第一章核酸与分子标志物

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1、第第 一一 章章核酸与分子核酸与分子标志物志物专业培养目培养目标培养学生具有扎培养学生具有扎实的的分子生物学理分子生物学理论基基础（2）了解本学科的前沿）了解本学科的前沿领域和域和发展展趋势（1）掌握本学科的基）掌握本学科的基础理理论和基本技能和基本技能临床床分子生物学分子生物学检验考考 试考考试多途径考核多途径考核实验成成绩40%考考试成成绩60%绪论第一第一节 临床分子生物学床分子生物学检验的定的定义及其及其发展展研究研究对象：生物大分子象：生物大分子(核酸、蛋白核酸、蛋白质)的的结构、功能和生物合成等构、功能和生物合成等研究目的：研究目的：阐明各种生命明各种生命现象的本象的本质研究技研究

2、技术：克隆、：克隆、扩增、增、测序、序、 杂交、交、电泳等泳等分子生物学分子生物学分子生物学的分子生物学的诞生与生与发展展是整个自然科学的大事是整个自然科学的大事分子生物学理分子生物学理论与技与技术的的结合，使人合，使人们对疾疾病从病从现象的描述深入到了从分子水平的象的描述深入到了从分子水平的认识。临床分子生物学床分子生物学：是利用分子生物学理：是利用分子生物学理论与技与技术从基因从基因组、转录组、蛋白、蛋白质组、代、代谢组等水平研究疾病的等水平研究疾病的发生生发展机制、疾展机制、疾病的病的预测与与风险评价、疾病的价、疾病的临床床诊断与治断与治疗，以及疾病的，以及疾病的预防防与控制。与控制。临

3、床分子生物学床分子生物学检验：是分子生物学技是分子生物学技术在在临床床检验诊断断应用中用中发展起来的，以疾病展起来的，以疾病为中心，以生物分子中心，以生物分子标志物志物为靶靶标的新一代的新一代临床床检验诊断技断技术，是，是临床分子生物学的重要床分子生物学的重要组成部分。成部分。四个四个阶段：段：一、以一、以导致致遗传病的基因突病的基因突变位点位点为靶靶标，以，以DNA分子分子杂交交为核心核心二、以二、以PCR技技术为核心核心三、以生物芯片三、以生物芯片为核心核心四、以四、以DNA测序技序技术为核心核心第二第二节 临床分子生物学床分子生物学检验靶靶标及及其其应用用广广义：分子：分子标志物包括志物

4、包括:基因基因组DNA、各种、各种RNA、蛋白、蛋白质和各种代和各种代谢物物临床分子生物学床分子生物学检验靶靶标主要以核酸主要以核酸（DNA和和RNA）为主主基因基因组DNA是是临床分子生物学床分子生物学检验中最常中最常用的分子靶用的分子靶标一、病原生物基因一、病原生物基因1.菌种菌种鉴定：定：PCR测序和序和PCR-DNA探探针杂交交;缩短短检测时间 2.确定病毒感染和病毒确定病毒感染和病毒载量：明确感染源，量：明确感染源，判断病情，判断病情，检测疗效效3.病毒分析：基因型病毒分析：基因型变异异产生不同生不同临床症状床症状4.细菌耐菌耐药监测和分子流行病学和分子流行病学调查 ：随：随机机扩增

5、多增多态性性DNA；指；指导选择治治疗方案，方案，控制病原菌的感染控制病原菌的感染传播播二、基因二、基因变异异1.致病基因的分子缺陷致病基因的分子缺陷2.线粒体基因突粒体基因突变3.肿瘤相关基因瘤相关基因 1.致病基因致病基因结构构发生了改生了改变，影响了，影响了编码产物量和物量和质的改的改变，如血，如血红蛋白病、血友病、蛋白病、血友病、Duchenne肌肌营养不良等。养不良等。2.致致病病基基因因中中核核苷苷酸酸三三联体体重重复复序序列列发生生高高度度扩展展，如脆性如脆性X综合征、亨廷合征、亨廷顿病、病、强强直性肌直性肌营养不良等。养不良等。 1.致病基因的分子缺陷致病基因的分子缺陷单基因病

6、基因病血血红蛋白疾病及其基因蛋白疾病及其基因变异异临床表床表现：贫血血发病原因：病原因：单一氨基酸一氨基酸变异：异：镰刀型刀型红细胞胞贫血血 部分或整个珠蛋白部分或整个珠蛋白基因缺失基因缺失：地中海：地中海贫血血血友病及其基因血友病及其基因变异异杜氏杜氏营养不良养不良临床表床表现：横：横纹肌萎肌萎缩，腓，腓肠肌假性肥大肌假性肥大发病原因病原因：抗肌萎：抗肌萎缩蛋白基因内部蛋白基因内部发生缺失，重复或点突生缺失，重复或点突变临床表床表现：出血：出血发病原因病原因：血友病甲、乙的基因缺失分：血友病甲、乙的基因缺失分别在凝血因子在凝血因子，基因中基因中 参与多基因病参与多基因病发生的基因被称生的基因

7、被称为疾病相关基因。疾病相关基因。多基因病的多基因病的发生涉及生涉及诸多因素，某一因素的多因素，某一因素的变异异不足以解不足以解释多基因病的多基因病的发病机制。病机制。多基因病多基因病病种：病种：精神神精神神经疾病，高血疾病，高血压病，糖尿病，病，糖尿病，某些先天畸形某些先天畸形某些先天畸形某些先天畸形等等发病原因：病原因：多基因，多因素共同作用多基因，多因素共同作用多基因表型：身高多基因表型：身高先天性巨先天性巨结肠2.线粒体基因突粒体基因突变线粒体粒体DNA突突变使使线粒体功能粒体功能发生障碍，直接影生障碍，直接影响人体响人体组织和和细胞的各种生物学功能，胞的各种生物学功能，导致致线粒粒体

