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1、生物化学第十三章 蛋白质的生物合成华东理工大学生物化学精品课程组上海市精品课程系列第十三章 蛋白质的生物合成学习要求理解三种RNA在蛋白质合成中的作用 。了解遗传密码的破译方法。 掌握遗传密码的特性。了解蛋白质的合成过程，了解多聚核糖体的概念。了解多肽链的折叠与加工过程；了解各类蛋白质的传递过程。第十三章 蛋白质的生物合成DNA将其遗传信息转移到mRNA，再由mRNA将这种遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程叫做翻译。蛋白质合成的必要条件：20种氨基酸，mRNA、tRNA、核蛋白体、酶和蛋白因子、无机离子、ATP 、GTP 合成方向：NC端 第十三章 蛋白质的生物合成13.1 信使RNA和遗
2、传密码13.2 翻译相关的生物大分子13.3 蛋白质合成步骤13.1 信使RNA和遗传密码p信使RNA和遗传信息的传递p遗传密码的破译p密码子的特性返回信使RNA和遗传信息的传递蛋白质合成的信息来自于DNA，合成的模板是mRNA。蛋白质的合成是在核糖体上进行的，而遗传信息载体DNA存在于核中，必然有一种中间物来传递DNA上的信息。推测这种中间物极不稳定，在蛋白质合成时产生，合成结束后又分解，半寿期很短。后来科学家用实验证明这种中间物就是mRNA。信使RNA和遗传信息的传递mRNA上的三个核苷酸决定一个氨基酸。1954年,物理学家Gamouv G首先对遗传密码进行探讨。他认为核酸分子中只有四种碱
3、基，显然碱基与氨基酸的关系不是一对一的关系。若两个碱基决定一个氨基酸只能编码16种氨基酸，也是不够的；而三个碱基对一个氨基酸，四个碱基可产生64个密码，足以编码20种氨基酸，所以编码氨基酸的最低碱基数是3，即密码子可能是三联体。 信使RNA和遗传信息的传递1961年，Crick FHC等人用遗传学的方法证明了三联密码子的学说是正确的。在E.coli的T4DNA上的一个基因缺失（或增加）一个或二个核苷酸会造成缺失（或增加）部位以后的全部氨基酸误译。若同时缺失（或增加）三个核苷酸，前后核苷酸表达仍和正常一样。必须假设密码子是三联体才能完满地解释以上这些实验结果。噬菌体T4的“+ +”“-”突变型和
4、它们的表型 类别基因型 表型说明I+或-突变型单个位点II+或-突变型同一类型中的双突变III+或-+或-突变型同一类型中四个或五个突变组合在一起IV+-正常不同类型的两个突变组合在一起V+或+-或-正常同一类型中三个突变组合在一起，或三的倍数突变组合在一起信使RNA和遗传信息的传递mRNA顺序(根 据 氨 基酸推测)移码双突变（回复子）蛋白质顺序(分析结果)AA AGU CCA UCA CUU AAU GCAG 赖 丝 脯 丝 亮 天酰 丙加入GU(ej17)加入G(ej44)AA AGU GUC CAU CAC UUA AUG GCAG赖 丝 缬 组 组 亮 甲硫 丙蛋白质顺序(分析结果)
5、野生型mRNA顺序(根 据 氨 基酸推测) 遗传学上把由于密码移位而造成的突变称为移码突变信使RNA和遗传信息的传递生物化学上的证据：烟草坏死卫星病毒中有一分子RNA可编码外壳蛋白的一个亚基，此RNA由1200个核苷酸组成，而此亚基由400个氨基酸组成，也由此证明三个核苷酸决定一个氨基酸。返回遗传密码的破译遗传密码的概念：mRNA 上的核苷酸顺序与蛋白质中的氨基酸之间的对应关系称为遗传密码。mRNA上每三个连续核苷酸对应一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子，或三联体密码（triplet codons）。1961年，Nirenberg 等人用大肠杆菌的无细胞体系在各种RNA的人工模板下合成多
