《病原生物实验课：第09次实验 临床标本的细菌学2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《病原生物实验课：第09次实验 临床标本的细菌学2（20页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第九次实验第九次实验常见病原性细菌的鉴定常见病原性细菌的鉴定2 21.1.临床标本分离结果的染色、鉴定临床标本分离结果的染色、鉴定2.2.肠道杆菌的鉴定肠道杆菌的鉴定大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、奇异变形杆菌3.3.药敏试验药敏试验明确诊断报告明确诊断报告细菌学检验的一般程序细菌学检验的一般程序接种平板培养基，分离单个菌落接种平板培养基，分离单个菌落增增 菌菌涂片染色涂片染色快速诊快速诊断试验断试验初步诊初步诊断报告断报告各种鉴定试验各种鉴定试验生化试验生化试验血清学实验血清学实验涂片染色涂片染色药敏试验药敏试验动物试验动物试验挑取可疑菌落挑取可疑菌落第一天第一天第二天第二天第三天第三天
2、临床标本分离结果的染色、鉴定临床标本分离结果的染色、鉴定挑取单个菌落挑取单个菌落革革兰兰染色（每人操作）染色（每人操作），油镜观察，油镜观察根据革兰染色的结果结合根据革兰染色的结果结合菌落形态菌落形态进行进行生化鉴定生化鉴定 1. 革兰阳性球菌革兰阳性球菌 2. 革兰阴性球菌革兰阴性球菌 3.革兰阳性杆菌革兰阳性杆菌 4. 革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌挑取单个菌落调成菌液，进行挑取单个菌落调成菌液，进行药敏试验药敏试验肠道杆菌的鉴定及药敏试验肠道杆菌的鉴定及药敏试验菌种：大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、变形杆菌、产气杆菌（示教）；临床标本（操作）镜下形态菌落形态：选择培养基SS平板（示教大、痢
3、、伤、变）生化鉴定：1.初步生化鉴定鉴别培养基KIA、半固体（示教大、痢、伤、变）IMViC （示教大肠、产气）2.最终生化鉴定：数字编码技术药敏试验：K-B法一、肠道杆菌的形态观察一、肠道杆菌的形态观察1. 1. 镜下形态：革兰染色镜下形态：革兰染色大肠杆菌大肠杆菌 痢疾杆菌痢疾杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌肠道杆菌镜下形态相似，鉴别主要靠生化反应！肠道杆菌镜下形态相似，鉴别主要靠生化反应！2.2. 肠道杆菌的菌落形态（肠道杆菌的菌落形态（SSSS培养基）：培养基）： SSSS培养基（培养基（salmonella-salmonella-shigellashigella agar agar沙门菌属与志贺
4、菌属培养沙门菌属与志贺菌属培养基）：一种肠道杆菌的基）：一种肠道杆菌的强强选择性培养基。选择性培养基。含含乳糖、中性红指示剂、乳糖、中性红指示剂、胆盐、煌绿、枸橼酸钠、硫代硫胆盐、煌绿、枸橼酸钠、硫代硫酸钠、酸钠、枸橼酸铁枸橼酸铁。大肠埃希菌大肠埃希菌乳糖乳糖发酵发酵中性红中性红变红变红 产酸产酸 菌落桃红色，乳糖发酵菌落菌落桃红色，乳糖发酵菌落沙门菌沙门菌志贺菌志贺菌乳糖乳糖不发酵不发酵 菌落无色透明，乳糖不发酵菌落菌落无色透明，乳糖不发酵菌落胆盐、煌绿等胆盐、煌绿等：抑制肠道非病原性细菌及部分大肠埃希菌的生长；对志贺菌属及沙门菌属相对抑制性较弱，提高肠道致病菌检出率。枸橼酸铁枸橼酸铁：与细
5、菌产物H2S起反应生成FeS，使菌落中心变黑。大肠杆菌大肠杆菌可疑的致病菌可疑的致病菌无色、半透明、光滑、较小无色、半透明、光滑、较小不发酵乳糖菌落不发酵乳糖菌落据此可大致区分据此可大致区分肠道致病菌肠道致病菌与与非致病菌非致病菌桃红色、不透明、光滑、较大桃红色、不透明、光滑、较大发酵乳糖的菌落发酵乳糖的菌落1.1.初步生化鉴定初步生化鉴定（1 1）肠道杆菌）肠道杆菌KIAKIA鉴别培养基上的生长现象鉴别培养基上的生长现象 克氏双糖铁培养基（克氏双糖铁培养基（KligerKliger iron agar iron agar， KIAKIA）：）：含含葡萄糖、乳糖，比例为葡萄糖、乳糖，比例为1:
6、101:10，酚红酚红( (遇碱变红、遇酸变黄遇碱变红、遇酸变黄) )，枸橼酸铁铵、硫代硫酸钠枸橼酸铁铵、硫代硫酸钠，为肠杆菌科常用的鉴别培养基。，为肠杆菌科常用的鉴别培养基。二、肠道杆菌的生化鉴定二、肠道杆菌的生化鉴定原理：原理： 只分解只分解葡萄糖（葡萄糖（少）：，产酸量少，最终少）：，产酸量少，最终下层呈酸性下层呈酸性为黄色，为黄色，而而上层上层因酸被氧化因酸被氧化呈碱性为红色。呈碱性为红色。 分解分解葡萄糖乳糖（多）葡萄糖乳糖（多）：产酸（乳糖多，产酸多），：产酸（乳糖多，产酸多），上、上、下层均呈酸性为黄色。下层均呈酸性为黄色。 分解糖产酸的同时分解糖产酸的同时产气产气，则出现，则出