8、体 遗传病。病。它具有母系它具有母系遗传、基因突、基因突变具有具有阈值效效应以及多以及多系系统受累等受累等遗传学特征。学特征。 3.肿瘤相关基因瘤相关基因肿瘤的瘤的发生是由生是由多种致癌因素多种致癌因素综合作用合作用的的结果。果。与与肿瘤瘤发生相关的基因称生相关的基因称为肿瘤相关基因，包括癌基因瘤相关基因，包括癌基因和抑癌基因。和抑癌基因。 包括病毒癌基因和包括病毒癌基因和细胞癌基因胞癌基因,它它们具有潜在具有潜在诱导细胞胞恶性性转化的特征。化的特征。癌基因癌基因癌基因癌基因抑癌基因抑癌基因抑癌基因抑癌基因是存在于正常是存在于正常细胞内的一胞内的一类可以抑制可以抑制细胞生胞生长的基的基因，具有

9、潜在抑癌作用。因，具有潜在抑癌作用。三、基因多三、基因多态性性1.基因定位和疾病相关性分析基因定位和疾病相关性分析 ：将致病基因定位于将致病基因定位于染色体相染色体相应位点，分析位点，分析遗传标志与疾病的关志与疾病的关联程程度度2.疾病疾病诊断和断和遗传咨咨询：胎儿胎儿产前前诊断；断；遗传疾病疾病风险评估估3.多基因病的研究多基因病的研究：检测基因多基因多态性，了解疾病性，了解疾病发生机制，疾病分生机制，疾病分类等等4.器官移植配型和个体器官移植配型和个体识别：器官移植前器官移植前HLA配型配型等等DNA指指纹用于罪犯用于罪犯识别DNA指指纹用于用于亲子子鉴定定四、循四、循环游离核酸游离核酸1

10、、循、循环游离核酸与游离核酸与肿瘤瘤2、循、循环游离核酸与游离核酸与产前前诊断断3、循、循环microRNA与与肿瘤瘤诊断断第三第三节 临床分子生物学床分子生物学检验发展与展与应用用一、一、临床分子生物学床分子生物学检验与感染性疾病与感染性疾病诊断断与治与治疗二、二、遗传性疾病的性疾病的临床分子生物学床分子生物学检验三、三、肿瘤的瘤的临床分子生物学床分子生物学检验四、四、临床分子生物学床分子生物学检验与个体化医学与个体化医学 人人类基因基因组计划划是由美国能源部和是由美国能源部和NIH(national institutes of heath)联合做出的，合做出的，1990年年10开始，争取在

11、开始，争取在15年内完成的目年内完成的目标：鉴定人体定人体DNA估估计约8万个基因，万个基因，测序构成人序构成人DNA的的30亿个个碱基，碱基，贮存存这些信息于些信息于databases(数据数据库)并并发展展data analysis的工具的工具.实际包括两部分工作包括两部分工作:一是一是 mapping，一是，一是sequencing。中国：重点是研究我中国：重点是研究我们特有的致病基因的特有的致病基因的图谱和定序和定序 。 人人类基因基因组计划划 （human genome project, HGP） 人人类基因基因组计划的启划的启动美国于美国于1990年年10月启月启动“人人类基因基因

12、组计划划”欧洲、日本、欧洲、日本、韩国、俄国、俄罗斯、澳大利斯、澳大利亚和和中国中国相相继加入人加入人类基因基因组计划的研究行列划的研究行列中国于中国于1994年启年启动中国人中国人类基因基因组计划划最初的最初的经费来源来源: 国家自然科学基金委国家自然科学基金委员会会 “863”高科技高科技计划划最初的研究最初的研究项目目:中中华民族基因民族基因组中若干位点基因中若干位点基因结构的研究构的研究重大疾病相关基因定位、克隆、重大疾病相关基因定位、克隆、结构与功能研究构与功能研究1999年年9月月1日，在国日，在国际基因基因组计划第划第5次次战略会略会议（伦敦）上，敦）上，争取到争取到第第3号染色

13、体短臂号染色体短臂上上3000万万bp的的测序任序任务。首要条件之。首要条件之一：中国要遵守一：中国要遵守“百慕大原百慕大原则”，即，即HGP的精神，所有合格的数的精神，所有合格的数据都据都应在在24小小时内上网。至此占世界人口内上网。至此占世界人口20%的中国的中国负责测定定HG中的中的1%序列，成序列，成为第第6个参加个参加HGP实质性工作的国家。在性工作的国家。在30亿bp的的测序上，序上，美国承担美国承担54%。英国。英国33%，日本，日本7%，法国，法国2.8%，德国，德国2.2%。中国要在中国要在仅有的有的8个月内完成相当于德国的个月内完成相当于德国的一半，法国的三分之一的工作量。

14、一半，法国的三分之一的工作量。设立的立的HGP中国中国实验室室对外外称呼：称呼：“华大基因研究中心大基因研究中心”。 结果，果，仅用半年用半年时间，于，于2000年年4月底超月底超额完成了完成了3000万万bp的的“工作框架工作框架图“。同日，美国同日，美国同日，美国同日，美国总统总统ClintonClinton和英国首相和英国首相和英国首相和英国首相BlairBlair代表美、英、代表美、英、代表美、英、代表美、英、法、德、日本和中国等六国法、德、日本和中国等六国法、德、日本和中国等六国法、德、日本和中国等六国发发表声明：国表声明：国表声明：国表声明：国际际HGPHGP和和和和CeleraC

