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1、专题专题5DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题1DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定课题目标课题目标 目标目标:1本课题通过尝试对植物或动物组织中的本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，的物理化学性质，2理解理解DNA粗提取以及粗提取以及DNA鉴定的原理。鉴定的原理。课题重点：课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。的粗提取和鉴定方法。知识要点：知识要点：1.DNA的物理化学性质，尤其是的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性的溶解性2.二苯胺法鉴定二苯胺法鉴定DNA的方法和原理的方法和原理。基础知识基础知识1、提取大分子的基本思路是什么？提取大
2、分子的基本思路是什么？选用一定的选用一定的物理物理、化学化学方法分离方法分离具有不同物具有不同物理或化学性质的大分子理或化学性质的大分子。2、提取提取DNA分子的基本思路又是什么？分子的基本思路又是什么？利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂质、蛋白质和脂质等在物理和化等在物理和化学性质上的差异，提取学性质上的差异，提取DNADNA，去除其他成分。，去除其他成分。3、提取和鉴定提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？的具体的依据有哪些方面？(原理原理)1）、）、DNA的溶解性的溶解性 DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶溶液中溶解度不同。液中溶
3、解度不同。 1、在什么浓度下，、在什么浓度下，DNA的溶解的溶解度最小？度最小？DNA在在Nacl 溶液中的溶液中的溶解度是如何变化的？溶解度是如何变化的？在在NaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 mol/L时，时，DNA的溶解度随的溶解度随NaCl溶液溶液浓度的增加而逐渐降低；在浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，时，DNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。的溶解度又逐渐增大。 2 2、如何通过控制、如何通过控制NaClNaCl溶液的浓度使溶液的浓度使DNADNA在盐在盐溶液中溶解或析出？溶液中溶解或析出？
4、当氯化钠的物质的量浓度为当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，时，DNA的溶解度最大，浓度为的溶解度最大，浓度为 014 molL时，时，DNA的溶解度最低。利用这一的溶解度最低。利用这一原理，可以使原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出在盐溶液中溶解或析出3、提取和鉴定提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？的具体的依据有哪些方面？1）DNA的溶解性的溶解性 DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶溶液中溶解度不同。液中溶解度不同。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精白质则溶于酒精2）、）、DNA对
5、酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶只能使蛋白质水解蛋白酶只能使蛋白质水解大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60806080的高温而变性，但的高温而变性，但DNADNA在在80 80 以上才变性。以上才变性。洗涤剂能瓦解细胞膜，洗涤剂能瓦解细胞膜，但对但对DNADNA没有影响。没有影响。3、DNA的鉴定的鉴定沸水浴沸水浴下，下，DNADNA遇遇二苯胺二苯胺被染成被染成蓝色蓝色；二苯胺鉴定二苯胺鉴定DNA的化学原理：的化学原理：DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基羟基-酮酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色基戊醛，它再和二苯胺作用
6、而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少含量的多少有关。有关。紫外灯照射法：紫外灯照射法： 紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的的溴化溴化乙锭乙锭(EB)溶液，溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴纸上，再滴1滴滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射下照射(暗室中暗室中)，可呈现，可呈现橙红色的萤光橙红色的萤光(DNA的紫的紫外吸收高峰在外吸收高峰在260nm处处)。甲基绿甲基绿 （蓝绿色）（蓝
7、绿色）实验设计实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液的滤液（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质（四）（四）DNA的析出与鉴定的析出与鉴定实验设计实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取含有含有DNA的组织且的组织且DNA含量较多的组织。含量较多的组织。比较下列材料哪些比较下列材料哪些DNA含量高、适于提取含量高、适于提取DNA？为什么？为什么？。 较好的实验材料应该满足以下几个条件较好的实验材料应该满足以下几个条件：1组织中组织中DNA的含量比较丰富的含量比较丰富,能够适合大量提取。能够适合大量提取。2该组织中所