6、肽，从而推断出各氨基酸的密码子，后来他与Khorana以及霍利分享了1968年诺贝尔生理学奖。以下是三个不同的证明遗传密码是mRNA上3个连续的核苷酸残基构成的实验。 遗传密码的破译遗传密码的破译第一个实验是1961年由美国的M.Nirenberg等人完成的。他首先利用多核苷酸磷酸化酶合成了一条由相同核苷酸组成的多核苷酸链,用它作模板,利用大肠杆菌蛋白提取液和GTP在体外合成蛋白质。发现多聚(U)导致多聚Phe的合成,表明多聚(U)编码多聚Phe；类似的实验表明,多聚(A)编码多聚Lys；多聚(C)编码多聚Pro (上图A)。遗传密码的破译第二个实验（核糖体结合技术）是1964年也是由美国的M
7、.Nirenberg等人完成的。即是用一个人工合成的三核苷酸代替mRNA，在含有核糖体和 14C-氨基酰-tRNA的缓冲系统中，无需酶促核糖体便可以和带有特定氨基酰-tRNA及三核苷酸结合，例如三核苷酸为pUpUpU时，则只有14C-苯丙氨酰-tRNA结合到核体上。用硝酸纤维制成的滤膜过滤，结合有氨基酰-tRNA的核糖体保留在滤膜上，未结合的氨基酰tRNA被洗脱，测定滤膜上的放射性，就可知道和核糖体上的三核苷酸结合的是哪一种氨基酸。该实验对于几种密码编码同一个氨基酸提供了直接的、最好的证据（上图B）。三联体结合试验-核糖体结合技术遗传密码的破译第三个实验是由Jones,Khorana等人完成的
8、。他们利用有机化学和酶法制备了已知的核苷酸重复序列，以此多聚核苷酸作模板，在体外进行蛋白质合成，发现可以生成三种重复的多肽链（上图C）。若从A翻译，则合成出多聚Ile，即AUC对应Ile；若从U翻译，则合成出多聚Ser，即UCA对应Ser；若从C翻译，则合成出多聚His，即CAU对应His。这是因为体外合成是无调控的合成，可以随机地从A、或U、或C翻译，所以有三种重复的多肽链生成。遗传密码的破译返回密码子的特性方向性：密码子的阅读方向是从5 3简并性和摆动性：同一种氨基酸可以由两种或两种以上的密码子所决定，这几种密码子称为同义密码子。密码子的摆动学说（wobble hypothesis）：mR
9、NA的密码子的前两个碱基总是与tRNA上反密码子上的相应碱基形成强有力的Watson-Crick碱基配对，因而提供了主要的编码特异性。通用性：无论是病毒、原核细胞，还是真核细胞，使用的都是同一套氨基酸编码方法。不重叠：密码间无标点，顺着核苷酸5 3的方向一个接一个地阅读。密码子的特性终止密码子（即UAA、UGA和UAG），它们并不代表任何一种氨基酸，所以也称为无意义密码子，在多肽合成中起着终止的作用。 “简并”现象，即同一种氨基酸可以由两种或两种以上的密码子所决定。决定同一氨基酸的密码子称为简并密码子，也称同义密码子。 在密码子中还有一个密码子是“兼职”的，即一个密码子有两种作用，这就是AUG
10、，它既是起始密码子，又是甲硫氨酸的密码子。 蛋白质组分中的胱氨酸、羟脯氨酸则没有相应的密码子，说明这两种氨基酸是在多肽形成之后通过氧化或其他反应生成的。重叠基因在有些生物（主要指病毒）中，同一段基因可以编码几种蛋白质，但这段基因在编码蛋白质时只能分别阅读而并不重叠。例如X-174是一种DNA病毒，同一段基因可以编码两种蛋白质，但各蛋白质使用的阅读框是不同的，因而产生了不同氨基酸顺序的蛋白质。例如：返回13.2 翻译相关的生物大分子与转译相关的生物大分子主要有核糖体和tRNA两种。13.2 翻译相关的生物大分子核糖体是装配蛋白质的机器tRNA的反密码子译出mRNA的密码子tRNA的活化tRNA反
11、密码子与mRNA密码子的识别参与蛋白质合成的蛋白质因子返回核糖体是装配蛋白质的机器核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。核糖体的基本功能：1、是结合mRNA，在mRNA上选择适当的区域开始翻译2、密码子（mRNA）和反密码子（tRNA）的正确配对3、肽键的形成核糖体可游离存在，真核中，也可同内质网结合，形成粗糙的内质网。原核中，与mRNA形成多聚核糖体。多聚核糖体多聚核糖体是在同一条mRNA上同时存在着几个或几十个核糖体，同时进行蛋白质的合成，形成多聚核糖体的结构。核糖体的功能活性部位E.coli的小亚基能单独与mRNA结合成为30s核糖体-mRNA复合