15、elera基因公司完成的基因公司完成的基因公司完成的基因公司完成的HGHG工作及相关成果属于全人工作及相关成果属于全人工作及相关成果属于全人工作及相关成果属于全人类类共享的共享的共享的共享的资资源和源和源和源和财财富。富。富。富。20022002年年年年1 1月，由中国、日本、美国、德国和月，由中国、日本、美国、德国和月，由中国、日本、美国、德国和月，由中国、日本、美国、德国和韩韩国等合国等合国等合国等合作作作作项项目目目目“ “智能基因的探索智能基因的探索智能基因的探索智能基因的探索” ”，构建了人与黑猩猩，构建了人与黑猩猩，构建了人与黑猩猩，构建了人与黑猩猩对对比的比的比的比的基因基因基因

16、基因组组（包括（包括（包括（包括6.46.4万个万个万个万个DNADNA片段）物理片段）物理片段）物理片段）物理图谱图谱。对对比比比比过过程中程中程中程中发现发现：两者碱基排列：两者碱基排列：两者碱基排列：两者碱基排列98.77%98.77%完全相同，差异只完全相同，差异只完全相同，差异只完全相同，差异只占占占占1.23%1.23%。这这只有只有只有只有1.23%1.23%的基因，却藏着人的智慧和的基因，却藏着人的智慧和的基因，却藏着人的智慧和的基因，却藏着人的智慧和能力的秘密，使人与猩猩如此不同能力的秘密，使人与猩猩如此不同能力的秘密，使人与猩猩如此不同能力的秘密，使人与猩猩如此不同 200

17、32003年年年年4 4月月月月1414日，中、美、日、日，中、美、日、日，中、美、日、日，中、美、日、德、法、英等德、法、英等德、法、英等德、法、英等6 6国科学家宣布人国科学家宣布人国科学家宣布人国科学家宣布人类类基因基因基因基因组组序列序列序列序列图绘图绘制成功，人制成功，人制成功，人制成功，人类类基因基因基因基因组计组计划的所有目划的所有目划的所有目划的所有目标标全部全部全部全部实现实现 已完成的序列已完成的序列已完成的序列已完成的序列图图覆盖人覆盖人覆盖人覆盖人类类基因基因基因基因组组的的的的99%99%，精确率达到，精确率达到，精确率达到，精确率达到99.99%99.99%，进进度

18、比原度比原度比原度比原计计划提前两年多划提前两年多划提前两年多划提前两年多 20042004年年年年1010月，公布人月，公布人月，公布人月，公布人类类基因基因基因基因组组完完完完成成成成图图 第一章第一章 核酸与分子核酸与分子标志物志物第一第一节 核酸的核酸的结构与功能构与功能第二第二节 基因的基因的结构与功能构与功能第三第三节 基因基因组的的结构与功能构与功能第四第四节 核酸分子核酸分子标志物志物教学内容教学内容1熟悉核酸熟悉核酸结构和功能；构和功能；2掌握基因的掌握基因的结构与功能构与功能；3掌握基因掌握基因组结构与特征构与特征；4. 熟悉核酸分子熟悉核酸分子标志物。志物。教学目的与要求

19、教学目的与要求第一第一节 核酸的核酸的结构与功能构与功能核酸核酸(nucleic acid) 以以核苷酸核苷酸为基本基本组成成单位的生物大分子，位的生物大分子，携携带和和传递遗传信息。信息。 DNADNA（D Deoxyriboeoxyribon nucleic ucleic a acid)cid)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 RNARNA（R Riboibon nucleic ucleic a acid) cid) 核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸元素元素元素元素组组成成成成主要元素主要元素组成：成： C、H、O、N、P(9-11%)与蛋白与蛋白质比比较，核酸，核酸一般不

20、含一般不含S，而，而P的含量的含量较为稳定，占定，占9-11%。 基本构成基本构成单位：核苷酸位：核苷酸(nucleotide)核苷酸由核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成三部分构成分子分子组成成碱基碱基(base)：嘌嘌呤碱，呤碱，嘧啶碱；碱；戊糖戊糖(ribose)：核糖，脱核糖，脱氧核糖；氧核糖；磷酸磷酸(phosphate)碱碱 基基嘌嘌呤呤(purine) 腺嘌呤腺嘌呤(adenine, A)鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine, G)嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C)尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,

21、T)DNA:A、G、C、TRNA:A、G、C、U核酸中核苷酸的连接方式核苷酸之核苷酸之间以以磷酸二磷酸二酯键连接形接形成多核苷酸成多核苷酸链，即，即核酸核酸(DNA,RNA)。5端端3端端一、一、 DNA的的结构与功能构与功能 Structure and Function of DNA（一）（一）DNA的的组成成（二）（二）DNA的的结构与功能构与功能（三）（三）DNA双螺旋双螺旋结构的构的变异异（四）（四）DNA功能与分析技功能与分析技术一一级结构是指构是指DNA分子中核苷酸的排列分子中核苷酸的排列顺序及序及连接方式。核苷酸的排列接方式。核苷酸的排列顺序代表了序代表了遗传信息。信息。1、核苷

22、酸的、核苷酸的连接方式：接方式： 3 , 5 磷酸二磷酸二酯键2、核酸的基本、核酸的基本结构形式：多核苷酸构形式：多核苷酸链n末端：末端： 5 端、端、 3 端端n多核苷酸多核苷酸链的方向：的方向： 5端端3端端(由左至右由左至右)3、表示方法：、表示方法：结构式、构式、线条式、文字条式、文字缩写写DNA的一级结构1. 两条两条链反向平行，反向平行，围绕同同一中心一中心轴构成构成右手双螺右手双螺旋旋 (double helix)。螺旋。螺旋直径直径2nm，表面有，表面有大沟和大沟和小沟小沟。2. 磷酸磷酸-脱氧核糖骨架位于脱氧核糖骨架位于螺旋螺旋外外侧，碱基垂直于，碱基垂直于螺旋螺旋轴而伸入而