8、含化合物种类应比较单纯该组织中所含化合物种类应比较单纯,避免由于其他避免由于其他物质化学性质与物质化学性质与DNA相近，从而对实验现象产生某相近，从而对实验现象产生某些干扰。些干扰。3实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本。实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本。4实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单的条件下能大量提取出的条件下能大量提取出DNA，便于学生实验操作，便于学生实验操作（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液的滤液1、动物细胞：蒸馏水、动物细胞：蒸馏水搅拌搅拌1、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？、
9、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的细胞膜和核膜的破裂破裂)，从而释放出，从而释放出DNA。 旁栏问题旁栏问题（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液的滤液1、动物细胞：蒸馏水、动物细胞：蒸馏水搅拌搅拌2、植物细胞：洗涤剂和食盐、植物细胞：洗涤剂和食盐搅拌和研磨搅拌和研磨若探究提取效果，可设置对照实验若探究提取效果，可设置
10、对照实验。2、加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？、加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，能溶解细胞膜，有利于有利于DNA的释放；食盐的主要成分是的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于，有利于DNA的溶解。的溶解。 旁栏问题旁栏问题3如果研磨不充分，会对实验结果产生如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？怎样的影响？ 研磨不充分会使细胞核内的研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完释放不完全，提取的全，提取的DNA量变少，影响实验结果，量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝
11、色等。显示蓝色等。旁栏问题旁栏问题4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？胞成分？ 可能含有核蛋白、多糖和可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。等杂质。（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质方案一：方案一：DNA在不同浓度在不同浓度NaCl中溶解度不同中溶解度不同；实验设计实验设计旁栏问题旁栏问题5为什么反复地溶解与析出为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？，能够去除杂质？ 用高盐浓度的溶液溶解用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解析出，能除去溶解在低盐
12、溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。溶解度不同的多种杂质。（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质方案一：方案一：DNA在不同浓度在不同浓度NaCl中溶解度不同中溶解度不同；方案二：方案二：加入嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）加入嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）方案三：方案三：6075恒温水浴保温恒温水浴保温1015min实验设计实验设计旁栏问题旁栏问题6方案二与方案三的原理有什么不同？方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取
13、的DNA与蛋白质分开；与蛋白质分开；方案三利用的是方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。分离。（四）（四）DNA的析出与鉴定：的析出与鉴定：95%的冷酒精的冷酒精静置静置23min，出现白色丝状物，出现白色丝状物玻璃棒卷起玻璃棒卷起加入加入2mol/L氯化钠溶解，氯化钠溶解，加入加入4mL二苯胺试剂，摇匀，二苯胺试剂，摇匀，沸水沸水浴浴5min，观察颜色变化。，观察颜色变化。（注意设置空白对照）（注意设置空白对照）实验设计实验设计使用使用冷的乙醇溶液具哪些优点？冷的乙醇溶液具哪些优点？一、抑制核酸水解酶活
14、性，防止一、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；降解；二、降低分子运动，易于形成沉淀析出；二、降低分子运动，易于形成沉淀析出；三、低温有利于增加三、低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少分子柔韧性，减少断裂。断裂。P56操作提示操作提示1、血液应加入柠檬酸钠（抗凝剂）防止血、血液应加入柠檬酸钠（抗凝剂）防止血液凝固；液凝固；2、加洗涤剂，动作要轻缓，防止产生大量、加洗涤剂，动作要轻缓，防止产生大量气泡；气泡；加酒精、玻棒搅拌，动作要轻缓，以免加酒精、玻棒搅拌，动作要轻缓，以免加剧加剧DNA分子的断裂。分子的断裂。3、二苯胺试剂现配现用。、二苯胺试剂现配现用。结果分析与评价结果分析与评价（一）是否
