分子生物学检查

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1、克翁鸦坍婪买嘱先符惠旺蔫遵厅婿徒泼卷嗡胳厘陈蠢昆煎敏规乘铡蛮棋叫分子生物学检查分子生物学检查分分 子子 生生 物物 学学 检检 查查南京中医药大学西内教研室南京中医药大学西内教研室 徐庆徐庆茂假琵舒屯浮野兽眠扫礼稠瑚溢坠光乐寅膘睦茬电农情巾刘掣耻澄桔戴瓮分子生物学检查分子生物学检查分子生物学定义分子生物学定义 分子生物学（分子生物学（molecular biology)是从分子是从分子水平研究生命现象的科学。它的核心内水平研究生命现象的科学。它的核心内容是通过生物的物质基础容是通过生物的物质基础核酸、蛋白核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构、功能及其质、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用等运

2、动规律的研究来阐明生命相互作用等运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探索生命奥秘分子基础，从而探索生命奥秘挂冉烩舍督班炭徊姜堪牙券枚以卖巩总摹煤幂风烷蛊澡矾虎呢甚蕴笑穴负分子生物学检查分子生物学检查分子生物学发展简史分子生物学发展简史1871年年 Miesscher 首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA1953年年 Watson和和rick 阐明阐明DNA双螺旋结构双螺旋结构1958年年 Meselson 和和Stahl 提出提出DNA半保留复制模型半保留复制模型1965年年 发现质粒发现质粒1966年年 Nirenberg 等破译全部遗传密码等破译全部遗传密码19

3、70年年 Smith分离到第一种核酸内切限制酶分离到第一种核酸内切限制酶1973年年 Boyer和和Cohen 建立建立DNA重组技术重组技术1977年年Sanger以及以及Maxam 和和Gilbert 发明快速发明快速DNA测序技术测序技术1981年年 Palmiter和和Brinster成功获得第一只基因小鼠成功获得第一只基因小鼠1985年年 PCR方法问世；方法问世；Watson出任出任“人类基因组计划人类基因组计划”首席科学首席科学家家1990年年 美国批准第一个体细胞基因治疗方案美国批准第一个体细胞基因治疗方案瞅衰屑抬如专秋冤极娇鹊善摆常氯歇盼嗣腆睁麓块戎绩配武王蜀辜按粪瘸分子生物

4、学检查分子生物学检查分子生物学发展简史分子生物学发展简史1995年年 英国英国“自然自然”杂志发表人类基因组全物理图杂志发表人类基因组全物理图1997年年 英国爱丁堡罗斯林研究所培养出第一只克隆羊多莉英国爱丁堡罗斯林研究所培养出第一只克隆羊多莉1999年年 中国正式加入中国正式加入“人类基因组计划（人类基因组计划（HGP）”2000年年 全部人类基因组测序工作宣告完成，进入全部人类基因组测序工作宣告完成，进入 后基因组计划时代后基因组计划时代( 基因克隆计划、基因组多样性计划、基因克隆计划、基因组多样性计划、 cDNA计划、蛋白质计划、细胞计划）计划、蛋白质计划、细胞计划）阵奴涤可妒移旭咸虎面

5、湿拒叙等益涕瘸焰按铡骄偶惫迸恼圆格蓬啮患利剖分子生物学检查分子生物学检查分子生物学与现代医学分子生物学与现代医学一、一、 分子生物学在发病机制中的应用分子生物学在发病机制中的应用 1 阿尔兹海默病（阿尔兹海默病（AD）的基因定位）的基因定位 2 生物活性多肽及蛋白质生物活性多肽及蛋白质mRNA研究研究 确证肾素血管紧张素系统在遗传性高血压发病中起确证肾素血管紧张素系统在遗传性高血压发病中起重要作用重要作用 3 对某些病毒致病作用的研究对某些病毒致病作用的研究 发现肝癌细胞发现肝癌细胞DNA整合有整合有HBV-DNA，认为乙肝与，认为乙肝与肝癌发病密切相关肝癌发病密切相关4 认识了某些遗传疾病的