23、伸入内内侧。每。每圈螺旋含圈螺旋含10个碱基个碱基对 (bp)，螺距螺距为3.4nm。二二级结构：构： 双螺旋双螺旋结构模型构模型(double helix model)3. 两条两条链通通过碱基碱基间的的氢键相相连，A对T有两个有两个氢键，C对G有三个有三个氢键，这种种A-T、C-G配配对的的规律，称律，称为碱基互碱基互补规则。4. 维持双螺旋持双螺旋稳定的因素：定的因素：横向横向为氢键，纵向向为碱碱基基间的堆的堆积力。力。DNA的超的超级结构构（一）（一）DNA的超螺旋的超螺旋结构构超螺旋超螺旋结构构(superhelix 或或supercoil)DNA双螺旋双螺旋链再再盘绕即形成超螺旋即

24、形成超螺旋结构。构。 正超螺旋正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与方向与DNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同 负超螺旋超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与方向与DNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反 DNA在真核生物在真核生物细胞核内的胞核内的组装装DNA：以：以负超螺旋超螺旋缠绕在在组蛋白上蛋白上组蛋白核心：蛋白核心：H2B ,H2A ,H3 ,H4H1组蛋白在核小体之蛋白在核小体之间真核生物染色体由真核生物染色体由DNA和和蛋白蛋白质构成，其基本构成，其基本单位位是是 核小体核小体(nucleosome)。5.5nm串珠状核小体串珠状核小体DNA双螺旋片

25、段双螺旋片段染色染色质纤维伸展形染色伸展形染色质片段片段密集形染色密集形染色质片段片段整个染色体整个染色体（四）（四）DNA功能与分析技功能与分析技术DNA分析技分析技术：包括：包括传统的的DNA提取、提取、分离和分离和纯化，化，PCR扩增、限制性内切增、限制性内切酶酶和和杂交分析，以及交分析，以及发展迅速的基因芯片展迅速的基因芯片和和DNA测序技序技术。二二 、RNA的的结构与功能构与功能Structure and Function of RNA中心法中心法则（genetic central dogma）三三联体密体密码 （一）（一）RNA的的组成与分成与分类 （二）（二） RNA的的结构和

26、功能构和功能糖糖h* tRNA的一的一级结构特点构特点 含含 10-20% 稀有碱基，稀有碱基，如如 DHU 3末端末端为 - CCA-OH 5末端大多数末端大多数为G 具有具有 T C 1、 tRNA的的结构与功能构与功能双双氢尿尿嘧啶(DHU)假尿假尿嘧啶( )次黄次黄嘌嘌呤呤(I)* tRNA的二的二级结构构三叶草形三叶草形 氨基酸臂氨基酸臂 DHU环 反密反密码环 额外外环 TC环氨基酸臂氨基酸臂额外外环tRNA的的功功能能：活活化化、搬搬运运氨氨基基酸酸到到核核糖糖体体，参与蛋白参与蛋白质的翻的翻译。2、信使、信使RNA的的结构与功能构与功能hnRNA 内含子内含子(intron)m

27、RNA * mRNA成熟成熟过程程 外外显子子(exon)真核生物真核生物mRNA的的结构特点构特点1. 大大多多数数真真核核mRNA的的5末末端端均均在在转录后后加加上上一一个个7-甲甲基基鸟苷苷二二磷磷酸酸基基，同同时第第一一个个核核苷苷酸酸 的的 C2也也 是是 甲甲 基基 化化 ， 形形 成成 帽帽 子子 结 构构 ：m7GpppNm-。2. 大多数真核大多数真核mRNA的的3末端有一个多聚腺苷酸末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称构，称为多聚多聚A尾。尾。mRNA核内向胞核内向胞质的的转位位mRNA的的稳定性定性维系系翻翻译起始的起始的调控控 帽子帽子结构和构和多聚多聚A尾的功

28、能尾的功能OCH3DNAmRNA蛋白蛋白转录翻翻译原核原核细胞胞 细胞胞质细胞核胞核DNA内含子内含子外外显子子转录转录后剪接后剪接转运运mRNAhnRNA翻翻译蛋白蛋白真核真核细胞胞 mRNA的功能的功能 把把DNA所所携携带的的遗传信信息息，按按碱碱基基互互补配配对原原则，抄抄录并并传送送至至核核糖糖体体，用用以以决决定定其其合合成成蛋蛋白白质的氨基酸排列的氨基酸排列顺序。序。3、核糖体、核糖体RNA的的结构与功能构与功能* rRNA的功能的功能参参与与组成成核核糖糖体体，作作为蛋蛋白白质生生物物合合成成的的场所。所。* rRNA的的结构构真核生物真核生物18SrRNA的二的二级结构构rR

29、NA的种的种类（根据沉降系数）（根据沉降系数）真核生物真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA miRNA是一是一组短小、本身不具有开放短小、本身不具有开放阅读框架、框架、长度度为20-25个核苷酸的序列，它的个核苷酸的序列，它的3端端可有两个碱基，可有两个碱基，5端有一个磷酸基端有一个磷酸基团，具有高度，具有高度保守性、保守性、时序性和序性和组织特异性。特异性。4、 微微RNA（miRNA） （三）（三）RNA分析技分析技术 RNA分离提取、分离提取、纯化、定量与化、定量与鉴定等定等 RNA表达表达