15、提取出了（一）是否提取出了DNA观察你提取的观察你提取的DNADNA颜色，如果不是白色颜色，如果不是白色丝状物，说明丝状物，说明DNADNA中的杂质较多；二苯胺鉴中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的现蓝色，可能所提取的DNADNA含量低，或是实含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。验操作中出现错误，需要重新制备。结果分析与评价结果分析与评价（二）分析二）分析DNA中的杂质中的杂质本实验提取的本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。蛋白、多糖等杂质。（三）不同实验方法的比
16、较（三）不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如实验结果，如DNA的纯度、的纯度、DNA的颜色、二苯胺的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。法的效果更好。练习练习提取提取DNA的第一步是材料的选取的第一步是材料的选取，其目的是一，其目的是一定要选取定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由含
17、量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；难；第二步是第二步是DNA的释放和溶解的释放和溶解，这一步是实，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；全部溶解；第三步是第三步是DNA的纯化，的纯化，即根据即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将性，最大限度地将DNA与杂质分开；与杂质分开；最后一步最后一步是对是对DNA进行鉴定进行鉴定，这是对整个实验的结果的，这是对整个实验的结果的检测。检测。1、请解释提取
18、、请解释提取DNA的实验操作中主要的实验操作中主要 步骤的目的。步骤的目的。练习练习提取蛋白质比提取提取蛋白质比提取DNA的难度大的难度大。这是。这是因为，与因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐相比，蛋白质对温度、盐浓度、浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。的方法。 2、你认为从细胞中提取某种
19、特定的蛋白质与、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取提取DNA一样容易吗？为什么？一样容易吗？为什么？案例一：以鸡血为实验材料进行案例一：以鸡血为实验材料进行DNADNA的粗提取的粗提取实验案例实验案例鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长较高，操作繁琐，历时较长1 1、鸡血细胞做实验材料的原因、鸡血细胞做实验材料的原因鸡血细胞核的鸡血细胞核的DNADNA含量丰富，材料易得含量丰富，材料易得2 2、实验原理、实验原理 DNA DNA在在NaClNaC
20、l溶液中的溶解度，是随着溶液中的溶解度，是随着NaClNaCl的浓的浓度的变化而改变的。当度的变化而改变的。当NaClNaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为0.14 mol0.14 molL L时时,DNA,DNA的溶解度最低。利用这一原理，的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在可以使溶解在NaClNaCl溶液中的溶液中的DNADNA析出。析出。 DNA DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的步提取出含杂质较少的DNADNA。 DNA DNA遇二苯
21、胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂。的试剂。4 4、课前准备鸡血细胞液、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为取质量浓度为0 01g/ml1g/ml的的柠檬酸纳溶液（抗凝柠檬酸纳溶液（抗凝剂）剂）100ml100ml，置于，置于500ml500ml烧杯中。注入新鲜的鸡烧杯中。注入新鲜的鸡血（约血（约180ml180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行的血液置于冰箱内，精置
22、一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min1000r/min（转每分）的离心机离心（转每分）的离心机离心2min2min，血细，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）过程过程柠檬酸钠作用柠檬酸钠作用防止血液凝固防止血液凝固作用机理作用机理柠檬酸钠能与血浆中的柠檬酸钠能与血浆中的CaCa2+2+发生反应，生成柠檬发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的酸钙络合物，血浆中游离的CaCa2+2+大大减少，
23、血液大大减少，血液就不会凝固就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的鸡血细胞破碎以后释放出的DNADNA，容易被玻璃容，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少器吸附，所以在提取过程中为了减少DNADNA的损失，的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液注意事项注意事项讨论：提取鸡血中的讨论：提取鸡血中的DNADNA时，为什么时，为什么除去血液除去血液中的上清液？中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆是血细胞，离心后除去的上清液是血浆5 5、方法步骤、方法步骤 将制备