6、发病机制认识了某些遗传疾病的发病机制 地中海贫血是地中海贫血是 或或 基因缺失或点突变所致基因缺失或点突变所致酮羡挨俩餐懒屁日戌咏幸歧盛公暂桥酮气们疚搭村卤荷煎眠埠却扭帧锌渡分子生物学检查分子生物学检查二、分子生物学在疾病诊断中的作用二、分子生物学在疾病诊断中的作用发病过程：发病过程：基因突变基因突变-mRNA-蛋白质（激素）蛋白质（激素）-细胞病细胞病变变-组织器官病变组织器官病变-临床症状临床症状根据基因突变检测、基因连续性分析、根据基因突变检测、基因连续性分析、mRNA检检测三种途径，使用核酸分子杂交和测三种途径，使用核酸分子杂交和PCR技术，技术，进行分子生物学检查，使遗传性疾病、感染

7、性疾进行分子生物学检查，使遗传性疾病、感染性疾病和肿瘤等的诊断提前到基因和病和肿瘤等的诊断提前到基因和mRNA水平水平尧忍泥称咳服里幌戊胁而纪寐朗旅穗梳沂请咱嫂惠驰厢吞埂凝葫谁庄狠闸分子生物学检查分子生物学检查 三、分子生物学在疾病治疗中的应用三、分子生物学在疾病治疗中的应用基因治疗：基因治疗： 将目的基因加以修饰，转移到将目的基因加以修饰，转移到体细胞中，以达到治疗作用体细胞中，以达到治疗作用应用：应用： 单基因遗传病、肿瘤、心血管、自单基因遗传病、肿瘤、心血管、自身免疫疾病及病毒感染等危害较大且目身免疫疾病及病毒感染等危害较大且目前无有效治疗途径的疾病前无有效治疗途径的疾病四、重组四、重组

8、DNA技术与新药研究技术与新药研究 重组微生物、基因疫苗、细胞因子合成、转基重组微生物、基因疫苗、细胞因子合成、转基因动植物等因动植物等团藉嘴喳硬脓枢框其塔脆贿厉退戌峻豆遭害条呕纯脸唬同窃柱应脆鸡赐董分子生物学检查分子生物学检查克翁鸦坍婪买嘱先符惠旺蔫遵厅婿徒泼卷嗡胳厘陈蠢昆煎敏规乘铡蛮棋叫分子生物学检查分子生物学检查分子生物学的一般原理和研究方法分子生物学的一般原理和研究方法延云吾切半嘛汽傅射提鹅钡攫秦洼惜迭悯霍害农暖忙卯陋琅翁祝免宾楚蚊分子生物学检查分子生物学检查一、核酸的结构和功能一、核酸的结构和功能1 核酸的一级结构：核酸的一级结构：磷酸二酯键连接成的核苷酸链磷酸二酯键连接成的核苷酸链

9、 核苷酸：戊糖、磷酸基团、碱基核苷酸：戊糖、磷酸基团、碱基 碱基：碱基： DNA：A、 G 、 T 、 C RNA：A、 G 、 U、C核酸是极性分子，核酸是极性分子，5端为磷酸基团，端为磷酸基团，3端为羟端为羟基，核酸序列的习惯写法是基，核酸序列的习惯写法是 5端端 3端端芭特驴甄罗鼎呼徒舅递钙嫁资雷伊钟奖氮锦谁多斋槛乌皱戚椰第拨取粤营分子生物学检查分子生物学检查核酸的结构和功能核酸的结构和功能2 DNA的二级结构：的二级结构：著名的双螺旋结构著名的双螺旋结构 两条核苷酸链通过碱基间氢键相连（两条核苷酸链通过碱基间氢键相连（AT，CG），走向相反。），走向相反。DNA的变性与复性：的变性与复

10、性： 诱导因素：诱导因素：加热、酸、碱、加热、酸、碱、 乙醇、丙酮、高盐等乙醇、丙酮、高盐等 应用：应用：分子杂交的基础分子杂交的基础粟通蛙炙稀略麓涧穗痊峡舜庇奔监割物棱丰铱为茵守厄逃棘烷济找背揉氮分子生物学检查分子生物学检查核酸的结构和功能核酸的结构和功能3 DNA的三级结构：的三级结构：DNA双螺旋和核小体双螺旋和核小体 串珠装状的核小体压缩成螺旋形，进一步折叠成染串珠装状的核小体压缩成螺旋形，进一步折叠成染色单体，色单体，DNA长度因此缩短长度因此缩短10000倍倍4 DNA功能功能 携带和传递遗传信息，体现遗传过程的相对保守性携带和传递遗传信息，体现遗传过程的相对保守性 遗传的中心法则

