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1、双歧杆菌的检测与鉴定食科0503唐逸甜朱凯艳Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望特征性酶特征性酶 F6PPK鉴定法鉴定法聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)方法方法 分离培养分离培养生化法生化法气相色谱法气相色谱法离子色谱法离子色谱法DNA探针杂交法探针杂交法 双歧杆菌是目前较常用的益生菌之一，其特征性双歧杆菌是目前较常用的益生菌之一，其特征性酶的识别对于属及种的鉴定具有重要意义。果糖酶的识别对于属及种的鉴定具有重要意义。果糖-6-磷磷酸盐磷酸酮酶酸盐磷酸酮酶 (Fru
2、ctose-6-phosphate phosphoketolase,F6PPK) 在双歧杆菌己糖代谢中起关在双歧杆菌己糖代谢中起关键作用，它裂解果糖键作用，它裂解果糖-6-磷酸，使双歧杆菌发酵糖类的磷酸，使双歧杆菌发酵糖类的终产物乙酸和乳酸呈终产物乙酸和乳酸呈3:2的比例。因此检测出的比例。因此检测出F6PPK可可作为鉴定双歧杆菌属细菌的重要特征之一。作为鉴定双歧杆菌属细菌的重要特征之一。 菌体细胞经超声波破碎后，菌体细胞经超声波破碎后，F6PPK游离出来，使游离出来，使果糖果糖-6-磷酸盐最终生成乙酞磷酸盐，乙酞磷酸盐与磷酸盐最终生成乙酞磷酸盐，乙酞磷酸盐与FeCl3,结合形成它的氧酸盐，显
3、示红褐色或红紫色而结合形成它的氧酸盐，显示红褐色或红紫色而被检测出来。被检测出来。 因此经以上程序测定如显色则因此经以上程序测定如显色则F6PPK为阳性，否为阳性，否则为阴性。则为阴性。特征性酶特征性酶 F6PPK F6PPK 鉴定法鉴定法1.将从样品中分离出的菌种培养于厌氧液体改良MRS培养基中37生长24 h。2.将菌液4400 rpm离心10 min,收集菌体，缓冲液洗涤2次，最后溶于约4 mL缓冲液中，制成细菌悬液。3.用超声波粉碎仪，400 W条件下；每处理5 s、间隔5 s,超声粉碎8 min，至菌体溶液呈半透明。4.破碎后，取0.5 mL于离心管中，加试剂和各125 L,37保温
4、30 min。5.加试剂 0.750mL,室温10 min。6.加试剂和 各500 L,室温5 min。7.加试剂 500 L,显色。红褐色或红紫色为阳性，黄色为阴性。试剂：0.5 g/100 mL FeCl36H2O溶于0.1 MHCl。检测步骤：检测步骤：利用果糖-6-磷酸盐对从生物制剂中分离得到的菌种进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)的测定，初步确定菌种是否为双歧杆菌属。F6PPK测定的操作如下：缓冲液：现用现配。取0.05 M Na2HPO4 31.5 mL 和0.05 M NaH2PO4 68.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-盐酸盐。试剂：6 mg/mL氟化钠加10 mg/mL碘乙酸钠。试剂：果糖-6-磷酸盐80 mg/mL水溶液。试剂：现用现配。盐酸羟胺139 mg/mL。用氢氧化钠中和至pH6.5。试剂：三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL。试剂：4 M HCl。谢谢各位谢谢各位