30、检测一般先逆一般先逆转录成成为cDNA，再，再进行行检测。第二第二节 基因的基因的结构与功能构与功能基因的定基因的定义基因是基因是DNA分子中含有特定分子中含有特定遗传信息的一段信息的一段核苷酸序列，是核苷酸序列，是遗传物物质的最小功能的最小功能单位。位。将将将将编码编码蛋白蛋白蛋白蛋白质质的基因根据其是否具有的基因根据其是否具有的基因根据其是否具有的基因根据其是否具有转录转录和翻和翻和翻和翻译译功能可以把基因功能可以把基因功能可以把基因功能可以把基因分分分分为为三三三三类类。1. 1.具有具有具有具有转录转录和翻和翻和翻和翻译译功能；功能；功能；功能；2. 2.只有只有只有只有转录转录功能而

31、没有翻功能而没有翻功能而没有翻功能而没有翻译译功能的基因，包括功能的基因，包括功能的基因，包括功能的基因，包括tRNAtRNA基因和基因和基因和基因和rRNArRNA基因；基因；基因；基因；3. 3.不不不不转录转录的基因，它的基因，它的基因，它的基因，它对对基因表达起基因表达起基因表达起基因表达起调节调节控制作用，包括启控制作用，包括启控制作用，包括启控制作用，包括启动动基因和操基因和操基因和操基因和操纵纵基因。基因。基因。基因。一、基因的一、基因的结构与功能构与功能（一）、原核生物的基因（一）、原核生物的基因结构构（二）、真核生物的基因（二）、真核生物的基因结构构（一）原核生物的基因（一）

32、原核生物的基因结构构 操操纵子子(operon) 机制机制编码序列序列 启启动序列序列 操操纵序列序列 其他其他调节序列序列(promoter)(operator)乳糖操乳糖操纵子的子的结构构Z： -半乳糖苷半乳糖苷酶酶基因基因Y： 透透酶酶基因基因A：乙：乙酰基基转移移酶酶基因基因I：调节基因基因P：启：启动序列序列O：操：操纵序列序列基因簇（基因簇（gene cluster）是是RNA聚合聚合酶酶结合并启合并启动转录的特异的特异DNA序列。序列。1、 启启动子子RNA转录起始起始-35区区-10区区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATA

33、ATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNATyrlacrecAAra BAD TTGACA TATAAT共有序列共有序列2、终止子：止子：给予予RNA聚合聚合酶酶转录终止信号止信号的的DNA序列。在一个操序列。在一个操纵子至少在子至少在结构基因构基因群最后一个基因的后面有一个群最后一个基因的后面有一个终止子。止子。 3、 操操纵元件元件 （操操纵序列）序列） 阻遏蛋白阻遏蛋白(repressor)的的结合位点合位点当当操操纵序序列列结合合有有阻阻遏遏蛋蛋白白时，会会阻阻碍碍RNA聚聚合合酶酶与与启启动序序列列的的结合合，或或是是RN

34、A聚聚合合酶酶不能沿不能沿DNA向前移向前移动 ，阻碍，阻碍转录。启启动序列序列编码序列序列操操纵序列序列pol阻遏蛋白阻遏蛋白真核生物断裂基因真核生物断裂基因结构示意构示意图（二）真核生物的基因（二）真核生物的基因结构构顺式作用元件式作用元件反式作用因子反式作用因子RNA synthesisSplicing remove intronsProtein synthesismRNA启启动子子(promotor):真真核核基基因因启启动子子是是RNA聚聚合合酶酶结合合位位点点周周围的的一一组转录控控制制组件件，至至少少包包括括一一个个转录起起始始点点以以及及一一个个以以上上的功能的功能组件件增增强

35、强子（子（enhancer)：远离离转录起始点，决定起始点，决定基因的基因的时间、空、空间特异性表达、增特异性表达、增强强启启动子子转录活性的活性的DNA序列。其序列。其发挥作用的方式通常无作用的方式通常无专一性一性,与方向、距离无关与方向、距离无关。沉默子（沉默子（silencer）：）：负性性调节元件元件远离离顺式作用元件式作用元件 ，当其，当其结合特异蛋白因子合特异蛋白因子时，对基因基因转录起阻遏作用。起阻遏作用。三、基因突三、基因突变基因突基因突变：具有具有遗传效效应的的DNA分子上特定的核苷酸分子上特定的核苷酸的序列的序列发生改生改变，导致致遗传效效应发生相生相应变化。化。（一）点突

36、（一）点突变：错义突突变、无无义突突变、RNA加工突加工突变（二）插入或缺失突（二）插入或缺失突变：移移码突突变（三）（三）动态突突变：短串：短串联重复序列重复次数增加重复序列重复次数增加Missense mutation （错义突突变）：）：These point mutations involve the alteration of a single base which changes a codon such that the encoded amino acid is altered. 密密码子的第一、二位碱基改子的第一、二位碱基改变导致致对应的氨基酸改的氨基酸改变 镰刀型刀型细胞胞

37、贫血症血症:Glu-Val Nonsense mutation（无（无义突突变）：）： Nonsense mutation create stop codons （UAA/UAG/UGA） and produce shortened polypeptides 蛋白蛋白质合成提前合成提前终止，止，产生不完整的、无正常生不完整的、无正常活性活性肽链 Frameshift mutation（移（移码突突变）：）：Frameshift mutations involve insertion or deletion of a base producing an altered reading frame

38、. Frameshift mutations usually have a serious effect on the encoded protein and are associated with mutant phenotypes. e.g. ATG TTT CCC AAA GGG TTT - CCC TAG TAC AAA GGG TTT CCC AAA - GGG ATCmRNA AUG UUU CCC AAA GGG UUU - CCC UAG(终止止)Pro. MetPhePro LysGlyPhe - Pro 甲硫甲硫 苯丙苯丙 脯脯 赖 甘甘 苯丙苯丙 - 脯脯增加增加A/T

