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1、第一章蛋白质的结构与功能（二）第一章蛋白质的结构与功能（二）TheStructureandFunctionofProtein2 2主要内容主要内容v蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成 （氨基酸的特性）（氨基酸的特性）v蛋白质的蛋白质的分子结构分子结构 （蛋白质的各级结构概念，化（蛋白质的各级结构概念，化学键）学键）v蛋白质分子蛋白质分子结构与功能结构与功能的关系（举例说明）的关系（举例说明） v蛋白质的理化性质及其分离纯化（应用）蛋白质的理化性质及其分离纯化（应用） 第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构3 34 4一级结构一级结构(primarystructure)二级结构二级结构(s
2、econdarystructure)三级结构三级结构(tertiarystructure)四级结构四级结构(quaternarystructure)空间构象空间构象5 5一、蛋白质分子的一级结构一、蛋白质分子的一级结构牛胰岛素一级结构：牛胰岛素一级结构：A链（链（21aa)、B链（链（30aa)H2N-甘甘-异异-缬缬-谷谷-谷胺谷胺-半半-半半-丙丙-丝丝-缬缬-半半-丝丝-亮亮-酪酪-谷胺谷胺-亮亮-谷谷-天胺天胺-酪酪-半半-天胺天胺-COOHH2N-苯苯-缬缬-天胺天胺-谷胺谷胺-丝丝-亮亮-半半- 甘甘 - 丝丝 - 组组 - 亮亮 - 缬缬 - 谷谷 -丙丙 -亮亮-酪酪-亮亮-缬
3、缬-半半-甘甘-谷谷 -精精-甘甘-苯苯-苯苯-酪酪-苏苏-脯脯-赖赖-丙丙-COOHSSABSSSS一级结构是蛋白质空间结构的基础，对生物功能起决定作用。一级结构是蛋白质空间结构的基础，对生物功能起决定作用。蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，主要键为蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，主要键为肽键肽键，有些含有些含二硫键二硫键6 6二、蛋白质二级结构二、蛋白质二级结构(secondarystructure)血清铁蛋白血清铁蛋白蚕丝蛋白蚕丝蛋白7 7蛋白质的二级结构是指蛋白质的二级结构是指多肽链骨架多肽链骨架中原子的中原子的局部空间局部空间排列，排列，不涉及侧链不涉及侧链的构象，也就是该肽段主链骨架原的
4、构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有子的相对空间位置，主要有-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角转角和无规则卷曲和无规则卷曲。肽链主链的骨架原子即肽链主链的骨架原子即N（氨基氮）、（氨基氮）、C （ -碳原子）碳原子）和和C0（羧基碳）原子依次重复排列。（羧基碳）原子依次重复排列。8 8（一）肽平面（一）肽平面肽键部分双键性，不能自由旋转肽键部分双键性，不能自由旋转肽键中的四个原子（肽键中的四个原子（-CO-NH-）和与之相邻的两个）和与之相邻的两个碳原子碳原子（C 1、C 2）位于同一刚性平面内，称为肽单元（）位于同一刚性平面内，称为肽单元（peptideunit）肽键肽键0.
5、1329 9C 1、C 2位于肽键的两边，称反式肽单元（位于肽键的两边，称反式肽单元（trans-peptideunit），该构型更稳定），该构型更稳定1010C-C单键旋转的角度用单键旋转的角度用（psi）表示；）表示；C-N单键旋转的角度单键旋转的角度用用( ,phi)表示。这两个角旋转的角度决定两个相邻肽基的空表示。这两个角旋转的角度决定两个相邻肽基的空间位置。间位置。(二二) -螺旋螺旋(-helix)1111蛋白质二级结构的主要形式之一蛋白质二级结构的主要形式之一1.右手螺旋螺旋，走向为顺时钟方向。右手螺旋螺旋，走向为顺时钟方向。2.氨基酸侧链伸向外侧。氨基酸侧链伸向外侧。3.每每3
6、.6个个aa上升一圈，螺距上升一圈，螺距0.54nm。4.N-H和第四个肽键的羰基氧形成和第四个肽键的羰基氧形成氢氢键键。氢键方向与螺旋长轴平行。氢键方向与螺旋长轴平行。5.有些有些 -螺旋螺旋具有两性（疏水性和亲具有两性（疏水性和亲水性）水性）1212 -螺旋螺旋具有两性（疏水性和亲水性）具有两性（疏水性和亲水性）载脂蛋白载脂蛋白1313螺旋分布广泛：螺旋分布广泛：0-100%血清铁蛋白，角蛋白，跨膜蛋白血清铁蛋白，角蛋白，跨膜蛋白血清铁蛋白血清铁蛋白跨膜蛋白跨膜蛋白R基团影响螺旋的稳基团影响螺旋的稳定性：酸性、碱性、定性：酸性、碱性、较大基团（苯丙氨酸、较大基团（苯丙氨酸、色氨酸）、脯氨酸
7、、色氨酸）、脯氨酸、甘氨酸（甘氨酸（H）（三）（三）-折叠折叠(-pleatedsheet)14141.锯齿状，锯齿状，C为转点为转点3.两条或者更多的两条或者更多的折叠链间通过折叠链间通过氢键氢键相连相连4.不同链方向可以一致，可以相反不同链方向可以一致，可以相反2.R基团位于锯齿结构上下方基团位于锯齿结构上下方1515蚕丝蛋白蚕丝蛋白卵磷脂结合蛋白卵磷脂结合蛋白（四）（四） -转角转角( turn)和无规则卷曲（和无规则卷曲（randomcoil）2.一般由四个氨基酸组成，一般由四个氨基酸组成，第二个残基常为脯氨酸、甘第二个残基常为脯氨酸、甘氨酸氨酸3.以主链间以主链间氢键氢键维持稳定维持