12、体，后者可以与tRNA专一性结合，而大亚基则不能。核糖体上可区分出4个功能部位：A部位：也称受位，主要位于大亚基上，是接受氨酰基-tRNA的部位。P部位：也称肽酰基部位或供位，主要在小亚基上，是肽酰基-tRNA移交新生肽链的部位。E部位：也称退出位点，位于小亚基，是失去氨基酰的tRNA从核糖体退出的地方肽基转移酶部位：肽基转移酶也称肽合成酶，简称T因子，位于大亚基上，其作用是在肽链合成过程中催化氨基酸与氨基酸间形成肽键。GTP酶部位：GTP酶也称转位酶，简称G因子，能分解GTP分子，并将肽酰基-tRNA由A部位移到P部位。核糖体的功能活性部位图示蛋白质返回tRNA的活化:氨基酰-tRNA 合成
13、酶催化tRNA与特定氨基酸结合返回tRNA的活化氨基酸 + ATP + tRNA + H2O 氨基酰-tRNA + AMP + PPi每一种氨基酸至少有一种对应的氨基酰-tRNA 合成酶。它既催化氨基酸与ATP的作用，也催化氨基酰基转移到tRNA。氨基酰-tRNA 合成酶具有高度的专一性。 每一种氨基酰-tRNA 合成酶只能识别一种相应的tRNA。tRNA 分子能接受相应的氨基酸，决定于它特有的碱基顺序，而这种碱基顺序能够被氨基酰-tRNA 合成酶所识别。返回tRNA反密码子与mRNA密码子的识别aa-tRNA是在蛋白质因子的作用下，通过TC环与核糖体5S rRNA（真核细胞为5.8S rRN
14、A）分子的互补关系而进入核糖体的。但某一特定aa-tRNA的进入与否取决于aa-tRNA的反密码子与mRNA密码子是否能相互识别。反密码子与密码子的配对并不十分严格，由于同一种氨基酸与不同tRNA结合的现象，所以只是密码子的前两个碱基必需准确配对，而第三个碱基可以错配（摇摆），这就是摇摆学说所要说明的现象。如果编码蛋白质的基因发生了点突变，tRNA也随着发生突变以校正上述基因的突变，以合成一条正常的多肽链，这种tRNA叫做校正tRNA，它的作用机制也是以密码子与反密码子间不十分严密的配对为基础的。返回参与蛋白质合成的蛋白质因子蛋白质的合成过程可分为起始、延伸和终止三个过程，每个过程都有许多蛋白
15、质因子参加。起始因子：蛋白质合成的起始过程是形成核糖体mRNAtRNA三元复合物的过程，必须在蛋白因子的帮助下进行。与起始复合物形成有关的所有蛋白质因子统称为起始因子。延伸因子：蛋白质合成的延伸过程包括aa-tRNA进入核糖体、肽链形成和移位等过程。在真核细跑中这一过程需要EF-1和EF-2等延伸因子的作用。释放因子：当mRNA分子上密码子阅读进入终止密码（UAA, UAG, UGA）时，aa-tRNA不再与核糖体结合，此时释放因子与终止密码子结合，阻止mRNA的进一步阅读。返回13.3 蛋白质合成步骤13.3 蛋白质合成步骤肽链合成的起始肽链合成的延伸肽链合成的终止与释放合成肽链的输送与加工
16、蛋白质分子的折叠与分子伴侣抑制蛋白质生物合成的抗生素返回肽链合成的起始决定甲硫氨酸和决定缬氨酸的密码子就是起始密码子，即AUG和GUG。起始密码的识别：核糖体小亚基上的16S rRNA和mRNA的SD序列（位于起始位点上游413个富含嘌呤碱基的核苷酸）结合。N-甲酰甲硫氨酸-tRNA的活化形成起始复合物（E.coli）。fmet- tRNA、mRNA、30S亚基三者结合时还需要三种蛋白质因子(IF1、IF2、IF3）和提供能量的GTP参与。一旦70S核糖体-mRNA-fmet-tRNA复合体形成，则fmet-tRNA 占据P位，空出A位准备接受一个氨酰tRNA ，起始即告完成。肽链合成的起始返
17、回肽链合成的延伸结合（或称进位）对应于mRNA上第二个密码子的氨基酰-tRNA（aa-tRNA）进入A位与核糖体结合，这是一个需能的反应，GTP是直接能源。转肽结合过程一旦完成立即进行转肽。通过肽基转移酶的催化使P位上的fmet- tRNA（肽基tRNA）转到A位上的aa-tRNA的游离氨基上，形成肽键，并释放出原来在P位上的tRNA。这个反应不需能量。肽基转移酶是50S核糖体亚基上的一个蛋白质组分。移位核糖体从mRNA的5向3方向移动一个三联体的距离，于是携带着肽基的tRNA连同mRNA从核糖体的A位移到P位：这个过程称为移位，由移位酶（或称G因子）催化，并须有供能的GTP参与。返回识别mR