39、bp ATG ATT TCC CAA AGG GTT T- TAC TAA AGG GTT TCC CAA A-mRNA AUG AUU UCC CAA AGG GUU U-Pro. MetIle-SerGln ArgVal- 甲硫甲硫 异亮异亮 丝 谷氨谷氨酰胺胺 精精 缬- 第三第三节基因基因组结构与特征构与特征 两个重要概念：两个重要概念：基因基因组（genome）：）：一个一个细胞或一种生物体的胞或一种生物体的整套整套遗传物物质。 基因（基因（gene）：）：基因基因组中一个功能性中一个功能性遗传单位，位，是是贮存有功能的蛋白存有功能的蛋白质多多肽链信息、信息、RNA序列信序列信 息及

40、表达息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。些信息所必需的全部核苷酸序列。 一、一、 原核生物基因原核生物基因组（一）原核生物基因（一）原核生物基因组特征特征（二）（二）质粒粒（三）（三）转座因子座因子（一）原核生物基因（一）原核生物基因组特征特征 什么是原核生物（什么是原核生物（prokaryote）？）？ 细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放放线菌和菌和蓝绿藻等原始生物的藻等原始生物的总称，称，是最是最简单的的细胞生物体。胞生物体。 1、原核生物基因、原核生物基因组DNA较小：小： 一般在一般在106-107bp之之间，大，大肠杆菌基因杆菌基因组

41、DNA由由4.6106 bp组成，成，是人是人类基因基因组3109bp的的1。基因数目。基因数目较少，少，约含含3500个基个基因，原核生物基因因，原核生物基因组中只有一个中只有一个DNA复制起点复制起点2.原核生物的原核生物的类核核结构构 原核生物没有典型的原核生物没有典型的细胞核胞核结构，基因构，基因组DNA位于位于细胞中央胞中央的核区，无核膜将其与的核区，无核膜将其与细胞胞质隔开，但能在蛋白隔开，但能在蛋白质的的协助下，助下，以一定的以一定的组织形式形式盘曲、折叠包装，形成曲、折叠包装，形成类核（核（nucleoid），），也称也称拟核。核。 3.原核生物的操原核生物的操纵子子结构构 操

42、操纵子子结构是原核生物基因构是原核生物基因组的功能的功能单位位 原核生物的原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列排列于染色体上。于染色体上。结构基因构基因连同其上游的同其上游的调控区（包括控区（包括调节基基因、启因、启动基因和操基因和操纵基因）以及下游的基因）以及下游的转录终止信号，共止信号，共同同组成了一个基因表达成了一个基因表达单位，位，即操即操纵子（子（operon）结构构。 什么是多什么是多顺反子反子mRNA分子分子? 一个一个mRNA分子分子带有几种蛋白有几种蛋白质的的遗传信息。利用共同的启信息。利用共同的启动子和子和终止信号，止信号，转录

43、的的mRNA分子可以分子可以编码几种不同的、但几种不同的、但多多为功能相关的蛋白功能相关的蛋白质。 4.原核生物的原核生物的结构基因构基因基因中基因中编码RNA或蛋白或蛋白质的的DNA序列称序列称为结构基因。构基因。结构基因中没有内含子，基因是构基因中没有内含子，基因是连续的，的，RNA被合成后不需要被合成后不需要经过剪接加工。剪接加工。5.具有具有编码同工同工酶的基因的基因6.含有可移含有可移动DNA序列序列（二）（二）质粒粒 什么是什么是质粒粒(plasmid)? 细菌菌细胞染色体以外，能独立复制并胞染色体以外，能独立复制并稳定定遗传的共价的共价闭合合环状分子。状分子。 质粒命名的原粒命名

44、的原则 用小写字母用小写字母p代表代表质粒，在粒，在p字母后面用两个大写字母代表字母后面用两个大写字母代表发现这一一质粒的作者或粒的作者或实验室名称室名称 pUC18plasmid编号号发现者名字者名字质粒具有不兼容性粒具有不兼容性 质粒的分粒的分类复制机制复制机制 严紧型型 松弛型松弛型功能功能 F质粒粒 R质粒粒 Col质粒粒转移方式移方式 接合型接合型 可移可移动型型 自自传递型型大小大小 小型小型(1.5kb-15kb) 大型大型(60kb-120kb)宿主范宿主范围 窄宿主窄宿主谱型型 广宿主广宿主谱型型 质粒的粒的选择性性标记 抗抗药性基因、性基因、营养缺陷型基因、抗重金属基因。养

45、缺陷型基因、抗重金属基因。 最常最常见的的选择性性标记是抗是抗药性基因，即性基因，即带有一种有一种 或多种抗生素的抗性基因，可或多种抗生素的抗性基因，可赋予宿主菌抵抗某种予宿主菌抵抗某种抗抗 生素的能力。生素的能力。 pBR3224363bpHind（三）（三）转座因子座因子 转座因子又称座因子又称转座元件（座元件（transposable element），是一），是一类在在细菌染色体、菌染色体、质粒或噬菌粒或噬菌体之体之间自行移自行移动并具有并具有转位特性的独立的位特性的独立的DNA序列。序列。 包括：插入序列（包括：插入序列（ insertion sequence, IS) 转座子座子(

46、transposon ,Tn) 噬菌体噬菌体(Mu)：具有具有转座功能的温和性噬菌体，座功能的温和性噬菌体，能整合到宿主基因能整合到宿主基因组内内 1940s, 美国冷泉港美国冷泉港实验室室(Cold Spring Harber Lab) 的女科学家的女科学家B.McClintock(荣荣获1983年若年若贝尔生物医学生物医学奖)在玉米中首次在玉米中首次发现. 1.插入序列插入序列(insertion sequence，IS) 一个一个转位位酶基因及其两基因及其两侧的反向重复序列，的反向重复序列，长度度为700 - 2 000bp。共同特征共同特征:A: 两两末末端端均均有有一一段段反反向向重