24、好的鸡血细胞液将制备好的鸡血细胞液5 mL5 mL10mL10mL，注入到，注入到50 50 mLmL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL20 mL，同时用，同时用玻璃棒玻璃棒充分搅拌充分搅拌5 min5 min，使血细胞加速破裂。使血细胞加速破裂。然然后，用放有后，用放有纱布的漏斗纱布的漏斗将血细胞液过滤至将血细胞液过滤至500mL500mL。取其滤液。取其滤液。提取鸡血细胞的细胞核物质提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破会吸水以至胀破（1 1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏
25、水后细胞）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？会有什么变化？（2 2）用玻璃棒搅拌有什么意义？）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎太快太猛，防止打碎DNADNA（3 3）滤去的是什么物质？）滤去的是什么物质？得到的是什么？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNADNA溶解细胞核内的溶解细胞核内
26、的DNADNA将氯化钠的物质的量浓度为将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol 2 mol的溶的溶40mL40mL加加入到滤液中，并用入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌玻璃棒沿一个方向搅拌1min1min，使其混合均匀，这时，使其混合均匀，这时DNADNA在溶液中呈溶解状态在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停玻璃棒不停地轻轻搅拌，地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时出现的粘稠物会越
27、来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于浓度相当于0.14 mol0.14 molL L）析出含析出含DNADNA的粘稠物的粘稠物讨论：加入蒸馏水的目的？讨论：加入蒸馏水的目的？降低降低NaClNaCl溶液浓度到使溶液浓度到使DNADNA溶解度最低点，使溶解度最低点，使DNADNA从从NaClNaCl溶液中析出溶液中析出将溶液中的将溶液中的DNADNA与其他杂质分离，这一步骤是实与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均
28、匀搅拌，以水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于利于DNADNA分子的附着和缠绕分子的附着和缠绕注意事项：注意事项：滤取含滤取含DNADNA的粘稠物的粘稠物用放有用放有多层纱布多层纱布的漏斗，过滤步骤的漏斗，过滤步骤3 3中的溶液中的溶液至至 500mL 500mL的烧杯中，含的烧杯中，含 DNA DNA的的粘稠物被留在纱粘稠物被留在纱布上布上将将DNADNA的粘稠物再溶解的粘稠物再溶解取取 1 1个个 50 mL 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为的量浓度为 2 mol 2 molL L的溶液的溶液 20mL 20mL。用钝头镊子。用钝头镊
29、子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择用玻璃择不停地搅拌，不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中过滤含有过滤含有DNADNA的氯化钠溶液的氯化钠溶液取取1 1个个100 mL100 mL烧杯，用放有烧杯，用放有两层纱布两层纱布的漏斗过的漏斗过滤步骤滤步骤5 5中的溶液。取其滤液，中的溶液。取其滤液，DNADNA溶于滤液溶于滤液中中提取含杂质较少的提取含杂质较少的DNADNA在上述滤过的溶液中，加入在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积冷却的、酒精的体积分数为分数为 95 95的溶液的溶液 50mL 50mL（使用冷却
30、的酒精，对（使用冷却的酒精，对DNADNA的凝集效果较佳），并用的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，玻璃棒搅拌，溶液溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是的主要成分就是DNADNA答：因为答：因为DNADNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的解在酒精中，使含杂质较少的DNADNA丝状物可以析丝状物可以析出出, ,悬浮于溶液中悬浮于溶液中讨论：讨论：（2 2）观察丝状物呈什么颜色？）观察丝状物呈什么颜
31、色？答：白色答：白色（1 1）为什么要加）为什么要加50mL50mL的冷酒精？的冷酒精？取两支取两支20 mL20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为浓度为0 0015 mol015 molL L的溶液的溶液5 mL5 mL，将丝状物放，将丝状物放入其中一支试管中，入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入解。然后，向两支试管中各加入4mlL4mlL的二苯胺试的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液，
