，原来的DNADNA担负起使模板的作担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物介于两种引物5 5 端之间的端之间的DNADNA片段。片段。标准的标准的PCRPCR反应体系：反应体系： 1010
11、扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 10ul 4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L 200umol/L 引物引物 各各1010100pmol100pmol 模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ug Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u 2.5u Mg Mg2+2+ 1.5mmol/L 1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul 100ul 三、三、PCRPCR的成分和作用：的成分和作用： 1. 1. 缓冲液：缓冲液： 10 10 50 mM Tris- Cl 50 mM Tris- Cl （三氨基甲烷）（三氨基甲烷）(pH8.4)(
12、pH8.4) 维持维持 Taq Taq 酶作用环境的偏碱性酶作用环境的偏碱性 25 25 50 mM KCl 50 mM KCl 促进引物退火，促进引物退火，50 mM 50 mM 会抑制会抑制 Taq Taq 酶的活性。酶的活性。 100g / ml 100g / ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 (BSA) (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的用，建议使用乙酰化的 BSA BSA。明胶、。明胶、Tween-20Tween-20、 二硫二硫苏糖醇苏糖醇 (DTT) (DTT) 也有类似作用。也有类似作用。 2.
13、MgCl 2. MgCl2 2: : 1.5 1.5 2.0 mM 2.0 mM Taq Taq 酶具有酶具有 Mg Mg2+2+依赖性，显著影响反应的特异性和依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。则酶活性显著下降。 3. dNTPs : 3. dNTPs : dATP dATP、 dGTP dGTP 、dCTPdCTP、dTTPdTTP底物底物 0.02 0.02 0.2 mM 0.2 mM dNTPs dNTPs 可与可与 Mg Mg2+ 2+ 结合，应注意结合，应注意MgMg
14、2+ 2+ 浓度与浓度与dNTPs dNTPs 浓度之间的关系，浓度之间的关系， Mg Mg2+ 2+ 浓度比浓度比 dNTPs dNTPs 浓度高浓度高 0.2 0.2 2.5 mM2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。 4. 4. 引物引物 (Primer-P) (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.2 0.2 1 M 1 M 偏高：非特异产物
15、扩增及错配，增加引物之间偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。偏低：产量降低。 5. Taq DNA 5. Taq DNA 聚合酶：耐高热聚合酶：耐高热 0.5 0.5 5 U / 100 l 5 U / 100 l 1U / 25 1U / 25 50l 50l 偏高：引物非特异产物的扩增偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低偏低：产物量降低6. 6. 模板模板DNA (Template):DNA (Template): 最低最低10102 2 10 105 5 bp DNAbp DNA片段，实际用量远远片段，实
16、际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。超过此量，用量需在实验中摸索。1 1 5 l 5 l 过高：非特异产物增加过高：非特异产物增加 过低：产量降低过低：产量降低7. 7. 水：水： 去离子水，补足整个反应体积。去离子水，补足整个反应体积。PCRPCR实验实验实验材料实验材料 1 1模板：细菌模板：细菌DNA DNA 2 T 2 Ta agDNAgDNA聚合酶聚合酶 3dNTP3dNTP混合液混合液 410410倍浓度倍浓度PCRPCR缓冲液缓冲液 52.5mmol/LMgCl2 52.5mmol/LMgCl2 6RAPD6RAPD引引物物：S14 S14 S15 S15 S18 S18