47、重复复序序列列(IR,长度度 不一定相同不一定相同.B: 一般只一般只编码一种一种转位位酶.C: 插入后可在两插入后可在两侧形成形成顺向重复序列向重复序列.D: 可双向插入可双向插入: 正向正向 , 反向反向. 2.转座子座子(transposon，Tn) 具有具有转座座酶基因、抗性基因，大小基因、抗性基因，大小为4.500-20kbp。病毒病毒自然界普遍存在的一种自然界普遍存在的一种结构构简单、不能、不能单独繁殖，独繁殖，只能在宿主只能在宿主细胞内胞内进行复制以保行复制以保证遗传信息信息传递的微生物。的微生物。完整的病毒完整的病毒颗粒是由核酸和蛋白粒是由核酸和蛋白质组成。成。二二 病毒基因病

48、毒基因组（一）病毒基因（一）病毒基因组特征特征1.基因基因组的碱基的碱基组成成2.基因基因组核酸核酸类型型 3.基因基因组中有基因重叠中有基因重叠现象象4.基因基因组中具有操中具有操纵子子结构构5.病毒基因可病毒基因可连续也可也可间断断6.基因基因组中重复序列少中重复序列少 7.基因基因组中非中非编码区少区少 8.基因基因组是是单倍体倍体 9.相关基因相关基因丛集集 10.病毒基因病毒基因组含有不含有不规则结构基因，构基因，转录出多种出多种mRNA分子。分子。 1.基因基因组的碱基的碱基组成成病毒基因病毒基因组结构相构相对简单，基因数少，所含信息，基因数少，所含信息量少，不同病毒的基因量少，不

49、同病毒的基因组大小有大小有较大差异。大差异。 2.基因基因组核酸核酸类型型 双双链DNA；单链DNA 双双链RNA；单链RNA 环状分子；状分子；线性分子性分子什么是正什么是正链病毒？什么是病毒？什么是负链病毒？病毒？ 如果基因如果基因组序列与序列与mRNA相同，称相同，称为正正链DNA(+DNA)或正或正链RNA(+RNA)病毒。病毒。 如果与如果与mRNA互互补，则称称为负链DNA(-DNA)或或负链RNA(-RNA)病毒。病毒。单链正正链RNA病毒基因病毒基因组可直接作可直接作为模板功能，模板功能，翻翻译出所出所编码的蛋白的蛋白质，并复制出病毒核酸，自，并复制出病毒核酸，自我我组装成装成

50、为成熟的病毒成熟的病毒颗粒，感染宿主粒，感染宿主细胞。胞。单链负链RNA病毒基因病毒基因组不能直接作不能直接作为模板功能，模板功能，先以基因先以基因组RNA为模板模板转录生成互生成互补RNA，然后，然后以以这个互个互补的的RNA为模板，翻模板，翻译出所出所编码的蛋白的蛋白质。 3.基因基因组中有基因重叠中有基因重叠现象象这种种结构的意构的意义在于使在于使较小的基因小的基因组能携能携带较多的多的遗传信息，使病毒利用有限的基因，信息，使病毒利用有限的基因，编码更多的蛋白更多的蛋白质。 4.基因基因组中具有操中具有操纵子子结构构 噬菌体噬菌体174是是单链DNA病毒，含病毒，含A、A*、B、C、D、

51、E、F、G、H、J及及K共共11个蛋白个蛋白质基因基因，但，但这些基因却只能些基因却只能转录成成3个个mRNA，其中一个从，其中一个从A基因开始，一个从基因开始，一个从B基因开始，另一基因开始，另一个从个从D基因开始。基因开始。1.DNA病毒基因病毒基因组:以双以双链DNA为常常见 2.转录模板：模板：DNA病毒的基因病毒的基因组中，不同基因可以不同中，不同基因可以不同的的链作作为转录模板模板3.细胞核内复制：胞核内复制：几乎所有真核几乎所有真核DNA病毒都是在活宿主病毒都是在活宿主细胞核内复制胞核内复制 4 .致病性：致病性：较大的双大的双链DNA病毒可引起多种病毒可引起多种严重疾病，重疾病

52、，而而较小的小的DNA病毒会在宿主体内病毒会在宿主体内诱发肿瘤。瘤。（二）（二）DNA病毒病毒5有的有的DNA病毒不能直接通病毒不能直接通过DNA复制复制过程程进行基因行基因组复制复制： 必必须先先转录出一个出一个RNA中中间体（前基因体（前基因组），然后通，然后通过逆逆转录过程才能完成基因程才能完成基因组复制复制(HBV)。6DNA病毒一般比病毒一般比RNA病毒大，生活周期病毒大，生活周期较复复杂。腺病毒基因腺病毒基因组 乙型肝炎病毒基因乙型肝炎病毒基因组基因基因组长3.2kb，是，是带有部有部分分单链区的区的环状双状双链 DNA分分 子，两条子，两条链长度度不等。不等。长链为负链：L(-)

53、 长度固定，携度固定，携带有病毒全有病毒全部的部的编码信息。信息。短短链为正正链：S(+) 长度不等，度不等，约1.6kb-2.8kb。（一）基因（一）基因组的一般特点的一般特点（二）几种典型的（二）几种典型的RNA病毒病毒（三）（三）RNA病毒病毒1.单链或双或双链，但以，但以单链RNA为多多见 2.所携所携带的的遗传信息一般都在同一条信息一般都在同一条链上，因此病毒上，因此病毒RNA链有正有正负之分之分 3.许多哺乳多哺乳类逆逆转录病毒属于病毒属于单正正链双体双体RNA，含有，含有2个相同的个相同的()RNA，属于双倍体，属于双倍体 4.RNA病毒病毒变异率很高，平均每异率很高，平均每10