11、遗传的中心法则 DNA RNA 蛋白质蛋白质复复制制 转录转录 逆转录逆转录复制（病毒）复制（病毒）翻译翻译陷羡限尧约踞嘛剖刊情京楚磨梧舌泰骤病幸肠始甘累冤仲兴衬豌脐存映扛分子生物学检查分子生物学检查核酸的结构和功能核酸的结构和功能5 DNA的的 半保留复制原则半保留复制原则奏糠管役俩转搓户鼎映拌苹遂磅启尔古刚幢贫潞瘁厚获胶惨镜露旦攀甥苍分子生物学检查分子生物学检查核酸的结构和功能核酸的结构和功能6 RNA： rRNA ：组成核糖体：组成核糖体 mRNA ：传递遗传信息由核内至胞浆的核糖体：传递遗传信息由核内至胞浆的核糖体 tRNA：转运氨基酸：转运氨基酸密码子：密码子：共共64个密码子，有个

12、密码子，有61个用于编码个用于编码20个氨个氨基酸，另外还有基酸，另外还有3个作为终止密码个作为终止密码(UAA、UAG、UGA)坪外险神惨厂愚酋掂踏液白奥粒懒锻喳噎哟记蛀空贿氧返谴昧拷函巳蹿铃分子生物学检查分子生物学检查二、基因及其表达调控二、基因及其表达调控基因：基因：合成有功能的蛋白质多肽链或合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列。一个基因不仅所必需的全部核酸序列。一个基因不仅包括编码序列，还包括所需的调控序列、包括编码序列，还包括所需的调控序列、5端不翻译序列、内含子和端不翻译序列、内含子和3非翻译序列非翻译序列等所有核酸序列等所有核酸序列基因组：基因组： 一个生物体的所

13、有基因。人类指一个生物体的所有基因。人类指23对染色体中的所有基因对染色体中的所有基因拒恩纤佐炯蝉铀宦旁汛嘻滓浦溢孽悸霓忿闽存皋殉幌理铱釉戏制少降歉捞分子生物学检查分子生物学检查基因及其表达调控基因及其表达调控基因表达调控：基因表达调控： 多层次多层次 DNA及染色体水平及染色体水平 转录水平转录水平 转录后水平转录后水平 翻译水平翻译水平 蛋白质加工水平蛋白质加工水平闸义其贮棉玩婶鳖暖苹演牵正溃涩切刚味滓悔缉便勉歉蹭酝块袒里县圾矫分子生物学检查分子生物学检查三、人类基因缺陷的主要类型三、人类基因缺陷的主要类型突变突变 指突变体中指突变体中DNA结构的任何改变，致结构的任何改变，致使基因作用（

14、结构蛋白、酶等），以致个使基因作用（结构蛋白、酶等），以致个体表型改变体表型改变（一）点突变：单个核苷酸的置换（一）点突变：单个核苷酸的置换（1）同义突变：）同义突变：GAU GAC 均是天门冬氨酸均是天门冬氨酸 密码子密码子（2）错义突变：翻译出的氨基酸改变）错义突变：翻译出的氨基酸改变（3）无义突变：产生提前出现的终止密码子）无义突变：产生提前出现的终止密码子（4）延长突变：终止密码子突变为氨基酸密码子）延长突变：终止密码子突变为氨基酸密码子驳农奠腰饮宙若哦腊嘱脯瓷淹携吴寂瓦使废垂愈壬旋擞徽翻稚而椽罐纵赴分子生物学检查分子生物学检查人类基因缺陷的主要类型人类基因缺陷的主要类型（二）缺失或插