8、稳定（第一个残基的羟基氧和第（第一个残基的羟基氧和第四个残基的氨基氢）四个残基的氨基氢）1.多肽链中多肽链中180度回折处度回折处形成的特定构象形成的特定构象1616 -转角转角没有确定规律性的肽链结构没有确定规律性的肽链结构无规卷曲无规卷曲(randomcoil)1717 -转角是转角是螺旋之间、螺旋之间、折折叠之间或者螺旋与折叠的叠之间或者螺旋与折叠的连接连接1818四种二级结构可存在同一个蛋白质中四种二级结构可存在同一个蛋白质中（五）（五）模体模体(motif)1919在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形
9、成一个特殊的空间构象，称为相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体模体。有的将这种。有的将这种规则的二级结构的聚集体称为超二级结构，是蛋白质发挥特定规则的二级结构的聚集体称为超二级结构，是蛋白质发挥特定功能的基础。功能的基础。2020-钙结合钙结合锌指锌指Motif属于二级结构，有属于二级结构，有特殊结构，有特定的功能特殊结构，有特定的功能蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布，包括主链和侧链。原子的整体空间排布，包括主链和侧链。2121三、三级结构三、三级结构(tertiarystructure)（一）所有氨基酸残基参与三级结构（一）
10、所有氨基酸残基参与三级结构2222维持三级结构的化学力量维持三级结构的化学力量1.氢键氢键2.离子键离子键3.疏水键疏水键4.范德华力范德华力5.二硫键二硫键疏水作用疏水作用：疏水性基团避开水藏于：疏水性基团避开水藏于分子内部的力量分子内部的力量（二）结构域（二）结构域（domain）结构域结构域（domain）是在较大的蛋白质分子中所）是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。共价键相连，并承担特定的生物学功
11、能。23232424三磷酸甘油醛脱氢酶三磷酸甘油醛脱氢酶两个亚基两个亚基每个亚基包含两个结每个亚基包含两个结构域：与构域：与NAD+结合；结合；与底物结合与底物结合NAD+底物2525丙酮酸激酶丙酮酸激酶Motif二级结构二级结构Domain三级结构三级结构模体和结构域模体和结构域2626三级结构的特点：三级结构的特点：1、进一步盘曲、折叠的多肽链分子长度大大缩短，、进一步盘曲、折叠的多肽链分子长度大大缩短，呈棒呈棒状、纤维状或球状；状、纤维状或球状；2、三级结构的稳定性主要靠次级键维持，尤其是疏水键三级结构的稳定性主要靠次级键维持，尤其是疏水键；3、疏水基团多位于分子内部，亲水基团多位于分子
12、表面；、疏水基团多位于分子内部，亲水基团多位于分子表面；4、分子表面或某些部位形成了发挥生物学功能的特定区域、分子表面或某些部位形成了发挥生物学功能的特定区域只有一条肽链组成的蛋白质，三级结构是其只有一条肽链组成的蛋白质，三级结构是其最高的结构形式最高的结构形式四、四级结构（四、四级结构（quaternarystructure）2727二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链，彼二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链，彼此借此借非共价键非共价键相连，成为一定的空间结构，称为四相连，成为一定的空间结构，称为四级结构。级结构。具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚基或亚单位，具有独立三级结构的多肽
13、链单位，称为亚基或亚单位，亚基可以相同，亦可以不同。各亚基之间结合力主要是亚基可以相同，亦可以不同。各亚基之间结合力主要是氢键、离子键氢键、离子键2828血红蛋白（血红蛋白（Hb）两个两个链与两个链与两个链组成的四链组成的四聚体聚体链：链：141aa；链：链：146aa每条链每条链各含一个血红素辅基各含一个血红素辅基Heme血红蛋白亚基间连接：离子键血红蛋白亚基间连接：离子键29293030小结小结一级结构一级结构蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，主要键为蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，主要键为肽键肽键，有些，有些含含二硫键二硫键二级结构二级结构多肽链骨架中原子的局部空间排列，不涉及侧链的构象。多肽
14、链骨架中原子的局部空间排列，不涉及侧链的构象。-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角和无规则卷曲。氢键转角和无规则卷曲。氢键是二级结构维持力是二级结构维持力量量三级结构三级结构蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布。空间排布。疏水键疏水键、氢键、离子键、范德华力是三级结构维持、氢键、离子键、范德华力是三级结构维持力量力量四级结构四级结构二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链。二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链。离子键、离子键、氢键氢键是四级结构维持力量是四级结构维持力量3131结构特点结构特点 -螺旋螺旋(-helix)、-