17、S66 S66 S74 S74 S88 S88 S97 S97 S103 S103 S110 S115 S110 S115 77提取细菌提取细菌DNADNA的相关试剂的相关试剂 操作步骤 1细菌染色体DNA的提取2RAPD反应体系的配置33反应程序：反应程序： 将将RAPDRAPD反应试剂加入反应试剂加入EPEP管中管中 轻混后用轻混后用100ul100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热防止样品在反复加热- -冷却的过程中蒸发，盖好盖冷却的过程中蒸发，盖好盖子子打开打开PCRPCR反应仪输入以下反应数据反应仪输入以下反应数据94 94 摄氏度预变性摄
18、氏度预变性5min5min9494摄氏度变性摄氏度变性40s40s4040摄氏度退火摄氏度退火40s40s7272摄氏度延伸摄氏度延伸1min1min将将EPEP管放入仪器开始扩增，循环管放入仪器开始扩增，循环3535次；次；7272摄氏度延伸摄氏度延伸10min 10min 仪器为仪器为Model MyGene 25 Plus Model MyGene 25 Plus PCRPCR扩增产物的分析扩增产物的分析 1 1、凝胶电泳分析法：、凝胶电泳分析法： 聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳， 用于探讨用于探讨PCRPCR扩增的灵敏度效果好，但配制
19、复杂，扩增的灵敏度效果好，但配制复杂， 常用琼脂糖凝胶电泳。常用琼脂糖凝胶电泳。 2 2、点杂交、点杂交 3 3、微孔板杂交法、微孔板杂交法PCRPCR技术的局限性技术的局限性为了构建特定引物，使特定为了构建特定引物，使特定DNADNA序列的选择性扩增，序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。必须有一个庞大的已知序列的数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。优化反应条件。PCRPCR技术扩增产物的长度有限。技术扩增产物的长度有限。 PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途 1 1、目的基因的克隆：、目的基因的克
20、隆： PCRPCR技术为在重组技术为在重组DNADNA过程中获得目的基过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。因片段提供了简便快速的方法。 2 2、基因的体外突变：、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。进行嵌和、缺失、点突变等改造。 3 3、DNADNA和和RNARNA的微量分析：的微量分析：PCRPCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是DNADNA和和NANA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或
21、一个细胞已足以满足细胞已足以满足PCRPCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。阔的应用前景。4 4、DNADNA序列测定：序列测定：PCRPCR技术的引入使技术的引入使DNADNA测序工作大大简化，也提高了测序的速度。测序工作大大简化，也提高了测序的速度。5 5、基因突变分析：、基因突变分析： 利用利用PCRPCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。DNA指纹技术 119841984年英国的遗传学家年英国的遗传学家Alec JeffreysAlec Jeffreys在在进行肌
22、红蛋白的进行肌红蛋白的DNADNA序列研究时，意外发序列研究时，意外发现非功能现非功能DNADNA（不产生蛋白的（不产生蛋白的DNADNA）上重）上重复着一种小片段复着一种小片段DNADNA，这一含，这一含1515个左右碱个左右碱基的基的DNADNA片段，在不同个体间重复的频率片段，在不同个体间重复的频率及位置有明显的不同，及位置有明显的不同，JeffreysJeffreys首先在首先在自己的自己的DNADNA上进行研究，验证了这一技术，上进行研究，验证了这一技术，如果我们有血缘关系，这些不同会大大如果我们有血缘关系，这些不同会大大缩小。缩小。 DNA指纹技术 2采集血样（毛发、精采集血样（毛