32、待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化颜色的变化 DNA DNA的鉴定的鉴定讨论：讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色原来颜色（2 2）这一鉴定结果说明什么问题？）这一鉴定结果说明什么问题？（1 1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是答：提取出的丝状物是DNADNA（3 3） DNA DNA的直径约为的直径约为2010-10 m2010-10 m，实验中出现，实验中出现的丝状物的粗细是否表示的丝状物的粗细是否表示1 1个个DNADNA分子直径的大小分子直径的大小？答
33、：答： DNA DNA分子直径只有分子直径只有2 nm2 nm。丝状物是多个。丝状物是多个DNADNA子聚在一起形成的子聚在一起形成的 答答：整整个个实实验验共共“两两次次蒸蒸馏馏水水，三三次次过过滤滤，两两次析出，六次搅拌次析出，六次搅拌”6 6、讨论：、讨论：两次蒸馏水两次蒸馏水第一次：第一次：细胞吸水胀破细胞吸水胀破 第一步第一步第二次：使第二次：使 DNA DNA黏稠物析出黏稠物析出 第三步第三步（1 1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？两次析出两次析出第一次：用第一次
34、：用0.14 mol0.14 molL L 的的NaCINaCI溶溶液含杂质多液含杂质多第三步第三步第二次：用冷却的第二次：用冷却的9595的酒精的酒精第七步第七步六次搅拌：第一、二、三、五、七步六次搅拌：第一、二、三、五、七步 其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNADNA方法步骤方法步骤 加入物质加入物质 目的目的 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 3.溶解
35、细胞核内的DNA 2 m1L 的NaCI溶液40mL 4.析出含DNA的黏稠物 蒸馏水 5.滤取含DNA的黏稠物 6.将DNA的黏稠物再溶解 2 molL 的NaCl溶液20 mL 7.过滤含DNA的NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的 DNA 冷却的95的酒精50 mL A:(1)向试管中加入0.015 molL 的NaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺试剂 9.DNA的鉴定 B:(1)向试管中加入0.015molL 的NaCl溶液5mL (2)4 mL 二苯胺试剂 以鸡血为实验材料进行以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取的粗提取案例二案例二以菜花为实验材料进行以菜花为实
36、验材料进行DNA的粗提取的粗提取课前准备课前准备将新鲜菜花和体积分数为将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶的乙醇溶液放入冰箱冷冻室液放入冰箱冷冻室24h。提取提取DNA的具体步骤的具体步骤1.取材取材称取称取30g菜花，去梗取花，切碎。菜花，去梗取花，切碎。2.研磨研磨将碎菜花放入研钵中，倒入将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，研磨液，充分研磨充分研磨10min。研磨液的配制方法如下。将研磨液的配制方法如下。将10.1gTris加入到加入到50mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用蒸馏水中，使其溶解，然后，用2moL/L的的HCl溶液调节溶液调节pH至至8.0，再加入，再加入8.76gNaCl、3
37、7.2gEDTA、20gSDS。待上述药品全部溶解。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至后，再用蒸馏水定容至1000mL。教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一些去污剂，使植物细胞膜破碎，释放些去污剂，使植物细胞膜破碎，释放DNA。学生可以设置对照实验，比较哪。学生可以设置对照实验，比较哪一种方法可以提取到纯度更高的一种方法可以提取到纯度更高的DNA。一般实验室提取高纯度的一般实验室提取高纯度的DNA都采用一都采用一种阳离子去污剂种阳离子去污剂十六烷三甲基溴化铵十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破碎，同时将分离缓冲液，使细胞膜破碎，同时将DNA与植物中多糖等
38、杂质分开，再用氯与植物中多糖等杂质分开，再用氯仿仿异丙醇混合液（体积比为异丙醇混合液（体积比为24 1）抽）抽提去除杂质蛋白，得到高纯度的提去除杂质蛋白，得到高纯度的DNA。3.过滤过滤在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用料离心管中进行离心，用1000r/min的转速，的转速，离心离心25min，取上清液放入烧杯中，取上清液放入烧杯中)。在。在4冰箱中放置几分钟后，再取上清液。冰箱中放置几分钟后，再取上清液。4.沉淀沉淀将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体将一倍体积
39、的上清液倒入两倍体积的体积分数为积分数为95的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧玻璃棒不要直插到烧杯底部杯底部)。沉淀。沉淀35min后，可见白色的后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上。绕在玻璃棒上。参考资料参考资料 研磨液中几种药品的作用研磨液中几种药品的作用Tris/HCl:提供缓冲体系，提供缓冲体系，DNA在这一体系在这一体系中呈稳定态（中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。为三羟甲基氨基甲烷）。EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解酶降解DNA。SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与变性，与DNA分离。分离。