15、折叠折叠(-pleatedsheet)1.右手螺旋螺旋，走向为顺时钟方向。右手螺旋螺旋，走向为顺时钟方向。2.氨基酸侧链伸向外侧。氨基酸侧链伸向外侧。3.每每3.6个个aa上升一圈，螺距上升一圈，螺距0.54nm。4.N-H和第四个肽键的羰基氧形成和第四个肽键的羰基氧形成氢键氢键。氢键方向与螺旋长轴平行。氢键方向与螺旋长轴平行。5.有些有些 -螺旋螺旋具有两性（疏水性和亲水性）具有两性（疏水性和亲水性）1.锯齿状，锯齿状，C为转点为转点2.R基团位于锯齿结构上下方基团位于锯齿结构上下方3.两条或者更多的两条或者更多的折叠链间通折叠链间通过过氢键氢键相连相连4.不同链方向可以一致，可以不同链方向
16、可以一致，可以相反相反3232概念概念肽键中的四个原子（肽键中的四个原子（-CO-NH-）和与之相邻的两个）和与之相邻的两个碳原子（碳原子（C 1、C 2）位于同一刚性平面内）位于同一刚性平面内1.肽单元（肽单元（peptideunit）在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，是蛋白质发挥特定功能的基础。形成一个特殊的空间构象，是蛋白质发挥特定功能的基础。2.模体（模体（motif）3.结构域（结构域（domain）在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部在较大
17、的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，并承担特定的生物学功能区域。结构域具有独特的空间构象，并承担特定的生物学功能第三节第三节蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系33333434蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。间结构是生物活性的直接体现。一、一级结构与功能的关系一、一级结构与功能的关系3535(一一)一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础核糖核酸酶核糖核酸酶尿素、尿素、
18、-巯基乙醇巯基乙醇去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇天然状天然状态，有态，有催化活催化活性性非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性3636(二二)一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能与功能一级结构是生物功能的基础：一级结构不同，功一级结构是生物功能的基础：一级结构不同，功能不同；一级结构相似，功能相似能不同；一级结构相似，功能相似催产素（催产素（oxytocin）加压素（加压素（vasopressin）C-Y-F-Q-N-C-P-R-G-NH2S SC-Y-I-Q-N-C-P-L-G-NH2S S举例1异亮氨酸异亮氨酸亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸
19、精氨酸精氨酸3737催产素催产素收缩子宫平滑肌，具有催产功能收缩子宫平滑肌，具有催产功能加压素加压素主要收缩血管平滑肌，同时具有升压和抗利尿作用主要收缩血管平滑肌，同时具有升压和抗利尿作用有部分相同或类似的功能。有部分相同或类似的功能。加压素也具有一定收缩子宫平滑肌的功能加压素也具有一定收缩子宫平滑肌的功能3838某些脊椎动物胰岛素一级结构部分氨基酸残基差异某些脊椎动物胰岛素一级结构部分氨基酸残基差异 举例举例2 2 一级结构相似，功能相似一级结构相似，功能相似A3939( (三三) )氨基酸序列提供进化信息氨基酸序列提供进化信息4040正常红细胞正常红细胞镰形红细胞镰形红细胞4141(四四)
20、氨基酸序列改变可引起疾病氨基酸序列改变可引起疾病镰刀形红细胞贫血病（镰刀形红细胞贫血病（sicklecellanemia）4242N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbSHbAN-val his leu thr pro val glu C(146) 1 2 1 2 1 2 2 1HemoglobinAHemoglobinS4343缬氨酸缬氨酸4444分子病（分子病（moleculardisease）：由于由于DNA分子突变，分子突变，使蛋白质分子发生变异所导致的疾病。使蛋白质分子发生变异所导致的疾病。（一）血红蛋白与肌红蛋白结构相似（一）血红蛋白与肌红蛋
21、白结构相似 空间结构体现生物活性：结构相似，功能相似空间结构体现生物活性：结构相似，功能相似4545二、蛋白质功能依赖特定空间结构二、蛋白质功能依赖特定空间结构MyoglobinHemoglobin4646亚基结合血红素亚基结合血红素血红素血红素4个亚基间有个亚基间有8对盐键对盐键血红素的血红素的Fe结合结合O2,;Fe与与组蛋白配位结合组蛋白配位结合 1 2 1 2肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线Hb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合， Hb与与O2结结合合后后称称为为氧氧合合Hb。氧氧合合Hb占占总总Hb的的百百分分数数（称称百百分