54、3-104个个bp中有一个突中有一个突变 5.RNA病毒的复制和病毒的复制和转录常常独立于宿主常常独立于宿主细胞核胞核 6.尽管不同尽管不同RNA病毒的复制方式不相同，但均需病毒的复制方式不相同，但均需经逆逆转录完成其基完成其基因因组的复制的复制 （一）基因（一）基因组的一般特点的一般特点丙型肝炎病毒基因丙型肝炎病毒基因组病毒呈球型病毒呈球型颗粒，直径粒，直径约50nm，有脂有脂质包膜包膜 基因基因组为单链正正链RNA病毒，病毒，链长约9.5kb 整个基因整个基因组只有一个只有一个ORF，编码3011或或3010个氨基酸个氨基酸 人人类免疫缺陷病毒基因免疫缺陷病毒基因组 人人类免疫缺陷病毒是免

55、疫缺陷病毒是获得性得性免疫缺陷免疫缺陷综合征（合征（AIDS）的病原体，属于的病原体，属于逆逆转录病毒病毒由由2条相同的正条相同的正链RNA在在5端通端通过氢键互相互相连接形成二接形成二聚体聚体 单链RNA含含9749个核苷酸，个核苷酸，共有共有9个基因：个基因： 3个个为结构基因（构基因（gag、pol、env），），6个个为调控基因控基因（tat、rev、nef、vif、vpr、vpu）三、人三、人类基因基因组 细胞核基因胞核基因组 细胞胞质基因基因组（线粒体基因粒体基因组）1.单一序列一序列2.重复序列重复序列 a.串串联重复序列重复序列 b .散在重复序列散在重复序列 3.多基因家族与

56、假基因多基因家族与假基因（一）基因（一）基因组结构特征构特征Introns are removed to make mRNA from an interrupted geneRNA synthesisSplicing remove intronsProtein synthesismRNA串串联重复序列重复序列重复重复频率可达率可达106以上以上在基因在基因组中所占比例随种属而异，中所占比例随种属而异，约占占10%-60,在人在人类基因基因组中中约占占20复复杂度低度低,复性速率快复性速率快卫星星DNA（satellite DNA）大小不一，成串排列大小不一，成串排列 碱基序列不同于其他部份，等

57、密度梯度离心可将碱基序列不同于其他部份，等密度梯度离心可将其与主体其与主体DNA分开分开 小小卫星星DNA微微卫星星DNADNA指指纹用于罪犯用于罪犯识别DNA指指纹用于用于亲子子鉴定定3.多基因家族与假基因多基因家族与假基因多基因家族（多基因家族（multi gene family） 由某一祖先基因由某一祖先基因经过重复和重复和变异所异所产生的一生的一组基基因。因。 假基因（假基因（pseudogene） 多基因家族中不多基因家族中不产生有功能的基因生有功能的基因产物的某些成物的某些成员,用用 表示。表示。多基因家族的特点：多基因家族的特点： 多基因家族的成多基因家族的成员可以可以串串联排列

58、在一起排列在一起，形成基，形成基因簇因簇(gene cluster)或串或串联重复基因，如重复基因，如rRNA、tRNA和和组蛋白的基因；蛋白的基因；有些多基因家族的成有些多基因家族的成员也可也可位于不同的染色体上位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；如珠蛋白基因；有些成有些成员不不产生有功能的基因生有功能的基因产物物，这种基因称种基因称为假基因假基因 (Pseudogene) （二）人（二）人类基因基因组多多态性性3.单核苷酸多核苷酸多态性性（single nucleotide polymorphism，SNP） 4.拷拷贝数多数多态性性1.限制性片段限制性片段长度多度多态性性（restrict

59、ion fragment length polymorphism，RFLP）2.微微卫星和小星和小卫星多星多态性性1.限制性片段限制性片段长度多度多态性性 多多态性出性出现在限制性核酸内切在限制性核酸内切酶酶的的酶酶切位点序切位点序列中，用某个内切列中，用某个内切酶酶水解基因水解基因组的某段序列的某段序列时，在同种的不同个体之在同种的不同个体之间该段序列可能被段序列可能被酶酶解成解成长短不等的几个短不等的几个DNA片段。片段。这段序列在段序列在该种生物的种生物的群体中形成多群体中形成多态性。性。限制性核酸内切限制性核酸内切酶片段片段长度多度多态性性3.单核苷酸多核苷酸多态性性 单个核苷酸的个核

60、苷酸的变异，人群中个体差异最具异，人群中个体差异最具代表性的代表性的DNA多多态性性 人人类基因基因组中每中每1kb就有一个就有一个SNP位点位点,共共约300万个万个 变异的异的4种形式种形式 三种三种颠换：C A（G T） C G（G C） T A（A T）一种一种转换：C T（G A）转换的的频率是率是颠换的的3倍，因此倍，因此转换是是SNP发生的生的主要原因。主要原因。第四第四节 核酸分子核酸分子标志物志物 基因突基因突基因突基因突变变、基因多、基因多、基因多、基因多态态性位点、等位基因等分子生物性位点、等位基因等分子生物性位点、等位基因等分子生物性位点、等位基因等分子生物学学学学检验检验的具体内容的具体内容的具体内容的具体内容统统称称称称为为核酸分子核酸分子核酸分子核酸分子标标志物志物志物志物一、核酸分子一、核酸分子标志物的分志物的分类二、分子二、分子标志物的未来志物的未来发展展一、核酸分子一、核酸分子标志物的分志物的分类（一）基因突（一）基因突变（二）基因多（二）基因多态性位点性位点（三）等位基因（三）等位基因（四）（四）RNA（五）（五） 线粒体粒体DNA（六）病原生物基因（六）病原生物基因组（七）（七） 循循环核酸核酸思考思考题：原核生物基因原核生物基因组和真核生物基因和真核生物基因组有什么有什么区区别？