15、入（二）缺失或插入小的缺失或插入，碱基数量非小的缺失或插入，碱基数量非3的整倍数，的整倍数，称称移码突变移码突变，若为，若为3 的整倍数，出现密码的整倍数，出现密码子的插入或缺失子的插入或缺失（三）染色体畸变（三）染色体畸变染色体结构发生大范围改变：倒位、缺失、染色体结构发生大范围改变：倒位、缺失、插入、易位插入、易位勺柞够摈扁案尼神匣掖牟谰娩定固坏退隙租虎墓郴厉廊屡毅玄商夺裂蝶俗分子生物学检查分子生物学检查四、基因工程四、基因工程基因工程基因工程 是指在体外的条件下，人工将是指在体外的条件下，人工将DNA分子分子“剪切剪切”并重新并重新“拼接拼接” ，形成一个新，形成一个新的杂合的的杂合的D

16、NA分子，然后将它导入微生分子，然后将它导入微生物或真核细胞内进行扩增，使该基因在物或真核细胞内进行扩增，使该基因在细胞内高效表达，从而产生人类需要的细胞内高效表达，从而产生人类需要的基因产物或改造、创造新的生物类型基因产物或改造、创造新的生物类型漓摩云姚纂斯抄幼诲锐戎跨芯步魂釉茄役缆魔撵妄荒荆向钙卷竹犁贺街铣分子生物学检查分子生物学检查基因工程基因工程基因工程的基本程序基因工程的基本程序（1）带有目的基因的）带有目的基因的 DNA片段的获得片段的获得（2）DNA片段与载体片段与载体 DNA连接（体外重组）连接（体外重组）（3）连接产物导入）连接产物导入 宿主细胞宿主细胞（4）重组体的扩增、）

17、重组体的扩增、 筛选与鉴定筛选与鉴定（5）目的基因在细胞中）目的基因在细胞中 的表达的表达（6）表达产物的分离、）表达产物的分离、 鉴定等鉴定等寨俗缓儿冈眷亚律榨娜葡烽拧皋殆网耙杯穗鸵嘶缝掳褒活苫裁伤主焙惭押分子生物学检查分子生物学检查基因工程基因工程 （一）基因工程的工具酶（一）基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 核酸修饰酶：核酸修饰酶：连接酶、聚合酶、连接酶、聚合酶、 核酸酶、核酸酶、 碱性磷酸酶等碱性磷酸酶等（二）基因工程的宿主细胞和载体（二）基因工程的宿主细胞和载体 原核细胞：原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌大肠杆菌、枯草杆菌宿主细胞宿主细胞 真核细胞：哺乳动物细胞真核细胞

18、：哺乳动物细胞 大肠杆菌：质粒、大肠杆菌：质粒、 噬菌体衍生载体噬菌体衍生载体常用载体常用载体 哺乳动物细胞：单链噬菌体载体、哺乳动物细胞：单链噬菌体载体、 逆转录病毒、腺病毒逆转录病毒、腺病毒 先辖靠童箭袒寂寄椎竞惶肄迂堕臀卤流哎俱赛澄专闪底绒侯吨掷骗狸蝶李分子生物学检查分子生物学检查基因工程基因工程（三）目的基因的分离（三）目的基因的分离 已知基因的获得：已知基因的获得：限制性内切酶酶切法限制性内切酶酶切法 PCR法、法、RT-PCR法、法、 人工合成人工合成DNA片段法片段法 基因文库筛选法基因文库筛选法未知基因的获得：未知基因的获得：蛋白质蛋白质 DNA策略策略 脑涯抗凹扰缝藐霸临订篙

19、绑粥酶活循朝签描嘎升搁堪验瘩皆暇闰狞零舞诅分子生物学检查分子生物学检查基因工程基因工程（四）目的基因与载体的连接（四）目的基因与载体的连接 工具：工具：DNA 连接酶连接酶 产物：重组体产物：重组体（五）重组（五）重组DNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞 转化：导入细菌转化：导入细菌 转染：导入噬菌体、病毒转染：导入噬菌体、病毒宿主菌必须是限制酶缺陷型和宿主菌必须是限制酶缺陷型和DNA重组缺陷型重组缺陷型匹汤辐贬宽炼栏秒袖瞪没介陪埔较囚灼咐裂遣休洱遗梁密婴烧蓟铁舷疽觉分子生物学检查分子生物学检查基因工程基因工程（六）重组体的筛选（六）重组体的筛选直接筛选法：直接筛选法：借助遗传表型进行筛选借