22、分饱饱和和度度）随随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。4747（二）血红蛋白亚基构象变化影响其与氧结合（二）血红蛋白亚基构象变化影响其与氧结合4848deoxyhemoglobin(T)oxyhemoglobin(R)Hb与与O2结合存在构象变化结合存在构象变化TensestateRelaxedstateO2与血红素与血红素Fe结合，引起结合，引起Fe进入血红素平面，拉动组氨酸残基，进入血红素平面，拉动组氨酸残基，从而拉动从而拉动helix，最终改变分子构象，最终改变分子构象49495050T stateR state组氨酸组氨酸 1 subunit赖氨酸赖氨酸 2 subunit别构效应别
23、构效应(allostericeffect)一个一个O2与与Hb亚基结合引起亚基结合引起Hb分子构象变化分子构象变化寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应(cooperativity)。别构效应别构效应（变位效应，（变位效应，allostericeffect）：蛋白质分子的特定部）：蛋白质分子的特定部位与小分子化合物结合后，引起空间构象改变，从而促使生物位与小分子化合物结合后，引起空间构象改变，从而促使生物学活性变化的现象。学活性变化的现象
24、。5151正协同效应正协同效应(positivecooperativity)：促进作用：促进作用负协同效应负协同效应(negativecooperativity)：抑制作用：抑制作用5252（三）蛋白质构象改变引起的疾病（三）蛋白质构象改变引起的疾病阿尔茨海默病阿尔茨海默病(Alzheimersdisease)疯牛病疯牛病(Madcowdisease,orbovinespongiformencephalopathyorBSE)亨汀顿舞蹈病亨汀顿舞蹈病(Huntingtonsdisease)5353疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的神经退行引起的神
25、经退行性病变。性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc转变成大多为转变成大多为-折叠的折叠的PrPsc，这种形式的蛋白对蛋白，这种形式的蛋白对蛋白酶不敏感，水溶性差，可以相互聚集，最终形成淀粉样纤维沉淀，酶不敏感，水溶性差，可以相互聚集，最终形成淀粉样纤维沉淀，从而致病。从而致病。PrPcPrPSc5454StanleyBenjaminPrusiner1997,NobelPrizeinPhysiologyorMedicine蛋白聚集、沉淀，蛋白聚集、沉淀，引起细胞死亡引起细胞死亡PrPScPrPc1、一级结构中的保守序列决定空间结构、一级结构中的保守序列决定空
26、间结构（1）不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构）不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能不同功能（2）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构【经典举例经典举例】蛋白变性与复性蛋白变性与复性（3）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变变，功能不变【经典举例经典举例】镰刀形贫血镰刀形贫血5555一级结构是生物功能的基础一级结构是生物功能的基础小结小结 血红蛋白和肌红蛋白与氧结合血红蛋白和肌红蛋白与氧结合 蛋白构象疾病蛋白构象疾病2. 2. 空
27、间结构体现生物活性空间结构体现生物活性5656第四节第四节蛋白质的理化性质及分离纯化蛋白质的理化性质及分离纯化 5757一、蛋白质的两性电离一、蛋白质的两性电离 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的蛋白质的等电点等电点(isoelectricpoint,pI)当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离
28、离子子，净净电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点称为蛋白质的等电点。58585959问题：电泳后三种蛋白质位置问题：电泳后三种蛋白质位置电泳凝胶电泳凝胶39正极正极负极负极蛋白质混合液，蛋白质混合液，已知他们已知他们pIpI分分别为别为3.53.5，4.71,7.23,4.71,7.23,pH6060有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的pI为为4.6；5.0；5.3；6.7；7.3。电泳时欲使其中。电泳时欲使其中4种泳向正极，缓冲液的种泳向正极，缓冲液的pH应该是应该是A.5.0B.4.0C.6.0D.7.0E.8.0蛋蛋白白质质分分子子是