18、NA的终止密码子，水解所合成肽链与tRNA间的酯键，释放肽链R1识别UAA、UAGR2识别UAA、UGAR3影响肽链的释放速度肽链合成的终止与释放返回合成肽链的输送与加工合成肽链的输送：多肽输送信号由新合成多肽N端的信号肽所控制，而真核细胞中，识别信号肽的机构是一个称为信号识别体的核蛋白体（SRP）来完成。它具有识别信号肽，并与核糖体相结合暂停新生肽延伸的功能。一旦刚合成的多肽找到安全去向（越膜）后，SRP就脱离核糖体，暂停的肽链就可以继续完成合成过程。合成肽链的输送与加工合成肽链的加工：许多刚合成好的多肽，并不是最终产物，须经一系列加工过程，才能成为有功能的蛋白多肽。2、切除新生肽中不必需的
19、肽段5、泛素化作用与不正常多肽的处理4、多肽中氨基酸侧链的修饰 3、蛋白质中二硫键的形成1、新生多肽N端氨基酸的除去(Met或fMet） 6、蛋白质分子的剪接加工返回切除新生肽中不必要的肽段有的蛋白质，如循环系统的蛋白酶或一些功能蛋白等，其刚合成好的多肽，除切去信号肽外，还需切去过长的末端肽段或内部的连接肽等，才能成熟为有功能的蛋白质或酶蛋白。如：蛋白酶，胰岛素等返回蛋白质中二硫键的形成在遗传密码中，人们尚未找到过胱氨酸的密码子，而不少蛋白质或酶却会有一个或若干个胱氨酸二硫键，这对形成特定的蛋白质空间结构十分必需。经研究分析，这是在蛋白质合成后，其空间位置相邻的两个一组半胱氨酸残基被氧化而生成
20、二硫键。返回多肽中氨基酸侧链的修饰许多蛋白质中氨基酸残基的侧链基因需经进一步共价修饰，才能成熟为功能蛋白。如羟基化、乙酰化、甲基化、磷酸化、糖基化等。返回泛素化作用与不正常多肽的处理泛素：由序列高度保守的76个氨基酸组成。其功能之一是可以协助机体，把细胞中合成的不正常蛋白或已发生变质的缺陷蛋白多肽识别和检出，并将它送往处理场所进行降解。这种处理是通过将不正常多肽进行泛素化作用而实现的。 返回蛋白质分子的剪接加工蛋白质剪接这一过程包括两个肽键断裂以切除1个肽段，再通过形成新的肽键将两个肽段连接完整的多肽链。上述过程是自发进行的自我剪接，不依赖于酶。被切除的片段往往位于折叠蛋白分子的表面。 蛋白质
21、剪接的发现具有重要意义，它使人们对中心法则有了更新的了解，即成熟的蛋白序列不一定和成熟的mRNA序列共线性。 返回蛋白质分子的折叠与分子伴侣Lasky于1978年首先提出分子伴侣（mulecular chaperone）的概念，这是一类在细胞内能帮助新生肽链正确折叠与装配组装成为成熟蛋白质，但其本身并不构成被介导的蛋白质组成部分的一类蛋白因子，在原核生物和真核生物中广泛存在。返回抑制蛋白质生物合成的抗生素有很多抗生素和毒素可以抑制原核或真核生物的蛋白合成，它们的抑制机理各不相同。例如抗生素嘌呤霉素（puromycin）的结构非常类似于氨酰-tRNA的3末端的结构，可以进入核糖体的A位。肽酰转移
22、酶催化新生成的多肽转移至嘌呤霉素的游离的氨基上（下图）。由于肽酰嘌呤霉素在A位处的结合弱，很快就从核糖体上解离，因此就可终止蛋白质的合成。抑制蛋白质生物合成的抗生素抑制蛋白质生物合成的抗生素四环素（Tetracycline）和氯霉素（Chliramphenicol）是两个能特异抑制细菌翻译的抗生素。四环素可以和原核生物核糖体的30S亚基结合，阻止氨酰-tRNA进入A位。氯霉素可以与核糖体的50S亚基相互作用，抑制肽酰转移酶。抑制蛋白质生物合成的抗生素链霉素、卡那霉素、新霉素等，主要抑制革兰氏阴性细菌蛋白质合成的三个阶段：抑制起始复合物的形成，使氨基酰tRNA从复合物中脱落；在肽链延伸阶段，使氨基酰tRNA与mRNA错配；在终止阶段，阻碍终止因了与核蛋白体结合，使已合成的多肽链无法释放，而且还抑制70S核糖体的介离。 抑制蛋白质生物合成的抗生素由白喉杆菌所产生的白喉霉素（Diphtheria toxin）是真核细胞蛋白质合成抑制剂。它对真核生物的延长因子-2（EF-2）起共价修饰作用，从而使EF-2失活，它的催化效率很高，只需微量就能有效地抑制细胞整个蛋白质合成，而导致细胞死亡。因而白喉毒素是已知的最有潜力的毒素。蓖麻毒蛋白（Ricin）是从蓖麻中分离出来的，其作用模式是通过切断N苷键除去腺嘌呤碱基使真核生物的28S rRNA失活，导致翻译终止。返回