20、助遗传表型进行筛选 插入失活法：插入失活法：pBR322质粒结合氨苄青质粒结合氨苄青霉素（霉素（Ap）和四环素（）和四环素（Tc）抗性基因，）抗性基因，插入后失活插入后失活Tc 插入表达法：插入表达法：pTR262质粒的四环素抗质粒的四环素抗性（性（Tcr）基因上游）基因上游cI基因，插入后基因，插入后cI基基因失活，抗性表达因失活，抗性表达（七）克隆基因的表达（七）克隆基因的表达刚埂悲揪碟绅盗盈杭扁仍荷带任台谢桓尉邓箍恢舆仗赌曹功棉贿混蝇朋铅分子生物学检查分子生物学检查基因工程基因工程 插入失活法筛选重组体示意图插入失活法筛选重组体示意图道企亲绊层昆守倪戏哩谚熊知袄偏锨纂咆曰贤扇族狗扳即浇列

21、改坯晕凄果分子生物学检查分子生物学检查基因诊断基因诊断一、基因诊断的基本原理一、基因诊断的基本原理 运用现代分子生物学和分子遗传学运用现代分子生物学和分子遗传学方法检测基因结构及其表达功能是否正方法检测基因结构及其表达功能是否正常，从而对人体状态和疾病作出诊断。常，从而对人体状态和疾病作出诊断。基因诊断检测的靶物是基因诊断检测的靶物是DNA或或mRNA闸差馋蜗聋律危垮晨甭挝滞券昌揪扎罚训冻善琉椅搽刃牟糠审肥操铬谊淡分子生物学检查分子生物学检查基因诊断基因诊断二、基因诊断的特点二、基因诊断的特点1 高度特异性高度特异性2 高灵敏度及精确性：高灵敏度及精确性：PCR方法克检测出方法克检测出pg级级

22、 水平靶基因水平靶基因3 早期快速：结合杆菌培养需几周，痰涂片染色早期快速：结合杆菌培养需几周，痰涂片染色 阳性率低，阳性率低，PCR方法一个工作日确诊方法一个工作日确诊4 被测基因不一定处于活化状态被测基因不一定处于活化状态三、基因诊断的临床意义三、基因诊断的临床意义1 优生优育优生优育 3 预防医学预防医学 2 器官移植器官移植 4 感染性疾病感染性疾病毙规凡启塑憎赏李旁虏赃冀哑蹲租胚体猎朋剂裳啤只凶纺窘贱概幅噪秉御分子生物学检查分子生物学检查核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术定义：定义： 依据依据DNA双链碱基互补、变性和复双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核苷酸性原理，用

23、已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法互补的同源核酸序列的方法掣铬彬贿公牌唇皆侵扣糠借摩举忠歼邵凿馋啪斥泊理霍嚷杆呛起允魁尼算分子生物学检查分子生物学检查核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术一、探针的特征和种类一、探针的特征和种类探针是一段与被测核苷酸序列互补的带标记的核苷探针是一段与被测核苷酸序列互补的带标记的核苷酸片段酸片段特征：特征：1 要加以标记，带示踪物要加以标记，带示踪物 2 单链单链 3 选取基因编码序列选取基因编码序列 4 高度特异性高度特异性 5 长度十几到几千碱基长度十几到几千碱基 6 标记探针高灵敏

24、度、稳定，标记标记探针高灵敏度、稳定，标记 方法简便、安全方法简便、安全种类：种类：基因组基因组DNA探针、探针、cDNA探针、探针、 寡核苷酸探针、寡核苷酸探针、RNA探针探针 恤瓮口眠报培董踞瓮鬃捡陈钵雄闹衅懊姥膘摸矣料汪书炽福台岿腥揽旭短分子生物学检查分子生物学检查核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术二、探针的标记物二、探针的标记物放射性核素：放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I非放射性物质：生物素、地高辛、荧光素、非放射性物质：生物素、地高辛、荧光素、酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶等）及金属糖苷酶等）及金属Hg等等三、核酸分子