23、发、精液、口腔粘膜细胞），液、口腔粘膜细胞），分离分离DNADNA，用，用PCRPCR将选将选定的定的DNADNA片段放大，并片段放大，并进行对比，统计分析，进行对比，统计分析，便可得出是否为作案便可得出是否为作案凶手或是否有血缘关凶手或是否有血缘关系。系。PCRPCR在环境监测中的应用在环境监测中的应用 不不同同的的微微生生物物病病原原体体具具有有不不同同的的致致病病剂剂量量，因因此此确确定定水水样样中中病病原原体体的的数数量量和和种种类类提提高高检检测测的的准准确确度度显显得得异异常常重重要要 水水体体污污染染问问题题已已引引起起了了人人们们的的极极大大关关注注, ,确确定定自自然然水水体
24、体或或污污水水水水样样中中受受病病原原体体或或化化学学类类污污染染物物污污染染的的程程度度和和快快速速 确确定定污污染染源源是是一一个个难难点点问问题题。饮饮用用水水样样品品中中只只有有不不到到1 1% %的的微微生生物物可可经经实实验验室室培培养养。因因此此, ,用用传传统统培培养养方方法法研研究究微微生生 物物群群落落, ,不不能能反反映映环环境境的的真真实实情情况况。而而P PC CR R技技术术灵灵敏敏, ,便便捷捷又又具具有有特特异异性性, ,可可以以针针对对某某种种或或某某几几种种致致病病微微生生物物作作出出检检测测判判断断, ,因因此此在在水水环环境境微微生生物物检检测测中中应应
25、用用越越来来越越广广泛泛, ,表表现现PCRPCR技术在环境监测中的应用技术在环境监测中的应用 DNADNA损伤评价污染物遗传毒性的一个很有价值的生物指损伤评价污染物遗传毒性的一个很有价值的生物指 标标,PCR,PCR技术的应用使得在分子水平分析技术的应用使得在分子水平分析DNADNA损伤之一损伤之一D NAD NA突变有了很大的进展突变有了很大的进展 , , 提供提供了了一种在分子水平上分析一种在分子水平上分析 环环境生物境生物DNADNA损伤和检测病原体的简便方法损伤和检测病原体的简便方法 , , 该方法克服该方法克服 了传统方法的缺陷了传统方法的缺陷, ,更利于提高环境检测的效率和准确性
26、更利于提高环境检测的效率和准确性。PCRPCR技术在环境监测中的应用技术在环境监测中的应用 PCR PCR有许多不同种类，如实时定量有许多不同种类，如实时定量PCRPCR，多重，多重PCRPCR等，用等，用PCRPCR得到的母的片段可用于微生物检测。目前已有将得到的母的片段可用于微生物检测。目前已有将PCR PCR 技术用于饮用水中大肠杆菌的检测；用于制备基因工程中技术用于饮用水中大肠杆菌的检测；用于制备基因工程中的目的片段；用于的目的片段；用于DNADNA杂交技术中杂交技术中DNADNA探针的制备；用于环探针的制备；用于环境生物多态性的分析。境生物多态性的分析。 DNA DNA探针是用生物素
27、、荧光素等物质进行标记的能够与待探针是用生物素、荧光素等物质进行标记的能够与待测基因进行特异性互补产生杂交信号的测基因进行特异性互补产生杂交信号的DNADNA片段。荧光探片段。荧光探针、寡聚核苷酸探针等已被应用于监测水中的大肠杆菌，针、寡聚核苷酸探针等已被应用于监测水中的大肠杆菌，取得了很好的结果。为了更灵敏、快速的检测水中大肠杆取得了很好的结果。为了更灵敏、快速的检测水中大肠杆菌，目前菌，目前DNADNA探针技术多于探针技术多于PCRPCR技术结合使用。技术结合使用。 PCRPCR技术在环境检测尤其是水环境监测中所发挥的作用技术在环境检测尤其是水环境监测中所发挥的作用日益提高，随着各个层面监
28、测的开展，其技术亦日益复杂。日益提高，随着各个层面监测的开展，其技术亦日益复杂。 虽然虽然PCRPCR技术相对于传统的检测方法有很多优点，但仍存技术相对于传统的检测方法有很多优点，但仍存在着有待改进的不足：比如假阳性，当不相关的核酸分子在着有待改进的不足：比如假阳性，当不相关的核酸分子中存在与模板非常相似的碱基序列时，中存在与模板非常相似的碱基序列时，PCRPCR很可能扩出假很可能扩出假阳性的结果，所以引物的设计与阳性的结果，所以引物的设计与PCRPCR条件的设定成为了目条件的设定成为了目前应该研究的关键；前应该研究的关键； 由于由于PCRPCR的高灵敏度与实验试剂的计量很小，所以对操的高灵敏
29、度与实验试剂的计量很小，所以对操作者的技术要求较高，因为微量靶序列的污染往往对结果作者的技术要求较高，因为微量靶序列的污染往往对结果造成很大的影响，故操作过程要十分小心。造成很大的影响，故操作过程要十分小心。 随着此技术的不断发展，随着此技术的不断发展，PCRPCR技术将作为一个必不可少的技术将作为一个必不可少的方法与其他监测技术结合起来，在水环境监测的生物层面方法与其他监测技术结合起来，在水环境监测的生物层面获得广泛应用。获得广泛应用。可以预料今后可以预料今后PCRPCR技术在环境微生物领域中的应用将会进技术在环境微生物领域中的应用将会进一步的扩大，在监测水体土壤中的致病细菌、病毒及指示一步的扩大，在监测水体土壤中的致病细菌、病毒及指示菌等方面发挥越来越大的作用。菌等方面发挥越来越大的作用。Thank you for listening YourName