29、是大大分分子子，分分子子量量1万万-100万万，分子的直径分子的直径1100nm，胶粒范围。，胶粒范围。蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜6161二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质 +带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉6262变性变性（denaturation）：在某些理化
30、因素作用下，蛋）：在某些理化因素作用下，蛋白质的白质的空间构象空间构象破坏，导致若干理化性质和生物学性破坏，导致若干理化性质和生物学性质的改变。质的改变。6363三、蛋白质空间结构破坏引起变性三、蛋白质空间结构破坏引起变性 变性因素：变性因素：1 1）物理因素：高温、高压、射线等）物理因素：高温、高压、射线等2 2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等 变性后的表现：变性后的表现：1 1）生物学活性消失）生物学活性消失2 2）理化性质改变：粘度上升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、）理化性质改变：粘度上升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、结晶能力丧失。结晶能力丧失。646
31、46565复性（复性（renaturation）：蛋白质变性程度较轻，去除变性：蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。功能，称为复性。应用应用利用变性：酒精消毒，高压灭菌利用变性：酒精消毒，高压灭菌防止变性：低温保存生物制品防止变性：低温保存生物制品取代变性：乳品解毒取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒用于急救重金属中毒)6666（1 1）沉淀：不稳定蛋白质从溶液中析出）沉淀：不稳定蛋白质从溶液中析出（2 2）结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱）结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，
32、沉淀可溶于强酸、强碱（3 3）凝固：沉淀结块，凝块不溶于强酸、强碱）凝固：沉淀结块，凝块不溶于强酸、强碱变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性蛋蛋白白质质分分子子含含有有酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸（共共轭轭双双键键），在在280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质的的OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，因因此此可可作作蛋蛋白白质质定量测定定量测定。6767四、蛋白质紫外吸收四、蛋白质紫外吸收6868第五节第五节蛋白质的分离、纯化与结构分析蛋白质的分离、纯化与结构分析 6969蛋白质分离纯化方法蛋白质分离纯化方法蛋白质
33、电荷多少分离蛋白质电荷多少分离离子交换层析离子交换层析蛋白质分子量大小分离蛋白质分子量大小分离透析和超滤透析和超滤凝胶过滤层析凝胶过滤层析超速离心超速离心蛋白质溶解度大小分离蛋白质溶解度大小分离盐析盐析丙酮或乙醇沉淀丙酮或乙醇沉淀免疫沉淀免疫沉淀聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳双向电泳双向电泳蛋白质与配体亲和力大小分离蛋白质与配体亲和力大小分离亲和层析亲和层析定量定量定量定量一、透析及超滤法一、透析及超滤法- -分子量分子量透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。小分子化合物分开的方法。超滤法超滤法(u
34、ltrafiltration)应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。的。7070二、盐析、有机溶剂沉淀及免疫沉淀二、盐析、有机溶剂沉淀及免疫沉淀 丙丙酮酮、乙乙醇醇等等有有机机溶溶剂剂，可可破破坏坏蛋蛋白白质质的的水水化化层层，在在0 044低低温温下下，使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀。环环境境温温度度高高等等不不良良因因素影响下，有机溶剂可促使蛋白质变性。素影响下，有机溶剂可促使蛋白质变性。71717272盐盐析析(saltprecipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、
35、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷被被中中和和以以及及水水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。免疫沉淀法免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并：利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。分离获得抗原蛋白。蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分