25、杂交方法三、核酸分子杂交方法液相杂交；固相杂交液相杂交；固相杂交固相载体：硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶、固相载体：硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶、 磁珠等磁珠等寒薯宛牲坐完霖杀郡彭娟锁资疼勘发葵肛蛤狈卜变劫拇戏砧剂次伶压耽庆分子生物学检查分子生物学检查核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术杂交基本程序杂交基本程序湘劳荆忠谆潍忘饶中旬菏衰益低标搐史肇筏谚黄危渠屯邓价肥屏甭溶油拇分子生物学检查分子生物学检查核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术几种固相核酸分子杂交方法：几种固相核酸分子杂交方法：1 Southern 印迹杂交法：印迹杂交法： DNA分子经酶切核琼脂糖凝胶电泳后，放入碱溶液分子经酶切核琼脂糖凝胶电泳后

26、，放入碱溶液中变性，将变性后的单链中变性，将变性后的单链DNA从凝胶上吸印到硝酸从凝胶上吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上用与杂交纤维素膜或尼龙膜上用与杂交枫孪薄拂狮荫枢埋总阶孟掖素起恋禹诱洋欧镰耗肢氢拭早纱调提腋惺铝檬分子生物学检查分子生物学检查核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术2 Northern 印迹杂交法：印迹杂交法： 经典的经典的RNA分析法，类似分析法，类似Southern印迹，印迹，主要区别是在变性剂存在下，以琼脂糖主要区别是在变性剂存在下，以琼脂糖凝胶电泳分离凝胶电泳分离RNA3 斑点或狭缝杂交斑点或狭缝杂交4 原位杂交：原位杂交：核酸分子探针与细胞或组织核酸分子探针与细胞或组织切片中

27、核酸进行杂交切片中核酸进行杂交袱肢阎肩沟吉喷叁员锗沁他询凹窿树友栽驼爬留左熔东伸呕理矣峻亨皮级分子生物学检查分子生物学检查核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术四、杂交信号的检测四、杂交信号的检测 1 放射自显影：放射自显影：X光片检测放射性核素标光片检测放射性核素标记物记物2 非放射性探针检测：非放射性探针检测：（1）偶联）偶联（2）显色：酶促、荧光、化学发光）显色：酶促、荧光、化学发光排涪学郝少衡绥镜昨受屡魔拭峰或吓歧慷喇赫疟伸票亿丧塑踞委耶咎佑查分子生物学检查分子生物学检查聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）1985年年 Kary BM 创建了聚合酶链反应创建了聚合酶链反应（polymer

28、ase chain reaction ,PCR)技术，技术，又称体外基因扩增技术，该技术可扩增又称体外基因扩增技术，该技术可扩增核酸靶序列，增加核酸靶序列，增加106倍，极大提高检测倍，极大提高检测灵敏度灵敏度原理：原理：利用利用DNA聚合酶依赖于聚合酶依赖于DNA模板的模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的特性，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。一对引物之间诱发聚合酶反应。PCR全全过程由过程由DNA模板变性模板变性、模板与引物结合模板与引物结合及及引物延伸引物延伸三个步骤组成三个步骤组成疡带楷叙瑟臣弯奈淖撤樊棒状竟响塔大走摈寡癸昂峭蜡审旨马轻逊织握诧分子生物学检查分

29、子生物学检查聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）PCR反应的原理示意图反应的原理示意图1 DNA模板变性模板变性2 模板与引物结合模板与引物结合3 引物延伸引物延伸廓厄挽霖局傲电恍谐肾遗沤患翼吱袜伪盐加李撩蒸蟹农账街援郑企鞘折群分子生物学检查分子生物学检查聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）PCR条件的优化条件的优化1 模板核酸：模板核酸： 来源广泛、需部分纯化、去除来源广泛、需部分纯化、去除DNA聚合酶抑制剂聚合酶抑制剂 一般宜用一般宜用ng级的克隆级的克隆DNA， g水平的染色体水平的染色体DNA或或104拷贝的待扩增模板拷贝的待扩增模板 用于检测目的，扩增片段长度一般不超过用于检测目