7、现气泡。气泡。 产生产生H H2 2S S枸橼酸铁铵 FeSFeS 培养基成培养基成黑色。黑色。方法：用接种针挑取单个菌落穿刺斜面并在直接用针表面密集划线。结果（示教+操作）：1）底层变黄，斜面变红为发酵葡萄糖不发酵乳糖；2) 底层和斜面同时变黄为发酵乳糖；底层和斜面均变红为不发酵此二糖；3）细菌产气时在底层有气泡或裂口现象。4）如果细菌产生硫化氢时可产生黑色的硫化铁； KIAKIA结果记录结果记录 斜面 底层 产气 H2S大肠埃希菌 A A + -伤寒杆菌 K A - -/+痢疾杆菌 K A - -变形杆菌 K A + +阴阴性性对对照照 （2 2）肠道杆菌在）肠道杆菌在半固体半固体培养基上
8、的生长现象培养基上的生长现象动力 （motile，M）实验培养基：半固体培养基结果： M 大肠埃希菌 + 伤寒杆菌 + 变形杆菌 + 痢疾杆菌 - 大肠杆菌： + + - -+ + - -产气杆菌： - - + +- - + +（3 3）IMViCIMViC （示教）（示教）IMViC是以下4个试验的缩写： 吲哚试验（I）、 甲基红试验（M）、VP试验（Vi）、枸橼酸盐利用试验（C），它是肠杆菌常用的生化鉴定试验，如大肠杆菌和产气杆菌可用以上试验鉴别。 I 吲哚试验（靛基质试验）：吲哚试验（靛基质试验）：玫瑰吲哚玫瑰吲哚大肠杆菌：大肠杆菌： 产气杆菌：产气杆菌：不变不变玫瑰吲哚玫瑰吲哚吲哚吲哚
9、 （靛基质）（靛基质）产气杆菌产气杆菌大肠杆菌大肠杆菌吲哚试剂吲哚试剂色氨酸酶葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇甲酸、乙酸甲酸、乙酸产气杆菌产气杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌：大肠杆菌：产气杆菌：产气杆菌： M M 甲基红试验甲基红试验pH5.4pH4.5甲基红甲基红阳阳性性阴阴性性对对照照葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇甲酸、乙酸甲酸、乙酸产气杆菌产气杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌：大肠杆菌：产气杆菌：产气杆菌： VP试验试验 KOH二乙酰二乙酰-萘酚萘酚红色化合物红色化合物不变不变 C C 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验：大肠杆菌：大肠杆菌：产气杆菌：产气杆菌：
10、枸橼酸盐枸橼酸盐铵盐铵盐碳酸盐碳酸盐氨氨培养基培养基pHpH上升上升培养基变蓝培养基变蓝溴麝香草酚蓝溴麝香草酚蓝2.2.最终生化鉴定最终生化鉴定数字编码鉴定技术数字编码鉴定技术（小组做）（小组做）原理（下次课讲）材料：材料：粪便标本1或2的单个致病菌菌落，15支微量生化管，砂轮，石蜡油，毛细吸管等方法：方法：用砂轮在微量生化管外围划一圈，将管上方掰断弃去，用接种针挑取单个菌落刺入。全部接种后，将赖氨酸、鸟氨酸和氨对3支管滴加石蜡密封。将所有生化管放入37恒温箱培养18-24h。结果判断：结果判断：根据颜色变化判断阴、阳性，查表，将细菌鉴定到种。3.3.药敏试验（小组做）药敏试验（小组做）原理（
11、p15）材料：材料：大肠菌液（已制）、药敏纸片（4种）、大平板、无菌棉签、小镊子方法：方法： （p15）无菌棉签均匀涂菌后贴药敏纸片，纸片距离恰当，棉签用后投入消毒液中。15mm25mm结果判断：结果判断：根据抑菌圈直径得出耐药、中介、敏感的结果，以指导临床用药。此结果必须在24内观察。本次实验示教本次实验示教1.大肠、伤寒、痢疾、变形的大肠、伤寒、痢疾、变形的SS平板，双糖铁培平板，双糖铁培养基，半固体培养基生长现象养基，半固体培养基生长现象2.IMViC(大肠、产气大肠、产气)。3.药敏试验结果药敏试验结果2个（大肠、金葡）个（大肠、金葡）本次实验操作本次实验操作1.每人做：每人做：临床标本分离结果的革兰染色临床标本分离结果的革兰染色2.每组做：每组做：血浆凝固酶试验（血浆凝固酶试验（兔血浆兔血浆）、）、KIA、半、半固体、药敏试验（大肠）、肠杆菌科生化鉴定固体、药敏试验（大肠）、肠杆菌科生化鉴定（微量管）（微量管）粪便标本粪便标本 直接镜检直接镜检（涂片、染色、镜检）（涂片、染色、镜检）分离培养：分离培养：选择鉴别培养基选择鉴别培养基（SS、血平板）KIA/MIU可疑菌落可疑菌落药物敏感试验药物敏感试验 鉴定鉴定（镜检、生化、补充试验、（镜检、生化、补充试验、血清学鉴定）血清学鉴定）小结小结