36、分离离各各种种蛋蛋白白质质的的技技术术,称称为为电电泳泳(elctrophoresis)。7373三、电泳三、电泳- -电荷电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳双向电泳双向电泳待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据待分离蛋白质的颗粒大小、质（固定相）时，根据待分离蛋白质的颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使蛋白质组分在两相中反复电荷多少及亲和力等，使蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而分离蛋白质。分配，并以不同速度流经固定相而分离蛋白质。7474四、层析（四、层析（chromatography
37、）1.凝胶过滤（分子筛，凝胶过滤（分子筛，gelfiltration；排阻色谱）：排阻色谱）：利用各蛋白利用各蛋白质分子大小不同分离。质分子大小不同分离。2.离子交换：离子交换：蛋白质的电荷量及性质不同。蛋白质的电荷量及性质不同。阳离子交换剂：阳离子交换剂：CM-纤维素纤维素阴离子交换剂：阴离子交换剂：DEAE-纤维素纤维素3.亲和层析：抗原亲和层析：抗原-抗体，配体抗体，配体-受体，金属离子，生物素等受体，金属离子，生物素等75757676五、超速离心（五、超速离心（ultracenttrifugation）分子量分子量超速离心法：根据蛋白质的分子量与形状分离。超速离心法：根据蛋白质的分子量
38、与形状分离。蛋蛋 白白 质质 在在 离离 心心 场场 中中 的的 行行 为为 用用 沉沉 降降 系系 数数 (sedimentationcoefficient,S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。因因为为沉沉降降系系数数S大大体体上上和和分分子子量量成成正正比比关关系系，故故可可应应用用超超速速离离心心法法测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量，但但对对分分子子形形状状的的高高度度不不对对称称的的大大多数纤维状蛋白质不适用。多数纤维状蛋白质不适用。7777蛋白质分离纯化方法蛋白质分离纯化方法蛋白质电荷多少分离蛋白质电荷多少分离离子交换层析离子交换层析蛋白
39、质分子量大小分离蛋白质分子量大小分离透析和超滤透析和超滤凝胶过滤层析凝胶过滤层析超速离心超速离心蛋白质溶解度大小分离蛋白质溶解度大小分离盐析盐析丙酮或乙醇沉淀丙酮或乙醇沉淀免疫沉淀免疫沉淀聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳双向电泳双向电泳蛋白质与配体亲和力大小分离蛋白质与配体亲和力大小分离亲和层析亲和层析定量定量定量定量小结小结1、重要名词：、重要名词：isoelectricpoint；motifs；domain;subunit；allostericeffect;proteindenaturation;moleculardisease等等等等2、结构层次、结构层次n元
40、素组成：元素组成：C、H、O、N（16%）、Sn结构单位：结构单位：20种种L-氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等）氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等） n一级结构一级结构：肽键；多肽链；肽键；多肽链；N端端C端端n二级结构：稳定力（氢键）；类型（二级结构：稳定力（氢键）；类型（ 螺旋，螺旋， 折叠，折叠， 转角，无规卷曲）转角，无规卷曲）n三级结构特点三级结构特点n四级结构特点四级结构特点3、重要性质：、重要性质：两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性4、分离纯化：、分离纯化：超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛超滤；
41、盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛5、结构与功能关系（举例）、结构与功能关系（举例）7878总结总结79791.关于蛋白质二级结构的叙述正确的是指关于蛋白质二级结构的叙述正确的是指A.氨基酸的排列顺序氨基酸的排列顺序B.每一氨基酸侧链的空间构象每一氨基酸侧链的空间构象C.局部主链的空间构象局部主链的空间构象D.亚基间相对的空间位置亚基间相对的空间位置E.每一原子的相对空间位置每一原子的相对空间位置80802.下列氨基酸中含有两个羧基的氨基酸是下列氨基酸中含有两个羧基的氨基酸是A.天冬酰胺天冬酰胺B.谷氨酸谷氨酸C.赖氨酸赖氨酸D.谷氨酰胺谷氨酰胺E.组氨酸组氨酸81813.蛋白质分子中的蛋白质分子中的Domain属于属于A.一级结构一级结构B.二级结构二级结构C.三级结构三级结构D.超二级结构超二级结构E.四级结构四级结构82824.变性蛋白质的主要特点是变性蛋白质的主要特点是A.不易被蛋白酶水解不易被蛋白酶水解B.分子量降低分子量降低C.溶解性增加溶解性增加D.生物学活性丧失生物学活性丧失E.共价键被破坏共价键被破坏谢 谢