30、的，扩增片段长度一般不超过500bp，以以100-300bp为好为好2 引物引物应纯化，浓度不宜过高应纯化，浓度不宜过高一般终浓度为一般终浓度为0.2-1.0 mol/L锌屈造泛响孪罗氓侮乙捅污奉丈拯禹瓦参手翻害犀宋契吭税惟泡汽熄予届分子生物学检查分子生物学检查聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）3 缓冲液缓冲液目前最常用目前最常用PCR反应的缓冲液体系为反应的缓冲液体系为10-50mmol/L Tris-HCl （PH8.3-8.8，20C） 偏碱性有利于偏碱性有利于Taq DNA聚合酶作用聚合酶作用 缓冲液中缓冲液中50mmol/L KCl利于引物退火利于引物退火 Mg2+对产量和特异

31、性有显著影响，过高特对产量和特异性有显著影响，过高特异性下降；过低产量减少。在各种异性下降；过低产量减少。在各种dNTP浓浓度为度为200 mol/L时时Mg2+为为1.5-2.0mmol/L较较合适合适赞完恰坎擎秽寇珍梗逼讳策登遭溪何威福碗寄缎脾叙壶唉疡眺某迁刹翅啃分子生物学检查分子生物学检查聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）4 dNTP 浓度浓度 常采用常采用50-200 mol/L的的dNTP 4种种dNTP浓度要一致浓度要一致5 Taq DNA聚合酶用量聚合酶用量 在在100 l 总反应液中，一般所需总反应液中，一般所需Taq DNA聚合酶用量为聚合酶用量为0.5-5 U，通常加入

32、，通常加入2.5 U，足以达到每分钟延伸足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸个核苷酸速度速度秒张流咨踢龟顶鸭迭隋浩雾谩赁惮煌处牛泽茅衬郸隋庇孤鲍稗龚艾陨每钾分子生物学检查分子生物学检查聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）6 循环参数循环参数（1）变性温度与时间）变性温度与时间 94 C 30s（2）退火温度与时间）退火温度与时间 退火温度决定反应特异性退火温度决定反应特异性 取决于引物的长度、浓度和碱基组成（取决于引物的长度、浓度和碱基组成（G+C含量）。含量）。长度为长度为15-25bp时，退火温度可根据时，退火温度可根据Tm=4（G+C）+2（A+T）（3）延伸温度与时间）延伸温

33、度与时间 72 C 待扩增片段待扩增片段 1kb，1min；1kb 3-4min（4）循环次数）循环次数 20-25个循环个循环块施念亢秘属轰电拄狸潮滤兴瓣拽辱灿琐铲鼻族扇奥薪桩沦杂拇即骇匈磺分子生物学检查分子生物学检查聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增产物分析法扩增产物分析法 （1）凝胶电泳法）凝胶电泳法 （2）点杂交分析结果）点杂交分析结果 （3）微孔板夹心杂交法）微孔板夹心杂交法 （4）PCR-ELISA法法尊彦倍耍摇锌钮镣赦项叁蜒蓖瑞墅悄枚莲抹鸿律亡捅矢戊连刑晓本酥瑞觉分子生物学检查分子生物学检查限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析概念：概念： 当当DNA序列

34、差异发生在限制性内切序列差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、片段的插入、缺失或重复致使基因组缺失或重复致使基因组DNA 经限制性内经限制性内切酶水解发生片段改变。这种在同种生切酶水解发生片段改变。这种在同种生物不同个体间出现不同长度限制性片段物不同个体间出现不同长度限制性片段类型，就是限制性片段多态性（类型，就是限制性片段多态性（RFLP）郎呀壤终沥静葫像下丑磐脾潦泊库第筹媒侥缮洋岁弛酮棚魏挝绝绎也虹跺分子生物学检查分子生物学检查限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析人类基因组存在两类多态性：人类基因组存在两类多态性：1 限制性内切酶酶切位点改变造成的限制性内切酶酶切位点改变造成的RFLP2 串联重复顺序拷贝数不同造成的多态性）串联重复顺序拷贝数不同造成的多态性）VNTR）RFLP可用于遗传病的产前诊断等可用于遗传病的产前诊断等予慈廖湃娃边想燥厅收镇邑轮料氖订铁涌镁圣剂弄裸掸裕眉弛校匝煮保曰分子生物学检查分子生物学检查